Способ конструирования плазмидного вектора рнс314 или рнс312, или рнс624

 

Изобретение относится к биотехнологии , генной инженерии, а более конкретно к способу получения плазмидных векторов. Целью изобретения является конструирование плазмидных векторов на основе pBR322, которые обладают большим числом копий на клетку, чем известные и широко не- . пользуемые векторы. Плазмидные векторы рНС314, рНС312 и рНС624 обладают большим числом копий за. счет того , что в гене, ответственном за продуцирование репрессора плазмидной репликации, получена мутация типа замены в положении 3074 участ|):а гена. (У)

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

COЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

gg 4 С 12 Н 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3792252/28-13 (22) 14.09.84 (31) 3212/83 (32) 16.09.83 (33) HU (46) 07.12.88. Бюл. Р 45 (71) Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр

PT (HU) (72) Имре Борош, Пал Венетианер и Дьердь Пошли (НП) (53) 575 .224.2:577 ° 2(048К088.8) (56) Nesvera S., Hochannova S. 3sola

tion and characterization of, hingh« сору number mutant of plasmid PGK.

Polis microbiol. 1983, v. 28, Ф 5, р. 345-352.

„Я0ÄÄ 1443806 А 3 (54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПЛАЗМИДНОГО ВЕКТОРА рНС314 ИЛИ рНС312, ИЛИ рНС624

Ъ (57) Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, а более конкретно к способу получения плазмндных векторов. Целью изобретения является конструирование плаэмидных векторов на основе pBR322, которые обладают большим числом копий на клетку, чем известные и широко используемые векторы. Плаэмидные векторы рНС314, рНС312 и рНС624 обладают большим числом копий эа счет то го, что в гене, ответственном за продуцирование репрессора плазмидной репликации, получена мутация типа замены G T в положении 3074 участка гена.

1443806

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, а более конкретно к способу получения плазмидных векторов.

Цель изобретения — конструирование плазмидных векторов на основе

pBR322, которые обладают большим числом копий на клетку нежели извес:ные и широко используемые векторы.

Плазмидные векторы рНС314, рНС312 и рНС624 обладают большим числом копий за счет того, что в гене, ответственном эа продуцирование репрессора плазмидной репликации, по" лучена мутация.

11 р и м е р 1. Плазмидную рНС1 расщепляют рестрикционными эндонуклеазами EcoR1 и Pru 11, а затем од, нотяжевые концы дополняют субфраг- 20 ментом Кленова фермента ДНК полимеразы I в присутствии dTP субстратов.

У полученных таким образом молекул

ДНК с тупыми концами восстанавливают кольцевую структуру ДНК ли- 25 газой Т и трансформируют в НВ101 клетки. Иэ колоний, растущих на содержащей ампициллин среде, выделяют плазмидную ДНК и ДНК-образцы, которые анализируют с помощью агарозного 30 и полиакриламидного гельэлектрофореза после переваривания с рестрикционными эндонуклеазамиЕсоК1, Pvu 1.1 и BspP1. На основании полного молекулярного веса плазмиды (2,3 kb) и размера фрагментов, полученных при расщеплении BspP1 (587; 457; 434;

267; 240; 80 Ьр) устанавливают, что плазмида рНС81 содержит участок между нуклеотидами 2069 и 2 плазмиды 40

pBR322 с мутацией, ответственной за высокое число копий.

Выделяют фрагмент ДНК размером

/ 1030 вр, полученный расщеплением рНС81 рестрикционными эндонуклеазами 45

Pst 1 u Tag 1, фрагмент ДНК размером

780 вр, полученный расщеплением

pBR322 ферментами Pst и С1а1, и фрагмент ДНК размером 218 вр. полученный расщеплением рВК329 ферментом

Tag. 1. Три полученных фрагмента ДНК смешивают в эквийолярном соотношении, сшивают ДНК лигазой, а клетки НВ101 трансформируют лигатом. Из отдельных клонов, выращенных на содержащей ампициллин среде, выделяют плазмидную ДНК. Эти плазмиды обладают фенотипом большого числа копий. Расщепляя плазмидные ДНК рестрикционными эндонуклеазами, устанавливают, что они были получены путем связывания трех хорошо различных фрагментов различного происхождения ° В этих плазмидах проксимальная часть Л—

1 лактамазного гена была получена из

pBR322 участок ответственный за репликацию — иэ плазмиды pBR322, а фрагмент, выделенный из рНС81, содержал кроме дистальной части лактамазного гена также мутацию, приводящую к высокому числу копий.

Следовательно, мутация образовыва ется между нуклеотидами 2573 (Tag1) и 3612 (Pst1) ДНК плазмиды pBR322.

