Способ получения мутантов по гену lys 5 у дрожжей sасснаrомyсеs cerevisiae

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, точнее к селекционно-генетическим работам с дрожжами-сахаромицетами, и может быть использовано для получения мутантов по гену LYS5 у дрожжейгсахаромицетов . Целью изобретения является поввпцение селективности отбора мутантов по гену LYS5 и сокращение времени на их влияние. Изо бретение заключается в том, что в отличие от известных способов получения мутантов lio гену LYS5 у дрожжей-сахаромицетов в качестве суспензии клеток исходного штамма используют суспензию штамма, несущего дупликацию гена LYS2i Суспензию обрабатывают мутагеном и высевают на селективную среду с об-аминоадипиновой кислотой, на которой в данном случае вьфастают практически только мутанты по гену LYS5. Такбй способ позволяет более чем в 10 раз увеличить селективность системы отбора мутантов по гену LYS5 и Примерно в 10 раз сократить объем теста на аллелиям, необходимого для выявления мутантов по гену LYS5 среди ауксотрофов по лизину, вырастающих на селективной среде с oi -аминоадипиновой кислотой. 2 табл. (Л с 4 4 со 01 00 О1

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (5д 4 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н Д ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

РО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4238719/31-13 (22) 29,04.87 (4б) 07,01,89. Бюл. Р 1 (71) Ленинградский государственный университет им.А.А.Жданова (72) Ю.И.Павлов, В.Н.Носков, Т.С,Тюлякова и С.Г.Инге- Вечтомов (53) 575.224.2 (088.8) (56) Chatoo В.В. et al., Selection

pf. lys 2 mutants of. the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization

4аш поайра . - Гепейсз, 1979, 93:

51-65. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТОВ ПО

ГЕНУ IYS5 У ДРОЖЖЕЙ SACCHARONYCKS

CEREVISIAE (57) Изобретение относится к микробиологической промьппленности, точнее к селекционно-генетическим работам с дрожжами-сахаромицетами, и может быть использовано для получения мутантов по гену LYS5 у дрожжей".саха"

„„SU„, 1449585 А1 ромицетов. Целью изобретения являет ся повышение селективности отбора, мутантов по гену ЬУЯ5 и сокращение времени на их влияние. Изобретение заключается в том, что в отличие от известных способов получения мутантов по гену LYS5 у дрожжей-сахаромицетов в качестве суспензии клеток исходного штамма используют суснензию штамма, несущего дупликацию гена LYS2. Суспензию обрабатывают мутагеном и высевают на селективную среду с аС --аминоадипиновой кислотой, на которой в данном случае вырастают практически только мутанты по гену 7ЛЯ5. Такбй способ позволяет более чем в 10 раз увеличить селективность системы отбора мутантов по гену LYS5 и 1тримерно в 10 раз сократить объем теста на аллелизм, необходимого для выявления мутантов по гену 1Л$5 среди ауксотро4ов по лизину, вырастающих на селективной среде с et, -аминоадипиновой кислотой. 2 табл.

1 1449585 2

PL/ 12, несущей дрожжевые гены LYS2 и ИП2, во II хромосому штамма 53Т53i27.

Штаммы выращивают в жидкой полной о среде на круговой качалке при 30 С до концентрации клеток 1 10 мл. Затем в,среду добавляют мутаген — 6-N55

Изобретение относится к микробиологической,промышленности, точнее к селекционно-генетическим работам с дрожжами-сяхаромицетами, и может быть использовано для получения мутантов по гену LYSS у дрожжей-сахаромицетов. .Цель изобретения — повышение се- лективности системы отбора мутантов по,.гену 1Л$5 и сокращение времени на их влияние.

Ф

В способе получения мутантов по ге у 1.YS5, заключающемся в обработке му агеном суспензии исходного штамма др жжей-сахаромицетов, высеве на селе тивную среду с са-яминоадипиновой ! ки лотой и отборе мутантов, с целью по мщения селективности системы отбо а мутантов и сокращения времени их выявления, в качестве суспенэии ис одного штамма используют суспензию кл ток штамма дрожжей-сахаромицетов, не ущего дупликацию гена 1Л$2.

