Рекомбинантная плазмидная днк pga 23 - промежуточный продукт для конструирования рекомбинантной плазмидной днк ptnf 311,-/,, рекомбинантная плазмидная днк ptnf 311,-/,, кодирующая полипептид со свойствами фактора некроза опухоли человека и штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека

 

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии. Целью изобретения является повышение уровня биосинтеза полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека (ФНО) и упрощение технологии его получения. Поставленная цель достигается с помощью новой рекомбинантной плазмиды pTNF 311 D, кодирующей конститутивный синтез фактора некроза опухоли человека, и штамма E. coli SG 20050/pTNF 311 , обеспечивающего высокий уровень биосинтеза мутантного ФНО, и рекомбинантной плазмидной ДНК pGA 23, являющейся промежуточным продуктом для получения рекомбинантной плазмиды pTNF 311 . Рекомбинантная плазмида pGA 23 состоит из Pst I/Bam I-фрагмента ДНК плазмидного вектора pDSI Io 2+ (3,06 т.п.о.), содержащего гены дигидрофолатредуктазы, хлорамфениколацетилтрансферазы, часть гена -лактамазы и терминатор транскрипции фага l, Pst I/Bam I-фрагмента ДНК плазмиды pLZ 56, содержащего промоторы A2 и A3 ранней области бактериофага T7 и часть гена -лактамазы. Рекомбинантная плазмида pTNF 311 D кодирует полипептид 5 - 157 фактора некроза опухоли человека и состоит из Pst I/Kpn I-фрагмента ДНК плазмиды pGA 23 (1,83 т.п.о.), содержащего тандем сильных промоторов A2 и A3 ранней области бактериофага T7 и часть гена b - лактамазы, и Kpn I/Pst I-фрагмента ДНК плазмиды pTNF 311 D, содержащего полусинтетический искусственный ген, кодурующий полипептид 5 - 157 фактора некроза опухоли человека, терминатор транскрипции фага и часть гена b -лактамазы (2,79 т.п.о.). Штамм E. coli SG 20050, содержащий плазмиду pTNF 311 311,-/,, обеспечивает уровень экспрессии полипептида с активностью ФНО человека, равный 1,25 106 ед. на 1 мл клеточной суспензии.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированные in vitro рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие полусинтетические гены фактора некроза опухоли человека, промоторы ранней области фага Т7 и синтетические участки инициации трансляции, обусловливающие биосинтез полипептидов с биологической активностью фактора некроза опухоли (ФНО), и штаммы E.coli продуценты этих полипептидов. Целью изобретения является увеличение уровня биосинтеза фактора некроза опухоли и упрощение процесса его получения. Сконструирована новая рекомбинантная плазмида pTNF 311 кодирующая конститутивный синтез полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека, новая рекомбинантная плазмида pGA 23, являющаяся промежуточной при конструировании плазмиды рTNF 311 и штамм Е.сoli SG 20050/pTNF 31, обеспечивающий уровень экспрессии ФНО 1,25.106 ед на 1 мл клеточной суспензии. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTNF 311 кодирующая полипептид со свойствами фактора некроза опухоли человека, характеризуется следующими признаками: кодирует полипептид 3-157 фактора некроза опухоли человека; имеет мол.м. 2,3 МД (3,79 т.п.о.). Она состоит из Pst I/Kpn I фрагмента ДНК плазмиды pGA 23, содержащего тандем промоторов А2 и А3 ранней области бактериофага Т7 и часть гена -лактамазы (0,99 т.п.о. ); Kpn I/Pst I фрагмента ДНК плазмиды pTNF 311, содержащего полусинтетический искусственный ген, кодирующий полипептид 5-157 фактора некроза опухоли человека, синтетический сайт инициации транс- ляции, терминатор транскрипции бактериофага и часть гена -лактамазы (2,79 т.п.о.) и содержит в качестве генетического маркера ген -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pTNF 311 клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам; уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенными на следующих расстояниях от сайта Kpn I: NcoI 333 нуклеотида вправо, Pst I 1613 нуклеотидов влево. Рекомбинантная плазмидная ДНК pGA 23, являющаяся промежуточным продуктом при конструировании рекомбинантной плазмидной ДНК pTNF 311 содержит тандем сильных промоторов транскрипции ранней области бактериофага Т7, имеет мол.м. 2,5 Мд. Она состоит из Pst I/Bam I фрагмента ДНК плазмиды pLZ 56, содержащего тандем промоторов А2 и А3 ранней областью фага Т7 и часть гена -лактамазы (1,01 т.п.о.); Bam I/Pst I фрагмента ДНК плазмиды pDSI То2+, содержащего гены дигидрофолатредуктазы, хлорамфениколацетилтрансферазы, терминатор транскрипции фага и часть гена -лактамазы. и содержит