Опеределяют нуклеотидную последовательность этого участка и сравнивают с известной последовательностью

pBR322. В результате этого сравнения устанавливают замену в положении 4074 гена.

Как результат образовавшейся точечной мутации окончание транскрип--ции репрессорной РНК нарушается и происходит синтез РНК большего молекулярного веса, которая уже не может более функционировать как репрессор репликации. Окончание репрессорной функции приводит к большому числу копий. За счет этой спонтанной точечной мутации число копий плазмиды в клетке можно повысить в

20-30 раз (примерно 1000) по отношению к исходному значению. За счет этой точечной мутации число копий любой плазмиды с тем же участком репликации, что и pBR322, можно существенно увеличить.

E..coli НВ101 клетки трансформируют плазмидой рНС314. Выделяют плазмиду ДНК и анализируют с помощью гельэлектрофореза после расщепления

EcoR1 и Pst1 рестрикционными эндонуклеазами. Для дальнейших исследований отбирают плазмиду, которую можно расщепить на фрагменты 2300 и 110 вр с помощью EcoR1 и на фрагменты 1580 и 820 вр с.помощью Pst1 (рНС314).

Плазмиду расщепляют рестрикционной эндонуклеазой ВашН1 и полученную линейную молекулу частично расщепляют ферментом Hinf1. Фрагменты ДНК размером 2010. вр выделяют в 1,2Х-ном агарозном геле, Концы молекулы„ содержащей однотяжевые участки, пслу...=--- ные при расщеплении ферментами ВашН1 и Hinf1, превращают в тупые концы субфрагменз

144380 том Кленова с помощью ДНК полимеразы I,а затем рециркуляризируют

Т индуцированной полинуклеотидной лигазой. Легированные ДНК трансфор5 мируют в клетки НВ101 и выделяют един:нные солонии. Получают плазмиду

ðÍÑ312, которую нельзя расщепить эндонуклеазой BamH1, но можно линеаризировать EcoR1 и получить фрагменты 10

1495 вр и )1э вр после расщепления

Hinf1. Для получения вектора с большим числом копий подходящего для клонирования ДНК фрагментов с тупыми концами, плазмиду рНС312 расщепля- 15 ют рестрикционными эндонуклеазами

EcoR1 и Hinfl11, а затем из агарозного геля выделяют фрагмент 1980 вр.

Этот фрагмент смешивают с ДНК плазмицы ПАИ7, расщепленной ферментами 2р

EcoR1 и Elinf111, и связывают молекулы полинуклеотидной лигазой. Клетки

E .coli НВ101 трансформируют легированной плазмидой и из единичных бактериальных колоний, устойчивых к 25

Amp, выделяют плазмидную ДНК. Плазмидная ДНК, полученная таким образом (PHC624), не имеет С1а1 сайта, но в отличие от плазмидной рНС312 ее можно разрезать рестрикционными эн- 3р донуклеазами Бша1, Sa11 и BamH1.

H p и м е р 2. Для определения относительного числа копий рНС плазмид выращивают E,coli НВ101 культуры, содержащие плаэмиды различных размеров, полученные из рекомбинантных

pBR322 и производных с большим числом копий 1 зго же размера до достижения идентичной плотности клеток. Из идентичных количеств полученных сус- qo пензий без амплификации выделяют плазмидную ДНК. Образцы, взятые из препаратов ДНК, подвергают электрофоретической обработке на агарозном геле в 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 45

40- и 50-кратном разбавлении соответственно ° Плазмиды с большим количеством копий и их пары с нормальным числом копий (того же молекулярного веса) исследуют одновременно ° Pe- 50 зультаты экспериментов показывают, что число копий рНС плазмид в 20—

30 раз больше, чем число соответствующих pEIBR322 производных с "нор« мальным числом копий 55

П р и и е р 3. Абсолютное число копий рНС глазмид определяют путем мечения ДНК клеток, содержащих плазмиды in vivo и измерения отношения радиоактивности в выделенных плазмидных ДНК и в хромосомных ДНК. Этим способом число копий плазмид одинакового размера с рНС314 (ИВ 1,6» 10 д) составляло около 1000 на клетку (мол. вес хромосомы 2 10 д)

От 60 до 657. полного содержания ДНК клетки составляет плазмидная ДНК.

Для мечения ДНК in vivo клетки, содержащие плазмиды, культивируют на И9 культуральной среде, дополненной следующими компонентами: 0,5 казаминовой кислоты (Difco), 0,57. глюкозы; 1 мкг/мл витамина В,;

2 ммоль HgSO, 2 мкг/мл тнмидина, 250 мкг/мл аденозина и 0,4 мВ8/мл (Н-тимидина) 888 Bg/ìoëü (Хемапол, Прага) .

