Штамм гриба asperdillus oryzal-продуцент амилолитических и протеолитических ферментов

 

Изобретение относится к получению ферментных препаратов и может быть применено в микробиологической промьшшенности при получении иологически активных соединений, в сельском- Хозяйстве, кожевенной промьниленности. Целью предлагаемого изобретения является получение штамма , обладающего более высокой активностью и обеспечивающего повышение выхода целевого продукта с заданным составом. Штамм получен из музейного путем трех этапов селекции с применением тепловой обработки , обработки ультрафиолетовым излучением , а также нитрозоэтилмочевиной. Применение в качестве продуцента Aspergillus oryzae ВКПМ F-369

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (я) 4 С 12 N 9/62, 1/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4163587/31-13; 4163344/31-13 (22) 19.12.86 (46) 30.11.88. Бюл. N 44 (71) МГУ им.M.Â.ËoìîíîñoBà (72) В.А.Хамидулин, Н.С.Егоров, Н..С.Ландау и И.Н.Войнарский ". (53) 577.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 1251532, кл. С 12 N 9/54 1985.

Авторское свидетельство СССР № 1272697, кл. С 12 N 9/00, 1985 °

Авторское свидетельство СССР № 1075737, кл. С 12 С 7/04, 1982. (54) lllTAMM ГРИБА АБРЕКСП.|Л18 (ИУЕАЕПРОДУЦЕНТ ЛМИЛОЛИТИЧЕСКИХ И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ (57) Изобретение относится к получению ферментных препаратов и может быть применено в микробиологической промышленности при получении био-

;ЯМ„„1440922 А 1 логически активных соединений, в сельском хозяйстве, кожевенной промышленности. Целью предлагаемого изобретения является получение штамма, обладающего более высокой активностью и обеспечивающего повышение выхода целевого продукта с заданным составом. Штамм получен из музейного путем трех этапов селекции с применением тепловой обработки, обработки ультрафиолетовым излучением, а также нитрозоэтилмочевиной. Применение в качестве продуцента Aspergillus oryzae ВКПИ F-369 (824-32) позволяет повысить ферментативную активность амилопротооризина: амилолитическую в 3 раза, протеолитическую в 3,8 раза, а также получить ферментативный препарат заданного соотношения ферментативных активностей. 1 табл.

1440922

50

Изобретение относится к ферментной отрасли промышпенности и касается нового штамма, внеклеточные ферменты которого используются для деструкции природных биополимеров при получении сахаров, аминокислот, ферментов.

Цель изобретения - получение штам" ма, обладающего более высокой ак- 10 тивностью и обеспечивающего повьппение выхода целевого продукта с заданным составом.

Штамм Aspergillus oryzae BKIIM

F-369 получен из музейного штамма 15

Aspergillus oryzae 251-90 ЛС и 123

ВНИИ пищевой биотехнологии путем трех этапов селекции с применением тепловой обработки, обработки ультрафиолетовым излучением, а также 20 нитрозоэтклмочевиной (НЭМ). Амилолитическая активность определялась по гидролизу крахмала, протеолитическая активность — по гидролизу гемоглобина модифицированным методом Ансона.

Активность ферментов в культуральной жидкости на пятые сутки роста составляет по амнлазе 33,5 ед/мп, а по протеазе 33,8 мг тирозина/мл, 30 что в три раза превосходит известный.

Морфологические признаки. Мицелий септирован, колонии концентри ческие конидиеносцы хорошо диффе ренцированы, формируются -к 35-36 ч роста. На концах гиф под микроскопом хорошо виден эксудат в виде мелких капель прозрачной жидкости. Конидии круглые 4,5-6,3 мкм, в массе 40 зеленые. Культуральные признаки.

Рост на сусло-агаре при 30 С на седьо .мые сутки роста: диаметр колоний

45-50 мм, рост концентрический, складчатость радиально-концентричес- 45 кая. Поверхность пушистая. Спороношение по всей поверхности эа исключением увкого края. Мицелий белый, споры в массе зеленые. Пигментация среды не выражена.