в качестве генетических маркеров гены -лактамазы и хлорамфениколацетилтрансферазы детерминирующие устойчивость трансформированных плазмидой pGA 23 клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам и хлорамфениколу;
уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенными на следующих расстояниях от сайта Bam I: Hind III 665 нуклеотидов вправо, Pvu Ii 813 нуклетотидов вправо, Kpn I 16 нуклеотидов влево, Pst I 1010 нуклеотидов влево. Рекомбинантная плазмида pGa 23 является источником Pst I/Pvu II фрагмента ДНК, который содержит тандем двух сильных промоторов транскрипции А2 и А3 ранней области колифага Т7, и может быть использована как вектор для конструирования плазмид, обеспечивающих высокий уровень гетерологической экспрессии генов, кодирующих практически важные полипептиды. Рекомбинантная плазмида pTNF 311 содержит полусинтетический ген фактора некроза опухоли. Источником С-концевой части гена является Msp I/Hind III фрагмент четвертого экзона природного гена ФНО. Недостающая последовательность ДНК, кодирующая последовательность 29 N-концевых аминокислот, была получена с помощью химического синтеза. Клонотеку генов человека приготовляют из смеси высокомолекулярных ДНК, выделенных из 6 индивидуальных плацент. Для этого ДНК гидролизуют рестрикционной эндонуклеазой EcoRI и полученный гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле, выделяя зоны, содержащей ДНК размером 0,5-2; 2-4; 4-6 т.п.о. и так далее до 12 т.п.о. Материал отдельных фракций был подвергнут блот-гибридизации по Саузерну с олигонуклеотидами
5'CTACTCCCAGGTCCTCT 3'
3'GTCCAGGACAAGTTCCCG 5', последовательность которых соответствует аминокислотной последовательности 59-77 зрелого белка фактора некроза опухоли. С целью увеличения удельной радиоактивности пробы олигонуклеотидные зонды сначала 5'-фосфорилируют с помощью -[32P] АТР, а затем достраивают выступающие концы фрагментом Кленова ДНК полимеразы E.coli с помощью высокомеченых -[32P] -дезоксинуклеозид-5-трифосфатов. Использование полученных таким образом зондов удельной радиоактивности до 108 (имп/мин.пмоль) позволило идентифицировать фракцию ДНК, содержащую ген фактора некроза опухоли (2-4 т.п. о.). ДНК этой фракции лигируют с предварительно дефосфорилированными большими фрагментами ("плечами") фагового вектора gtWesB, которые выделяют после гидролиза фаговой ДНК эндонуклеазной рестрикции EcoRI. Для повышения эффективности легидрования реакцию проводят в два этапа: на первом этапе лигируют геномные фрагменты в высокой концентрации без фаговой ДНК, которую прибавляют при повторном лигировании. Перед скринингом клонотеки препараты упакованных рекомбинантных фагов концентрируют центрифугированием в ступенчатом градиенте хлористого цезия, после чего проводят трансфекцию и высевают на чашки. Анализ полученной таким образом клонотеки проводят путем гибридизации амплифицированных на дуплицированных фильтрах с вышеупомянутым олигонуклеотидными зондами. Из 40 000 клонов первичный скрининг выявил два положительных сигнала. Зоны, содержащие рекомбинантные фаги, вырезают с исходных чашек и после амплификации подвергают вторичному скринингу. ДНК одного из рекомбинантных фагов, 422, дававшего положительную гибридизацию с олигонуклеотидным зондами, выделяют и анализируют с помощью блок-гибридизации по Саузерну, используя гидролизаты рекомбинантной фаговой ДНК эндонуклеазами рестрикции EcoRI, EcoRI/Bgl I, EcoRI/Xho I, Alu I, Mbo I, Tag I, HinF I, Hind II и Pvu II. Далее ДНК рекомбинантного фага 422 гидролизуют рестриктазой EcoRI, выделяют фрагмент величиной 2,8 т.п.о. содержащий ген ФНО, и реклонируют его по сайту EcoRI в плазмиду pUC 12. В результате получают рекомбинантную плазмиду р4221, в которой ген фактора некроза опухоли человека находится в такой ориентации, что его транскрипция совпадает с транскрипцией -пептида -галактозидазы E.coli. Для получения 5'-концевого фрагмента гена фактора некроза опухоли было синтезировано фосфорамидитным методом четырнадцать олигодезоксирибонуклеотидов величиной от 11 до 20 нуклеотидных звеньев. Лигазные сшивки олигонуклеотидов проводят в два этапа: на первом этапе проводят две четырехкомпонентные и одну шестикомпонентную сшивки, причем все олигонуклеотиды перед сшивкой фосфорилируют при помощи dАТР и Т4 полинуклеотидкиназы, за исключением олиго- нуклеотидов (I) и (XIV) из сегментов А и С соответственно. На втором этапе сшивают лигазой сегменты А+В+С, которые предварительно очищают электрофорезом в 20%-ном полиакриламидом геле (ПААГ). Получившуюся в результате 96-звенную двухцепочечную ДНК очищают электрофорезом в 15%-ном ПААГ. Для конструирования рекомбинантной ДНК pTNF 2 векторную плазмиду рUR 291 расщепляют совместно эндонуклеазами Sal I и Hind III и выделяют большой фрагмент, содержащий промотор, оператор и измененный ген -галактозидазы E.coli. Одновременно расщепляют эндонуклеазами Hind III и Msp I ДНК плазмиды р4221, содержащей EcoRI-фрагмент величиной 2,8 т.