Вектор рмв 124 для получения фрагментов днк с произвольными липкими концами и способ его конструирования

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и генетической инженерии и представляет собой векторную дак РВМ 124 для получения фрагментов ДНК с произвольными липкими концами. Полученная рекомбинантйая ДНК имеет молекулярную массу 1,8 МД и содержит Е со R I-Pst 1 фрагмент ДНК плазми/ ды pUR 222 с геном /3-лактамазы и частью модифицированного гена f, -галактозидазы E.coli, а также синтетический полилинкер длиной 42 н.о. Полилинкер включает между попарными сайтами Fok I и Hga I набор сайтов для эндонуклеаз рестрикции Sal 16, Асе I, Hind II, Bam Н I противоположной полярности. Целевые фрагменты ДНК получают путем клонирования субфрагментов в составе сконструированной векторной плазмиды рМВ 124 по сайтам Fok I и Hga 1 с последующим их выщеплением рестриктаз Fok I и Hga. 2 с.п. ф-лы.

СВОЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (50 4 С 12 N 15/00

Г / ! q", ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4149175/28-13 (22) 17.11.86 (46) 23.12.88. Бюл. 11 47 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (72) А.Н.Синяков, О.И.Серпинский, Н.К.Данилюк, С.Х.Дегтярев и В.E.Чижиков (53) 575.224.2.577.2/048 (088 ° 8) (56) Доклады академии наук СССР.

1984, т.278, 0 5, с.1250-1253. (54) BEKTOP рМВ 124 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

ФРАГМЕНТОВ ДНК С ПРОИЗВОЛЬНЫМИ ЛИПКИМИ КОНЦАМИ И СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и генетической инжекерии и представляет собой векторную

ДНК РВМ 124 для получения фрагментов

„„SU„„1446160 А 1

ДНК с произвольными липкими концами.

Полученная рекомбинантная ДНК имеет молекулярную массу 1,8 МД и содержит

E co R I — Pst I фрагмент ДНК плазмиI ды рУК 222 с геном 6-лактамазы и частью модифицированного гена p --галактозидазы Е.cali, а также синтетический полилинкер длиной 42 н.о. Полилинкер включает между попарными сайтами Fok I u Hga I набор сайтов для эндонуклеаз рестрикции Sal 16, Асс I, Hind II, Bam Н I противоположной полярности. Целевые фрагменты ДНК получают путем клонирования субфрагментов в составе сконструированной векторной плазмиды рМВ 124 по сайтам ф

Fok I u Hga I с последующим их выщепнением рестриктае Pak 1 и Hga. 2 с.к. Я

1446160

GGATGACGCGTCGACAAGCTAGCTTGGATCCGCGTCATCCAG

ACGTCCTACTGCGCAGCTGTTCGATCGAACCTAGGCGCAGTAGGTCTТА.

GGATGACGCG

TCGACGCGTCATCCTGCA

GATCCGCGTCATCCAG

AATTCTGGATGACGCG (Ill) (1V)

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных ДНК методами генетической инженерии и мо5 жет найти применение в биотехнологии при создании штаммов-продуцентов целевых продуктов.

Целевую плазмиду получают путем расщепления ДНК плазмиды рИ?МВ эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI, лигирования полученного гидролизата с синтетическими олигонуклеотидами

GATCCGCGTCATCCAG и AATTCTGGATGACGCG с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4 в случае получения рМВ 123. Полученйой смесью трансформируют клетки Е.

coli ВМН 7118 и проводят отбор клонов, устойчивых к ампициллину, с фе- 25 нотипом Lac (промежуточная плазмида рМВ 121). Из индивидуальных клонов выделяют ДБК плаэмиды рМВ 121, которую расщепляют эндонуклеаэами рестрикции PstI и Ба1С1 и лигируют с,30 олинонуклеотидами GGATGACGCG u

TCGACGCGTCATCCTGCA. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е.

coli и проводят отбор клонов, устойчивых к ампициллину, с фенотипом Lac (промежуточная ппазмида рМВ 123).