Рост на среде Чапека-Докса при

30 С на седьмые сутки: диаметр колоний 30-35 мм, рост концентрический.

Складчатость хорошо выражена, радиально-концентрическая. Поверхность пушистая. Спороношение дифференцировано, интенсивное в центре колонии и слабо выражено к периферии. Мицелий белый, споры в массе желто-эеленые. Пигментация среды не выражена

Центр. колонии приподнят, края колонии находятся ниже уровня среды.

Среду под собой гидролизует с образованием полости (среда отстает от стеклянной поверхности чашки).

Рост на среде Ваксмана с пептоном и глюкозой при ЗО.С на седьмые сутки: диаметр колонии 35-45 мм, рост концентрический, складчатость радиальная. Поверхность бархатистая.

Спороношение дифференцировано: интенсивное в центре и слабо выражено к периферии. Мицелий белый, споры в массе светло-зеленые. Пигментация в точке интенсивного спорообразования слегка красноватая. Края колонии. находятся на уровне с поверхностью,среды.

Физиолого-биохимические признаки.

Ассимилирует глюкозу, галактозу, лактозу, мальтозу, ксклозу, сахарозу, глицерин. Гидролизует крахмал, а также белки. Используют аммоннйную. нитратную и белковую формы азота.

Штамм интенсивно продуцирует

oL -амклазу и:комплекс протеаз на среде с ячменным суслом, соевой мукой и,КН РО при 28-30 С на пятые сутки роста. Активность ферментов в культуральной жидкости, при этом составляет по < -амилазе 33,5 ед/мл, по протеазе 33,8 мг тирозина/мл.

Для выращивания мицелиального посевного материала берут. среду следукщего состава, вес.X. ячменная мука 8-10, соевая мука 0,5-1,0, КН РО 0,5-1,0, вода водопроводная остальное. В среду вносят продуцент в виде суспензки спор (конидий), полученной известным способом и инкуо

) бируют при 28-30 С в течение 43-44 ч.

После чего готовый посевной материал переносят на среду следующего состава, вес.Х: ячменная мука 14-20, соевая мука 0,5-3,0, КН РО4 0,5-1,0, вода водопроводная остальное и.ино

> кубируют при 28-30 С в течение 4-5 сут.

В конце инкубации измеряют ферментативные активности, (амилолитическую и протолитическую) в культуральной жидкости.

Сравнительные результаты по известному и предлагаемому изобретениям сведены в таблицу.

Из, таблицы видно, что использование продуцента А.oryzae 824-32 поэ1440922

25 воляет увеличить выход целевого продукта в три раза, если у известного активности составляли по АС=11,0 и по ПС-8,6 ед/мл, то в предлагаемом способе АС-33,5 и ПС- 33,8 ед/ил.

Кроме того, изменение концентрации ячменной муки приводит к преимущественному синтезу либо амилолитических, либо протеологических ферментов, что используется при направленном получении конкретного ферментного препарата.

П р и и е р 1. При подготовке обеих. сред сжижение проводят добавле 16 нием 0,5 ед. ос -амилазы на 1 г крахмала . среды.

Выращивание гриба А.oryzae 82432 в виде мицелиального посевного материала проводят на среде, вес. : 2О ячменная мука 8, соевая мука 0 5

КН РО 0,5, вода водопроводная остальное, и инкубируют при 28 С в течение 43 ч.

Готовый мицелиальный посевной препарат вносят в среду следующего состава, вес. : ячменная мука 14, соевая мука 0,5, КН Р04 0,5, вода водопроводная остальное, и инкубио, руют при 28 С в течение 4 сут. 30

В конце выращивания ферментативные активности составляют по АС=20, 7, . по ПС=17,3 ед/ил.

Пример 2. При подготовке обеих сред ожижение проводят дою 35 бавлениеи 1,0 ед.оС -аиилазы на 1 г крахмала среды.