п.о. геномного клона фага 422, и выделяют фрагмент ДНК величиной 506 п.о. содержащий 3'-концевую последовательность гена зрелого фактора некроза опухоли. Полученный фрагмент соединяют с помощью ДНК-лигазы с синтетическим 5'-концевым фрагментом гена фактора некроза опухоли и с Sal I/Hind III -векторным фрагментом плазмиды pUR 291. После трансформации клеток E.coli/jM 101 отбирают клоны, устойчивые к ампициллину, дающие на среде с X-Gal и IPTG ярко-красную окраску, и проводят среди них скрининг на присутствие синтетического и природного фрагментов гена фактора некроза опухоли гибридизацией колоний in situ с 32Р-мечеными олигонуклеотидными зондами TCGACCATGTCCTCGAGCC и CTACTCCCAGGTCCTCT. Колонии, гибридизующиеся с обоими зондами, отбирают и из них выделяют плазмиду, обозначенную как pTNF 2. Новым в данном способе является использование при конструировании плазмиды синтетического 5'-концевого фрагмента гена фактора некроза опухоли при мультикомпонентной сборке плазмиды, использование для этой цели рестрикционной эндонуклеазы Msp I, а также гибридизация с двумя олигонуклеотидными зондами, соответствующими клонируемым фрагментам. Это позволяет однозначно отобрать клоны E.coli, содержащие целевую плазмиду, что значительно упрощает процедуру конструирования плазмидной ДНК. Плазмида pTNF 2 при трансформации клеток E.coli jM 101 обеспечивает в них индуцируемый синтез фактора некроза опухоли человека в составе гибридного белка с измененной -галактозидазой E.coli. использование в качестве реципиента плазмиды pTNF 2 штамма E.coli CSH 36 (F-) обеспечивает конститутивный синтез химерного белка -галактозидаза фактор некроза опухоли. На основе плазмиды pTNF 2 создают другую рекомбинантную плазмиду pTNF 22, кодирующую полный зрелый белок фактор некроза опухоли. Для этого плазмиду pTNF 2 расщепляют смесью рестриктаз Bam I и Xho I, выделяют большой фрагмент и его лигируют с синтетическими олигонуклеотидами
5' GATCCGAATTCTAAGGAAATTTAAATGGTTCGTCC 3'
3' GCTTAAGATTCCTTTAAATTTACCAAGCAAGGAGCT 5'
После трансформации E.coli штамм НВ 101 целевые клоны отбирают по положительной гибридизации с клонированными синтетическими олигонуклеотидами и структуру вставки подтверждают анализом ее нуклеотидной последовательности модифицированным методом Максама и Гилберта. Полученная таким образом плазмида pTNF 22 обеспечивает в клетках E.coli (jM 101) при индукции изопропилтио--D-галактопиранозидом (IPTG) экспрессию зрелого белка фактора некроза опухоли в количестве 60000 ед на 1 мл культуры клеток с плотностью 2,0. Для создания конструкции для конститутивного синтеза фактора некроза опухоли полусинтетический ген реклонируют в плазмиду pGA 23, содержащую тандем сильных промотороввв А2 и А3 бактериофаг Т7. В свою очередь, плазмиду pGA 23 получают путем клонирования по сайтам Pst I/Bam I малого фрагмента плазмиды pLZ 56 в плазмидный вектор pDSI. Для этого из плазмиды pTNF 22 выделяют после гидролиза рестрактазой EcoRI фрагмент величиной 714 п.о. и клонируют его в промоторсодержащей плазмиде pGA 23 после ее частичного гидролиза с помощью EcoRI. В результате получают плазмиду pTNF 30, в которой экспрессия искусственного гена фактора некроза опухоли контролируется тандемом сильных промоторов ранней области бактериофага Т7. После трансформации плазмидной pTNF 30 клетки E.coli (НВ 101) способны конститутивно синтезировать 120000 ед. активности фактора некроза опухоли на 1 мл клеточной культуры. Для усовершенствования системы экспрессии фактора некроза опухоли конструируют новую рекомбинантную плазмиду pTNF 311 которая содержит усовершенствованный рибосомосвязывающий сайт и перекодированный искусственный ген фактора некроза опухоли. Для этого ДНК плазмиды pTNF 30 гидролизуют эндонуклеазой Xh 01, образовавшиеся 5'-выступающие концы линеаризованной плазмиды удаляют при помощи SI-нуклеазы, образовавшуюся ДНК с "тупыми" концами подвергают дополнительномку гидролизу эндонуклеазой рестрикции Pst I и выделяют фрагмент величиной 2,98 т.п.