Расщепляют ДНК плазмиды рМВ 123 эндонуклеазой рестрикции Hind III достраивают "липкие" концы с помощью

ДНК-полимеразы (фрагмент Кленова) и 40 лигируют полученный дуплекс. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки и проводят отбор клонов, устойчивых к ампициллйну, с фенотипом

Lac (плазмида рМВ 124).

I1 р и м е р 1. Химический синтез олигонуклеотидов проводят твердофазным фосфотриэфирным методом. В качестве носителя используют модифицированный силохром.

Цель изобретения — создание вектора, позволяющего получать клонируемые в нем фрагменты ДНК с произвольными

-;:èïêèìè концами.

Поставленная цель достигается конструированием плазмиды рМВ 124, состоящей из EcoRI-PstI фрагмента ДНК плаэмиды pUR 222 и полилинкера:

Наращивание олигонуклеотидной цепи проводят от 3 — к 5 — концу с помоf щью динуклеознддифосфатных производных (МеО) >Tr Np{PhC1) NP(PhC1) . Выделение целевого продукта после деблокирования реакционной смеси проводят путем последовательных хроматографий на Lichrosorb RP 18 сначала в О, 1 М триэтиламмонийацетате в градиенте ацетонитрила 15-40X.. Затем раствор выделенного тритилолигонуклеотида упаривают досуха, растворяют в

2,5 мл 807-ной водной уксусной кислоте и- выдерживают при комнатной температуре 45 мин. Раствор упаривают досуха, растворяют остаток в 1 мл дистиллированной воды н хроматографируют на Lichrosorb PR 18 в 0,05 М триэтиламмонийацетате в градиенте ацетонитрила 5-20#.

Конструирование целевой рекомбинантной ДНК рМВ 124 состоит из ,цвух этапов. На первом этапе конструируют промежуточные плазмидные

ДНК рМВ 122 и рМВ 123.

5 мкг ДНК плазмиды рИ?МВ гидролизуют совместно эндонуклеазами рестрикции PamHI и ЕсоКЕ в 50 мкл раствора, содержащего буфер 1 (20мМ трис-НС1, рН 7,8, 10 мМ NgCI, 10 мМ

2-меркаптоэтанол) и 100 мМ NaC1 при о

37 С t ч. Реакционную смесь после добавления 5 мкл 0,4 М ЭДТА, рН 8,0 экстрагируют равным объемом водного фенола и изоамилового спирта. Затем к реакционной смеси добавляют NaAc до концентрации 0,3 М, рН 7,0 и осаждают ДНК двумя объемами этанола. Полученный препарат ДНК вектора pNINB растворяют в 50 мкл буфера ТЕ (10мМ трис-НС1, рН 7,8; 1 мМ ЭДТА).

К 5 мкл раствора вектора pNIMB добавляют по 20 пкмоль олигонуклеотидов (Ш и IV), 2 ед. ДНК-лигазы фага Т4 в 30 мкл буфера 2 (20 мМ

1446160

5 СССТССАСААСААТСССАААСТСАССАСААТ; (V)

5 ATGAAAAACTTAAATGTGAGCATTCTGGTGA; (VI) 5 GCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCA; (VII) т

5 СССАСАТСТСТАААСАСТСААСАТСТТТСА. (VI II) г трис — НС1, рН 6, 10 мИ ИяС1, 10 мИ

2-меркаптоэтанол и 0,5 MM ATP).

Реакционную смесь выдерживают

12 ч при 10 С, затем используют для

5 трансформации клеток Е.coli BMH 7118

Суспензию клеток после трансформации высевают на 1,5Х LÂ агар, содержащий

75 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл с

Х-Саl. Чашки инкубируют 12 ч при 37 С. 1ð

Из колоний, имеющих Lac фенотип, щелочным методом вьщеляют ДНК плазмиды рМВ 121. Bspl u FokI гидролизаты полученной ДНК анализируют в 4Х

ПААГ. Клон, имеющий дополнительный

Fok I-сайт в плазмидной ДНК, выращивают в 100 мл среды, содержащей

50 мкг/мл ампициллина, в течение

16 ч при 37 С на качалке (200 об/мин).