Выращивание гриба А.oryzae 824-32 в виде мицелиального посевного материала проводят в среде, вес.%: яч- 4О менная мука 10 соевая мука 1 КН, Р04 вода водопроводная - остальное, и инкубируют при 30 С в течение 44 ч.

Готовый мипелиальный посевной ма.териал вносят в среду следующего сос- 4

45 тава, вес.X: ячменная мука 20, соевая мука 3, КН РО t, вода водопроводная остальное, и инкубируют в течение 5 сут при 30 С.

В конце выращивания .*ерментативные активности составляют по АС=19,9 ° по ПС=22,3 ед/мл.

Пример 3. При подготовке обеих сред ожижением проводят добавлением 0 5 ед.оС-амилазы на 1 г крахмала среды.

Выращивание гриба А.oryzae 824-32 в виде мицелиального посевного мате риала проводят в среде, вес.Х: ячменная мука 9, соевая мука 1,5, КН РОо О, 5, вода водопроводная остальное, и инкубируют в течение 44 ч при 30 С.

Готовый мицелиальный посевной материал вносят в среду следующего состава, вес.Х: ячменная мука 18, соевая мука 1,5, КН P04 0 5, вода водопроводная остальное, и инкубируют при 30 С в течение 5 сут.

В конце выращивания .фериентативные активности составляют по АС+33,5, по ПС-33,8 ед/ил.

Пример 4. Выращивание осуществляется аналогично примеру 1, отличие состоит в том, что при подготовке обеих сред ожюкение проводят добавлением 0,4 ед. oL-.аиилазы на 1 г крахмала среды.

Выращивание гриба А.oryzae 824-32 в виде мицелиального посевного материала проводят на среде, вес. : ячменная мука 7 ° 5, соевая мука 0,3, КН РО 0,8, вода водопроводная осо тальное, и инкубируют при 27 С в течение 41 часа.

Готовый иицелиальный посевной материал вносят в среду следующего состава, вес. : ячменная мука 12, соевая мука 0 ° 4, КН РО 0,4, вода водопроводная остальное, и инкубируют при 27 С в течение 4 сут.

В конце выращивания ферментативные активности составляют по АС-20,0 . ,по ПС-19,3 ед/мп.

Пример 5. Выращивание осуществляется аналогично примеру 2, отличие состоит в том, что при подготовке обеих сред проводят ожижение добавлением 1, 1 ед. оа -амилазы на 1 r крахмала среды, Выращивание гриба А.oryzae 824-32 в виде мицелиального посевного материала проводят на среде, вес.Х: ячменная мука 12, соевая мука 1,6, КН Ð04 1, 1, вода водопроводная остальное и инкубируют в течение 45 ч о при 31 С.

Готовый мицелиальный посевной материал вносят в среду следующего состава, вес.Х: ячменная мука 21, соевая мука 3, 1, КН Р04 1,6, вода водопроводная .остальное, и инкубируют (а в течение 5,3 сут при 31 С.

В конце выращивания фериентатив- ные активности составляют по АС-8,2, по ПС=41,7 ед/ил.

1440922

Использование предлагаемого изобретения по сравнению с известным по. вьппает выход целевого продукта, с заданным соотнощением ферментов, при этоМ способ прост в осуществлении.

Формула изобретення

Штамм

Параметры

А.oryzae

824-32.oryzae

51-90

11,0:8,6

11,0:8,6

20%

11,0:8,6 . То же

18%

7,5%

21%

То же

Необходимость повторных операций для ,получения ферментного препарата

2-3

Составитель И.Привалова

Техред А.Кравчук Корректор Л.Патай

Редактор M.Íåäîëóæåíêo

Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 6143/29

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Выход целевого продукта при изменении концентрации ячменной муки АС:ПС ед/мл

14%

Штамм гриба Aspergillus oryzae

5 BIGIM F-369 — продуцент амилолитичес ких и протеолитических ферментов. !

20,7: 17,3

19,9:22,3

33,5:33,8

20,0Ф10,3

8,2:41,7