о. С другой стороны, ДНК плазмиды pGA 23 подвергают гидролизу смесью рестриктаз Pst I и Pvu II и выделяют фрагмент величиной около 1,8 т.п.о. Оба фрагмента затем соединяют с помощью ДНК-лигазы с синтетической двухцепочечной ДНК, содержащей последовательность сайта инициации трансляции E.coli и сериновый кодон. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli HB 101, отбирают клоны, устойчивые к ампициллину, и среди них проводят скрининг на присутствие полусинтетического гена фактора некроза опухоли путем гибридизации in situ с 32Р-меченой верхней цепью клонированного дуплекса, Колонии, дающие положительную гибридизацию с пробой, отбирают и выделенную из них плазмиду охарактеризовывают рестриктным анализом. В результате получают новую рекомбинантную плазмиду pTNF 311 , содержащую полусинтетический ген, кодирующий полипептид 5-157 зрелого фактора некроза опухоли человека. Для получения штамма-продуцентра полипептида с биологической активностью ФНО-плазмидой pTNF 311 трансформируют компетентные клетки E.coli SG 20050. Полученный таким образом штамм E.coli SG 20050/pTNF 31 характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки: клетки очень мелкие, утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. Культуральные признаки: клетки хорошо растут на простых питательных средах; при росте на агаре Дифко колонии круглые, гладкие, прижатые, мутные, блестящие, серые, край ровный; при росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют ровную интенсивную муть. Физиолого-биологические признаки: клетки растут в пределах от 4 до 40оС при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы. Устойчивость к антибиотикам: клетки проявляют устойчивость к хлорамфениколу (до 500 мкг/мл) и к ампициллину (до 250 мк/мл), обусловленную наличием плазмиды. Штамм E.coli SG 20050/pTNF 31 обусловливает конститутивный синтез полипептида с биологической активностью фактора некроза опухоли человека на уровне 1,25.106 ед/мл клеточной суспензии. П р и м е р 1. Химико-ферментативный синтез N-концевой части структурного гена фактора некроза опухоли человека. Синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным методом с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-0(метокси- диизопропиламино)фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в стеклянной колонке с пористым фильтром путем ручного прибавления реагентов и растворителей, используя для этой цели 0,6-0,8 мкмоль 3'-концевого нуклеозида, ковалентно связанного с 25-30 мг пористого стекла (размер пор 500 ). Каждый цикл наращивания состоит из следующих операций: промывка полимерного носителя ацетонитрилом (3 мл, 2 мин); детритилирование с помощью 0,5 М раствора дихлоруксусной кислоты (2 мл, 2 мин); промывка ацетонитрилом (1,5 мл, 1 мин); промывка абсолютным ацетонитрилом (3 ил, 3 мин); конденсация прибавление смеси 0,05 М раствора соответствующего амидита и 0,3 М раствора дважды возогнанного тетразола порциями по 0,1 мл( 0,2 мл, 2 мин); промывка ацетонитрилом (1,5 мл, 1 мин); окисление прибавление 0,1 М раствора иода в смеси тетрагидрофуран лутидин вода, 8:1:1 (1 мл, 1 мин); промывка абсолютным ацетонитрилом (3 мл, 3 мин); "кэппирование" обработка 1 М раствором уксусного ангидрида и 0,1 М раствором 4-диметиламинопиридина в ацетонитриле. После завершения синтеза носитель высушивают, обрабатывают 0,5 мл смеси тиофенол триэтиламин диоксан 1:2:2 (1,5 ч, 20оС), промывают метанолом и снова высушивают. Отделение олигонуклеотида от полимерного носителя и удаление ацильных защитных групп проводят действием концентрированного аммиака (24 ч, 55оС). Затем носитель отфильтровывают, промывают 0,05 М триэтиламмонийбикарбонатом (ТЕАВ) и этанолом; фильтрат и промывки упаривают и хроматографируют на колонке Zorbax ODS (0,46х25 см) в градиенте концентрации ацетонитрила (5-30%) в 0,05 М ТЕАВ. Фракцию, содержащую диметокси- тритильное производное олигонуклеотида упаривают и обрабатывают 80%-ной уксусной кислотой (30 мин, 20оС), растворитель упаривают и олигонуклеотид выделяют хроматографией на той же колонке в градиенте концентрации ацетонитрила (5-15%). Выход очищенного олигонулеотида 20-80 нмолей. Лигазная сшивка сегмента А. Смесь 480 пмоль олигонуклеотида (I), 400 пмоль каждого из фосфорилированных олигонуклеотидов II, III, IV и V и 480 пмоль фосфорилированного олигонуклеотида VI нагревают 10 мин при 65оС в 100 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl, рН 7,5; 10 мМ MgCl2, затем медленно охлаждают до 1оС, прибавляют d АТР до концентрации 0,2 мМ, дитиотреит до концентрации 