Клетки собирают центрифугированием 20 (6000 об/мин, 10 мин, 4 С), плазмидную ДНК рМВ 121 выделяют щелочным методом с последующей дополнительной очисткой в градиенте плотности CsC1.

5 мкг ДНК плазмиды рИВ расщепляют 25

10 ед. эндонуклеазы рестрикции Pstl в 50 мкл раствора, содержащего буфер

1 и 50 мМ NaC1 1 ч при 37 С. Затем .к реакционной смеси добавляют NaC1 до концентрации 150 мИ, 2-меркапто- 30 этанол до 20 мИ и 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Sal GI, выдерживают

1 ч при 37 С. Реакционную смесь после добавления 6 мкл 0 4 М ЭДТА, рН

8,0 экстрагируют равным объемом вод- 35 ного фенола и изоамилового спирта.

ДНК вектора рМВ 121 осаждают этанолом и растворяют в 50 мл ТЕ-буфера. .5 мкл раствора вектора рМВ 121 отбирают для получения плазмиды рМВ 4О

123. К реакционной смеси добавляют по 20 пкмоль олигонуклеотидов I и II, 2 ед. ДНК-лигазы фага Т4 в 30 мкл буфера 2 и выдерживают 12 ч при 10 С.

Полученной лигазной смесью трансфор- 45

Из полинукиеотидов (I-VIII) полу55 чают дуплексы клонирования.

Реакционную смесь, содержащую по

100 пмоль меченного ) -Р > -АТР полинуклеотида (V) и фосфорилированного мируют клетки Е.col> BMH 7118. Из ко лоний (получение см.выше)), имеющих

Lac фенотип, выделяют плазмидную

ДНК. После рестрикционного анализа с помощью BspI u FokI эндонуклеаз определяют ее первичную структуру в районе встроенного полилинкера по методу Максама-Гилберта. .5 мкг ДНК плазмиды рМВ 123 гидролизуют 10 ед. эндонуклеазы рестрикции HindIII в 50 мкл буфера 1, содержащего 50 мИ NaCl, 1 ч при 37 С. Затем в реакционную смесь добавляют

dNTP, до концентрации 100 мкМ и Н О до общего объема 100 мкл, прибавляют 1 ед. ДНК-полимераэы ? (фрагмент

Кленова) и выдерживают 30 мин при

20 С. Реакционную смесь разбавляют

5 мкл 0,4 М ЭДТА (рН 8;О) и экстрагируют водным фенолом и изоамиловым спиртом. ДНК осаждают двумя объемами этанола. 0,5 мкг полученной ДНК обрабатывают 2 ед. ДНК-лигазы фага Т4 в 30 мкл буфера 2 в течение 16 ч при о

10 С. Реакционную смесь используют для трансформации клеток Е.coli ВМН

7118. Суспензию клеток после трансфор— мации высевают на 1,5Х агар, содержащий 45 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл

Х-Саl. Из колоний, имеющих Ьас фенотип, выделяют плазмидную ДНК щелочным методом. BspI u BspI + Hind III— гидролизаты полученной ДНК анализируют в 4Х ПААГ. Первичную структуру в районе встроенного полилинкера определяют по методу Иаксама-Гилберта.

Пример 2. Получение субфрагмента ДНК, кодирующего аминокислотную последовательность, соответствукяцую

32-60 аминокислотам человеческого интерлейкина-2, с произвольно запланированными липкими концами. Описанным способом синтезируют и выделяют следующие нуклеотиды: холодным АТР полинуклеотида (VI) в

100 мкл буфера 3 (60 мМ трис-НС1, рН 7,5; 10 мМ MgClg, 10 мИ 2-меркапо тоэтанол) нагревают 10 мин при 50 С, охлаждают до 20 С, добавляют Ð до