Клетки, содержащие плазмиды, расщепляют. Хромосомные и плазмидные

ДНК отделяют друг от друга градиентным центрифугированием с этидиумбромид(цезий)хлоридом в равновесной плотности клеточного лизата, полученного из бактериальной суспензии, выросшей на 2 мл/ОД, = 4 — 5 (45000 об/мин, 40 ч, 20 С).

Плазмидные векторы рНС312, рНС314 и рНС624 07.03.84 г. депонированы в Национальной Коллекции Иикроорганизмов (ОК1, Венгрия) под кодом

Nl 00279, 00280 и 00281 соответственно.

Формула изобретения

Способ конструирования плазмидного вектора рНС314 или рНС312, или рНС624, заключающийся в том, что плаэмидную ДНК рНС1 расщепляют ретрикционными эндонуклеазами Есор? и

PruII, затупляют концы с помощью субфрагмента Кленова ДНК полимеразы Е в присутствии dNTP, âoñcòàíàâливают кольцевую структуру ДНК с помощью ДНК лигазы Т и трансформи— руют штамм бактерий Escherichia coli

НВ101, из amp клонов выделяют плазмиду рНС81, которая содержит точечную мутацию G T в положении 3074 участка гена, кодирующего репрессорную ДНК, далее ДНК плазмиды рН081 обрабатывают эндонуклеазой EcoRI, дефосфорилируют щелочной фосфатазой и сшивают с EcoRI фрагментом плазмиды HVX, полученной рекомбинантной

ДНК трансформируют штамм Е.coli

НВ101, отбирают amp колонии, из них

Составитель Н. Кузенкова

Техред.Л. Олийнык Корректор С.Шекмар !

Редактор И.Дербак

Заказ 6401/58

Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 14438 выделяют плазмидкую ДНК, расщепляют

Е .coRI u PstI эндонуклеазами и отбирают рНС314, которая может быть расщеплена на фрагменты размером 2300 > и 100 kо и íà PstI фрагменты размером

1580 и 820 kb, далее рекомбинантную плазмидную ДНК рСН314 в случае конструирования рНС312 расщепляют Sam

Н1 эндонуклеазой, затем полученную 10 линейную ДНК частично гидролизуют

HinfI эндонуклеазой, выделяют фрагмент размером 2010 kb, восстанавливают кольцевую структуру ДНК, транс"формируют штамм Е.coli 88101 данной

: рекомбинантной ДНК и отбирают рекомбинантную плазмидную ДНК рНС312 со06 6 держащую E.coRI u Hinfl сайты рестрикции и образующую фрагменты размером 1495 и 5 16 kb после расщепления эндонуклеазами Е.coRI u HinfI плазмиду рНС312,, в случае конструирования рНС624 расщепляют E coRI u

HindIII эндонуклеазами и выделяют фрагмент 1980 kb, смешивают с расщепленной ферментами E.coRI u HindIII

ДНК плазмиды ПАИ7, фрагменты сшивают ДНК лигазой Т+, трансформируют штамм бактерий Е.со1i НВ101, полученной плазмидой и из amp клонов отбирают рекомбинантную плазмидную

ДНК рНС624, содержащую $шаТ, Sall u

BamHI сайты.

Способ конструирования плазмидного вектора рнс314 или рнс312, или рнс624 Способ конструирования плазмидного вектора рнс314 или рнс312, или рнс624 Способ конструирования плазмидного вектора рнс314 или рнс312, или рнс624 Способ конструирования плазмидного вектора рнс314 или рнс312, или рнс624 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к молекулярной биологии и генетике и может быть использовано в других областях биологии и в медицине для неради.оактивного мечения нуклеиновых кислот

Изобретение относится к микробиологии , в частности к способам получения ферментов нуклеинового обмена

Изобретение относится к хлебопекарной промышленности, в частности к новому штамму дрожжей

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в ген но-инженерных работах и бактериологических исследованиях

Изобретение относится к области микробиологии

Изобретение относится к области бактериальной генетики, а именно к области мутагенеза плазмцц (П)

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии рекомбинантных ДНК, и позволяет защитить культуры E.coli - продуценты белков, гормонов, незаменимых аминокислот и т.п

Изобретение относится к области генетической инженерии и касается способа получения плазмидной ДНК, кодирующей гормон роста крысы или человека

Изобретение относится к цефалоспоринацетилгидролазному гену, белку, содержащему аминокислотную последовательность, кодируемую указанным геном и представляющему собой мультимер, предпочтительно тетрамер или октамер, а также к методу получения указанного белка

Изобретение относится к новым аналогам человеческого инсулина, отличающимся быстрым наступлением требуемого эффекта после подкожной инъекции, и растворам инсулина для инъекций, содержащим подобные аналоги инсулина и к способам получения новых аналогов инсулина
Наверх