10 мМ и 300 ед Т4 ДНК-лигазы. Смесь инкубируют 6 ч при 15оС, затем депротеинизируют двукратной экстракцией фенолом, ДНК высаживают этанолом и продукты сшивки выделяют при помощи электрофореза в 20%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Продукт сшивки элюируют из геля электроэлюцией на DЕАЕ-бумагу DE 81, которую промывают несколько раз ТЕ-буфером (10 мМ трис-HCl, рН 8,0; 0,5 мМ EDTA) и этанолом. Нуклеотидный материал элюируют с помощью 1,5 М раствора NaCl в ТЕ-буфере и обессоливают на колонке с сефадексом G-50. Выход сегмента А 280 пмоль. Аналогичным образом получают сегменты В и С, выходы 350 и 320 пмоль соответственно. Далее сшивают по 50 пмоль каждого из сегментов А, В и С в 20 мкл буфера L, содержащего 20 мМ трис-HCl, рН 7,5; 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ dАТР, 10 мМ дитиотреита и 250 ед Т4 ДНК-лигазы 4 ч при 15оС. Продукт сшивки выделяют электрофорезом в 15%-ном ПААГ, как описано выше. Выход 35 пмоль. Структуру промежуточных и конечных продуктов лигазных реакций доказывают анализом нуклеотидной последовательности. П р и м е р 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рTNF 2. Клетки бактерий E.coli jM 101, содержащие плазмидную ДНК pUR 291, выращивают при 37оС в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Затем клетки осаждают центрифугированием (15 мин, 6000 об/мин) и плазмидную ДНК выделяют методом с модификациями, заключающимися в том, что к супернатанту, полученному после подкисления ацетатом натрия, прибавляют РНКазу А до концентрации 10 мкг/мл, смесь инкубируют 20 мин при 37оС, экстрагируют дважды смесью фенол хлороформ (1:1), после чего ДНК высаживают этанолом. Осадок растворяют в 1 М NaCl, прибавляют полиэтиленгликоль ПЭГ-6000 до концентрации 1,5% выдерживают 1 ч при 0оС, центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин, осадок промывают 70%-ным этанолом, высушивают и растворяют в ТЕ-буфере. Выход плазмидной ДНК 500-800 мкг. Концентрацию плазмидной ДНК определяют спектрофотометрически при 260 нм с использованием коэффициента экстинкции 20 ОЕ/мг. Аналогичным образом выделяют ДНК плазмиды р 4221, содержащей ген фактора некроза опухоли в виде EcoRI-фрагмента (2,8 т.п.о.), клонированный в плазмиде pUC 12 из рекомбинантного фага 422. Полученные препараты плазмидных ДНК используют для конструирования плазмиды pTNF 2, которое проводят следующим образом. 5 мкг плазмиды pUR 291 инкубируют с эндонуклеазами рестрикции Sal I (20 ед) и Hind III (10 ед) в буфере R, содержащем 20 мМ трис-HCl, рН 7,5; 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 5 мМ меркаптоэтанола, 1 ч при 37оС. После инкубации реакцию останавливают двукратной экстракцией смесью фенол хлороформ (1: 1). Анализ полноты гидролиза и выделение векторного SalI/Hind III -фрагмента (5,3 т.п.о.) проводят электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Одновременно 10 мкг плазмиды р 4221 обрабатывают 1,5 ч при 37оС в буфере R рестриктазами Msp I (20 ед) и Hind III (20 ед), после чего электрофорезом в 5% -ном ПААГ выделяют С-концевой фрагмент гена фактора некроза опухоли (Msp I/Hind III, 506 п.о.). Далее этот фрагмент (0,2 мкг) соединяют с Sal I/Hind III векторным фрагментом (1,5 мкг) и синтетическим фрагментом (0,1 мкг, см. пример 1) с помощью Т4 ДНК-лигазы (50 ед) в 50 мкл буфера L в течение 6 ч при 15оС. Десятую часть реакционной смеси используют для трансформации клеток E. coli jM 101. Трансформацию проводят следующим образом. Предварительно клетки высевают на агар, содержащий среду М9, 0,2%-ную глюкозу и 2 мкг/мл тиамина. Единичную колонию вносят в 50 мл питательного бульона LB и выращивают при 37оС до мутности 0,3-0,5, Затем клетки охлаждают, осаждают центрифугированием (10 мин, 5000 об/мин), промывают раствором 10 мМ MgCl2, центрифугируют, суспендируют в 20 мл 0,1 М раствора CaCl2, выдерживают при 0оС в течение 30 мин. После центрифугирования клетки ресуспендируют в 3 мл 0,1 М CaCl2 и через 3 ч используют для трансформации. Для этого 5 мкл лигазной смеси смешивают с 50 мкл (0,05 М CaCl2, прибавляют 150 мкл суспензии компетентных клеток, выдерживают 30 мин при 0оС, затем 2 мин при 42оС и снова 10 мин при 0оС, прибавляют 1,4 мл LB-бульона, инкубируют 1 ч при 37оС и аликвоты высевают на чашки с LB- агаром, содержащим ампициллин (50 мкг/мл), Х-Gal (40 мкг/мл) и 1 мМ IPTG. Полученные ярко-синие колонии переносят на параллельные нитроцеллюлозные фильтры и анализируют на содержание синтетического и природного фрагментов гена ФНО гибридизацией колоний in situ с 32Р-мечеными олигонуклеотидами TCGACCATGTCCTCGAGCC и CTACTCCCAGGTCCTCT. Колонии, дающие положительную гибридизацию с обоими зондами, отбирают и из них выделяют плазмиду, обозначенную как pTNF 2. Структуру плазмидной ДНК pTNF 2 подтверждают рестриктным анализом и определением нуклеотидной последовательности части плазмидной ДНК между сайтами эндонуклеаз Bam I и Hind III. П р и м е р 3. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рTNF 2. 1, мкг ДНК плазмиды pTNF 2 гидролизуют эндонуклеазами рестрикции BamI (28 ед) и XhoI (15 ед) в течение 1,5 ч при 37оС. После инкубации смесь экстрагируют дважды смесью фенол хлороформ (1:1). Векторный фрагмент величиной 5,92 т.п.о. выделяют с помощью электрофореза в 1%-ном агарозе. 0,5 мкг этого фрагмента лигируют с 15 пмоль синтетического дуплекса
GATCCTGAATTCTAAGGAAATTTAAATGGTTCGTTCC
GACTTAAGATTCCTTTAAATTTACCAAGCAAGGAGCT в 50 мкл буфера L в течение 6 ч при 15оС в присутствии 50 ед Т4 ДНК-лигазы. Пятую часть лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli НВ 101, как это описано в примере 2. Отбор клонов проводят гибридизацией колоний с 32Р-мечеными вставочными олигонуклеотидами. Колонии, дающие положительную гибридизацию, отбирают и из них выделяют плазмиду, обозначенную как pTNF 22. Структуру плазмидной ДНК pTNF 22 подтверждают рестриктным анализом и определением нуклеотидной последова- тельности между сайтами ЕcoRI. П р и м е р 4. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рGA 23. Конструирование плазмиды pGA 23 проводят следующим образом. Сначала плазмидную ДНК pDSI tо 2+ (5 мкг) инкубируют с эндонуклеазами рестрикции Pst I (10 ед) и Bam I (10 ед) в 50 мкл буфера R 1,5 ч при 37оС. После обработки, как в примере 2, векторный фрагмент выделяют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Далее 10 мкг плазмиды pLZ 56 гидролизуют с помощью эндонуклеаз рестрикции Pst I (20 ед) и Bam I (20 ед) и фрагмент около 1 т.п. о. содержащий промоторы А2 и А3 ранней области фага Т7, выделяют электрофорезом в 5%-ном ПААГ. Затем 0,5 мкг векторного фрагмента соединяют с 0,2 мкг промоторсодержащего фрагмента с помощью Т4 ДНК-лигазы в 15 мкл буфера L в течение 6 ч при 15оС. Аликвотой реакционной смеси трансформируют компетентные клетки E.coli С 600 и трансформированные клетки высевают на агар, содержащий среду LB и 150 мкг/мл хлорамфеникола. Из хлорамфениколустойчивых колоний выделяют плазмидную ДНК, обозначенную как pGA 23. Структуру плазмидной ДНК pGA 23 подтверждают рестриктным анализом. П р и м е р 5. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pNTF 311
Сначала проводят конструирование промежуточной рекомбинантной плазмиды pTNF 30. С этой целью 15 мкг плазмидной ДНК pGA 23 инкубируют с 10 ед эндонуклеазы EcoRI в 120 мкл буфера R в течение 1 ч при 25оС. Реакцию останавливают двукратной экстракцией смесью фенол хлороформ (1:1) и линеаризованную плазмиду выделяют при помощи электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Аналогичным образом с помощью гидролиза эндонуклеазой EcoRI и электрофореза в 1%-ном агарозном геле из плазмиды pTNF 22 выделяют фрагмент величиной 714 п.о. 0,1 мкг которого инкубируют с 1 мкг линеаризованной плазмиды pGA 23 в 25 мкл буфера L в присутствии 50 ед Т4 ДНК-лигазы. Одной десятой частью лигазной сшивки трансформируют компетентные клетки EW. coli НВ 101, как описано в примере 2. Смесь высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (50 мкг/мл) и хлорамфеникол (100 мкг/мл). Полученные колонии сканируют на содержание полусинтетического гена гибридизацией с 32Р-меченым сегментом В (см. пример 1). Колонии, дающие положительную гибридизацию, отбирают, из них выделяют плазмидную ДНК и проводят рестриктный анализ с помощью эндонуклеазы Hind III на ориентацию фрагмента, содержащего искусственный ген фактора некроза опухоли, и с помощью эндонуклеазы Hae III. Плазмидную ДНК, образующую при гидролизе рестриктазой Hind III фрагмент величиной 784 п.о. и содержащую в Нае III-гидролизате промоторсодержащий фрагмент величиной 360 п.