14461

5 CCGACATCTAGAAGAAGAACTCAAACTCCTGGAAGAAGTG; (TX)

5 GAAAATTTTTGCTTTGTGCTAAATTCAGCACTTCTTCCAG; (Х)

5 ACTTACGTCCCCGTGACTTAATCTCCAATATCAACGTAAT; (XI) SalGI (XII) 5 ССТСTCGACCCTTCAGTTCCAGTACAATTACGTTGATA. концентрации 250 мкГ1 и 10 ед. ДНКполимеразы I (фрагмент Кленова). Реакционную смесь инкубируют 30 мин при 20"С, добавляют 1О мкл 0,4 М

ЭДТА (рН 8,0), экстрагируют водным фенолом. ДНК-дуплекс осаждают ацетоном, содержащим 27. 1.iC104, промывают спиртом, сушат на воздухе, осадок растворяют в воде. Полученный дуп- 10 лекс расщепляют 500 ед. эндонуклеазы рестрикции SalG в 200 мкл буфера

2, содержащего 150 мМ NaC1 в течео ние 12 ч при 37 С. Аналогично получают дуплекс из полинуклеотидов (VII 15 и VIII), который расщепляют обработкой 200 ед. эндонуклеазы рестрикции

Bgl II в 200 мкл буфера 2, содержащего 50 мМ NaCl в течение 12 ч при о

37 С. Оба рестрикта выделяют с помо- 20 щью гель-электрофореза в 8Х ПААГ.

Реакционную смесь, содержащую по

2 пмоль приготовленных дуплексов и

0,25 пмоль векторной ДНК, полученной из рМВ 124 совместным расщеплением 25 эндонуклеазами рестрикции .BamHI (50 мкл раствора, содержащего буфер

1 и 100 мМ NaC1 при 37 С 1 ч) и SalGI

Аналогично примеру 1 из полинуклеотидов (IX) и (Х), (XI) и (XII) получают дуплексы, которые затем расщепляют эндонуклеазами рестрикции BglII и SalGI соответственно. Реакционную смесь, содержащую по 2 пмоль приготовленных дуплексов и 0 25 пмоль векторной ДНК, полученной из рМВ 123 совместным расщеплением эндонуклеазами рестрикции BamHI u SalGI (условия 50 см. выше), обрабатывают 2 ед. ДНК-лигазы в описанных условиях. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки

Е.coli ВМН 7118. ДНК, выделенные из колоний, имеющих Еас фенотип, гибридизуют с - "-Р-мечеными зондами, полученными из полинуклеотидов (IX и XII) . ДНК, гибридизирующиеся с обоими зондами, дополнительно анализиру60

6 (условия см. выше) обрабатывают 2 ед.

ДНК-лигазы в описанных условиях. Лиглзной смесью трансформируют клетки г,coli ВМН 7118 (или JN 103). Из колоний, имеющих LacZ фенотип, гиб92 ридиэирующихся с P -мечеными зондами, выделяют ДНК и дополнительно анализируют с помощью Bspl, EcoRI u

PstI гидролиза.

Бактерии E.coli ВМН, содержащие плазмиды plL 58 со вставкой требуемого размера, выращивают в 100 мл LB среды. Для получения целевого субфрагмента, кодирующего часть гена человеческого интерлейкина-2 с заранее запланированными "липкими" концами, 15 мкг ДНК плазмиды рП 58 в

15 мкл буфера 1, содержащего 50 мМ

NaCl, обрабатывают 20 ед. эндонуклеазы рестрикции FokI или HgaI 1 ч при

37 С. Целевой фрагмент длиной 83 нуклеотидных пар выделяют с помощью электрофореза в 6 ПААГ. Структуру полученного фрагмента подтверждают методом Максама-Гилберта.

Описанным способом синтезируют полинуклеотиды ют с помощью Bspl u EcoRI + PstI гидролиза.

Колонии, имеющие плазмиды pIL 912 со вставкой требуемого размера, выращивают в 100 мл ЕВ среды. Для получения целевого субфрагмента, кодирующего часть гена человеческого IL — 2 с произвольными липкими концами, 15 мкг ДНК плазмиды pIL-912 в 150 мкл буфера. 1, содержащего 50 мМ NaC1, обрабатывают 20 ед. эндонуклеазы рестрикции FoRI или Hga 1 ч при 37 С.