о. обозначают как pTNF 30. Строение рекомбинантной ДНК pTNF 30 подтверждают рестриктным анализом с помощью рестрикционных эндонуклеаз Hae III, Msp I и Hing III, а также определением цитопатической активности лизатов клеток, содержащих плазмиду pTNF 30 (см. пример 7). Затем 10 мг плазмиды pTNF 30 инкубируют с 20 ед эндонуклеазы Xho I в 150 мкл буфера R в течение 1,5 ч при 37оС. По окончании реакции смесь экстрагируют дважды смесью фенол хлороформ (1:1) и ДНК высаживают этанолом. Осадок промывают 80%-ным этанолом, высушивают, растворяют в 150 мкл буфера, содержащего 50 мМ ацетата натрия (рН 4,5), 10 мМ ZnSO4, 0,5 М NaCl, прибавляют 15 ед SI-нуклеазы и смесь инкубируют 45 мин при 25оС. Реакцию останавливают трехкратной экстракцией смесью фенол хлороформ (1:1). ДНК высаживают этанолом, осадок промывают 80%-ным этанолом и высушивают. Полученную таким образом ДНК растворяют в 200 мкл буфера R, инкубируют 1,5 ч при 37оС с 20 ед эндонуклеазы Pst I и больший фрагмент (около 3 т.п.о.) выделяют электрофорезом в 1% -ном агарозном геле. С другой стороны, тем же способом выделяют малый фрагмент, полученный при гидролизе 10 мкг ДНК плазмиды pGA 23 с помощью 15 ед рестриктазы Pst I и 20 ед рестриктазы Pvu II. Затем оба фрагмента (0,7 и 0,3 мкг) дигируют с 1 мкг двухцепочечной синтетической ДНК, содержащей участок инициации трансляции и сериновый кодон, при помощи 150 ед Т4 ДНК-лигазы в 10 мкл буфера L в течение 16 ч при 18оС. Десятую часть реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli НВ 101. Трансформанты высевают на LВ-агар, содержащий ампициллин (50 мкг/мл). Среди ампициллинустойчивых клонов проводят скрининг гибридизацией с 32Р-меченой верхней цепью клонированного синтетического дуплекса. ДНК из гибридизирующихся клонов выделяют и анализируют при помощи эндонуклеаз рестрикции Hae III и Msp I, а также определением нуклеотидной последовательности в районе вставки. 1 мкг полученной таким образом ДНК плазмиды pTNF 311 инкубируют с 2 ед рестрикционной эндонуклеазы Kpn I в 20 мкл буфера R в течение 1 ч при 37оС. Реакцию останавливают экстракцией смесью фенол хлороформ (1:1) и больший фрагмент (около 3,8 т.п.о.) выделяют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. 0,2 мкг этого фрагмента инкубируют в 10 мкл буфера L и 20 ед Т4 ДНК-лигазы в течение 3 ч при 15оС. Четвертую часть реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli НВ 101. Трансформанты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (5 мкг/мл), и ДНК из ампициллинустойчивых клонов анализируют рестриктным анализом при помощи эндонуклеаз Hal III и Msp I. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК, обозначенную pTNF 311 структуру которой подтверждают анализом нуклеотидной последовательности в районе сайта Kpn I. П р и м е р 6. Получение штамма-продуцента полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека. Плазмидой pTNF 311 трансформируют клетки E.coli SG 20050 по методу, описанному в примере 2, и получают штамм-продуцент полипептида 5-157 фактора некроза опухоли человека E.coli SG 20050/pNTF 311
П р и м е р 7. Определение продуктивности штамма E.coli продуцента полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека. Клетки E.coli SG 20050/pTNF 311 выращивают при 37оС в 20 мл LB-бульона в течение 20 ч на качалке при скорости вращения 190 об/мин. Отбирают пробу 2 мл, клетки центрифугируют 10 мин при 6000 об/мин, затем суспендируют в 25 мМ трис-буфере (рН 8,0), содержащем 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида и лизоцим (5 мг/мл), и инкубируют 30 мин при 25оС. Для вскрытия клеток смесь замораживают в течение 10 мин при -70оС, а затем оттаивают во льду, эту операцию повторяют трижды, после чего определяют содержание фактора некроза опухоли в растворе измерением его биологической активности. Биологическую активность ФНО определяют на культуре трансформированных мышиных фибробластов линии L-929. Для этого монослойную культуру клеток выращивают в СО2-термостате в 96-луночных пластинах для культур клеток в среде DMEM, содержащей 10% -ную сыворотку теленка. Для определения биологической активности культуральную среду заменяют на свежую среду DMEM, содержащую 1% -ную сыворотку теленка, актиномицин D (1 мг/мл) и клеточный лизат в серийных двукратных разбавлениях (примерно соответствующих концентрации фактора некроза опухоли от 10 до 10-1 мкг/мл). Платы снова инкубируют 16-20 ч в СО2-термостате, затем клетки прокрашивают трипановым синим и подсчитывают количество окрашенных (нежизнеспособных) и неокрашенных (живых) клеток. За единицу активности принимают количество фактора некроза опухоли, вызывающее гибель 50% трансформированных клеток. Таким образом, изобретение позволяет повысить уровень биосинтеза полипептида с биологической активностью фактора некроза опухоли человека до 8.106 ед на 1 мл клеточной суспензии и упростить процесс его получения за счет исключения нетехнологичной стадии индукции.


Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pGA 23 - промежуточный продукт для конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pT pTNF311 с мол.м. 2,5 МД, содержащая:
Rst I -Bam I-фрагмент ДНК плазмиды p 4256 с тандемом промоторов A2 и A3 ранней области фага T7 и с частью гена b лактамазы размером 1,01 т.п.о.;
Bam I - Pst-фрагмент ДНК плазмиды pDSI T0 2+ с геном дигидрофолатредуктазы, хлорамфениколацетилтрансферазы с терминатором транскрипции фага l и частью гена b -лактамазы;
генетические маркеры:
ген b -лактамазы и хлорамфениколацетилтрансферазы, детерминирующие устойчивость трансформированных плазмидой pGA 23 клеток Escherichia coli к пенициллиновым антибиотикам и хлорамфениколу;
уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенными на следующих расстояниях от сайта Bam I : Hind III 665 нуклеотидов вправо, Pvu II 813 нуклеотидов вправо, Kpn I 16 нуклеотидов влево, Pst I 1010 нуклеотидов влево. 2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTNF311, кодирующая полипептид со свойствами фактора некроза опухоли человека с мол.м. 2,3 MD размером 3,79 т.п. о., содержащая
Pst I - Kpn I-фрагмент ДНК плазмиды pGA 23 с тандемом промоторов A2 и A3 ранней области бактериофага T7 и частью гена -лактамазы размером 0,99 т.п. о.;
Kpn I - Pst I-фрагмент ДНК плазмиды pTNF 311 с полусинтетическим искусственным геном, кодирующим полипептид 5 - 157 фактора некроза опухоли человека, и синтетическим сайтом инициации трансляции, терминатором транскрипции бактериофага l и частью гена b лактамазы размером 2,79 т.п.о.;
генетические маркеры: ген b -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pTNF311 клеток Escherichia koli к пенициллиновым антибиотикам;
уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенными на следующих расстояниях от сайта Kp I: N col I 333 нуклеотида вправо, Rst I 1613 нуклеотидов влево. 3. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-3967 - продуцент полипептида 5-157 со свойствами фактора некроза опухоли человека.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии высших растений, и представляет собой способ переноса и включения в геном высших растений отдельных генов

Изобретение относится к биотехнологии и позволяет получить рекомбинантный полипептид, ингибирующий слипание и агрегацию тромбоцитов при воздействии таких условий, при которых проявляются церебровескулярные расстройства и сердечно-сосудистые расстройства

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения микроорганизмов для продуцирования триптофана и способам продуцирования триптофана

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генной и белковой инженерии, в частности к получению рекомбинантной плазмидной ДНКpКНВc-33, содержащей ген корового антигена вируса гепатита B (НВcAg) с экспонированным на его поверхности главным нейтрализующим эпитопом поверхностного антигена вируса гепатита B (137-147) (HBsAg) и соответствующего штамма-продуцента

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии и может быть использовано для получения фактора некроза опухолей-бета (ФНО-бета)

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ получения биомасс рекомбинантных штаммов E.coli, содержащих плазмидные ДНК, кодирующие биосинтез цитокинов со свойствами факторов некроза опухолей и (ФНО-альфа и ФНО-бета), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) и гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека и несущие в качестве селективного маркера ген bla (устойчивость к ампициллину)

Изобретение относится к области медицинской генетики, в частности к соматическим мутациям в гене многофункционального опухолевого супрессора (MTS) в случае неоплазий человека и использованию этих мутаций для диагностики и прогнозирования указанных заболеваний
Наверх