Целевой фрагмент длиной 114 нуклеотидных пар выделяют с помощью электрофореза в 67 ПААГ .

Таким образом, предлагаемый способ получения субфрагментов ДНК с произвольными липкими" концами, основанный на применении плаэмпдных рМВ 124, 1446160

HgaI в полилинкере и при использовании для клонирования сайтов для рестриктаз SalGI, AccI, Hind II u BamHI появляется возможность получать уникальные "липкие" концы, определяемые структурой самого произвольно выбранного фрагмента ДНК, клонируемого по указанным сайтам. Это может позволить

10 использовать такие фрагменты в генетической инженерии для одновременной и направленной сборки нескольких фрагментов ДНК в системе in vitro.

Кроме того, уникальные "липкие" кон15 цы фрагментов могут позволить их раздельное мечение прн помощи Р, что з необходимо для определения первичных структур ДНК и для ряда других биохимических задач.

Формула изобретения

GGATGAGCGCTCGACAAGCTAGCTTGGATCCGCGTCATCCAC

ACGCCTACTGCGCAGCTGTTCGATCGAACCTAGGCGCACTAGGTCTTÀÀ, щиеся после расщепления эндонуклеазной рестрикции FokI; вставку субфрагмента для клонирования по SalGI u BamHI-сайтам полилинкерной области; емкость не менее 622 п.о.; штаммы-хозяева: штаммы Е.cali c

LacZ M15 фенотипом.

2. Способ конструирования вектора рМВ 124 для получения фрагментов jgfK с произвольными липкими концами, заключающийся в том, что плазмидную

ДНК рГ1В 123 дополнительно расщепляют эндонуклеазой рестрикции Hind III, достраивают липкие концы с помощью

ДНК полимеразы I — фрагмент Кленова и циклизуют ДНК-лигазой фага Т4, ВНИИПИ Заказ 6706 30 ираж 520 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 имеет существенные преимущества. Прежде всего, конструкция плазмидной ДНК рМВ 124, содержащей между попарньми сайтами эндонуклеаз рестрикции FokI и HgaI противоположной ориентации, набор сайтов для рестриктаз SalGI, AccI, HindII, Hind III, BamHI дает возможность в отличие от известного клонировать фрагмент из нескольких субфрагментов и, таким образом, получать протяженные химически синтезированные ДНК фрагменты..В примере 2 фрагменты клонированы из двух субфрагментов, что позволяет в несколько раз уменьшить объем биохимической и генно-инженерной работы при получении целевой последовательности ДНК. Несомненным преимуществом является использование при получении произвольных "липких" концов целевых фрагментов ДНК коммерчески доступных эндонуклеаз рестрикции РОКЕ и HgaI.

В некоторых случаях возможно ограничиться использованием только одной рестриктазы РоЫ, что значительно удешевляет сПособ получения фрагментов ДНК.

Благодаря наличию сайтов узнавания для эндонуклеаз рестрикции FokI u с попарными сайтами эндонуклеаз рестрикции FokI u HgaI противоположной полярности сайты для эндонуклеаз рестрикции SalGI, AccI, HindII u

BamHI фрагменты размером 11, 80, 100, 174, 260 область полилинкера, 267, 290, 434, 457, 587 п.о., образующиеся после расщепления эндонуклеазной рестрикции Bspl; фрагменты размером 26, 34, 67

110, 147, 200, 242, 404, 424 область полилинкера, 489, 500, п.о., образующиеся после расщепления эндонуклеазной рестрикции Мир?; фрагменты размером 8, 88, 181, 244, 287, 614, 1254 п.о., обраэую40

1.Вектор рИВ 124 для получения фрагментов ДНК с произвольнымй липкими концами с мол. массой 1,8 ИД, содержащий ЕсоКТ-PstI фрагмент ДНК плазмиды pUR 222 с геном р-лактомазы и частью модифицированного гена р-галактозидазы Е.coli, синтетический полилинкер размером 42 п.о., имеющий структуру