Для получения мутантов по гену

LY 5 используют штаммы с дупликацией 25 гефа LY$2, Дупликации получают путем тр нсйормяции исходного штамма дрожжей-сахаромицетов плазмидой несущей в фвоем составе дрожжей ген 1Л$2, и интеграции этой плазмиды в одну из хромосом исходного штамма. В результате этого доза гена 1Л$2 удваивается Для образования мутанта по гену

LY 2 мутаген должен инактивировать дв копии гена 1Л$2 вместо одной, им вшейся у исходного штамма. Это пр водит к уменьшению доли мутантов по гену 1ЛЯ2 среди общего колнчества колоний, вырастающих íà eL-аминоадипя ге, и соответственно, увеличению доли мутантов по гену ЬУЯ5, Пример 1. В качестве исходны1с культур для получения мутантов по гену 1Л$5 используют штамм 53ТTl327 Saccharomyces cerevisiae генотипа atrp I his3-11, 151еи2-3, 112 и ш9 мм тря 1-537-Д327 (PLL 12) Saccharogyces cerevisiae генотипа atrp Х

his3-11; 151еи2-3, 112 LYS2,::LYS2 LEU2.

Штамм тря 1-53Т-Д327 (PLL 12) представляет собой дупликацию гена LYS2, 50 подученную путем интеграции плаэмиды гидроксиламинопурин в количестве

100 мкг!мл, Обработку проводят в течение 4 ч. Затем суспензию аликвотами по О, 1 мл высевяют ня чашки с селективной средой. После 5 дней инкуо бации чашек при 30 С отсевают вырос.шие на селективной среде колонии и, используя тест ня аллелиэм, выявляют среди них мутантов по гену LYS5, Данные отбора мутантов по гену

LYS5 у штяммов 53Т-Д327 и тра 1-53ТД327 (Р1Л. 12) после обработки 6-И-. гидроксиламинопурйном представлены в табл.1.

Из табл.1 видно, что штамма

53Т-Д327 основную массу отобранных ауксотройов по лизину представляют мутанты по гену LYS2 (99,9%) и лишь незначительную часть. мутанты по гену

LYS5 (1,1%). У штамма с дупликацией геня 7Л$2 тря 1-53Т-Д327 (PLL 12) наблюдаешься обратная тенденция — подавляющее количество отобранных ауксотрофов по лизину является мутантами по гену 1Л$5 (90,9%), Пример 2. В качестве исход- . ных культур для получения мутантов по гену 7Л$5 используют штамм 53ТД327 Saccharomyces cerevisiae (генотип указан в примере 1) и штамм тра

2-53Т-Д327 (Р1Л. 12) S.cerevisiae генотип atrp I his 3-11,151еи2-3.112::

LKU2 ЬУЯ2. Штамм тра 2-53Т-Д327 (РЫ, 1?) представляет собой дупликацию гена I-YS2 полученную путем интеграции плязмиды РЫ 12 в ЕХХ хромосому штамма 53 Г-Д327.

Для получения мутантов по гену

LYS5 используют мутаген P пропиолак" тон в дозе 20 мкг/мл, остальные условия те же„ что и в примере 1.

Данные отбора мутантов по гену

LYS5 у штаммов 53Т-Д327 и тра 2-53ТД327 (PLL 12) после обработки P-пропиолактоном представлены в табл.2..

Из табл,2 видно, что тенденция, обнаруженная ранее (пример 2), проявляется, когда используется иной мутаген и иная дупликация гена LY$2 а именно; у штамма с дупликацией ге" на LYS2 процент мутантов по гену

LYS5 (96,7) много выше, чем их процент у штамма, не имеющего дупликации (8,5).

Используя предлагаемый способ, можно повысить селективность системы отбора мутантов по гену ЬУ$5 по з

4 сравнению с базовым объектом как ми- лагаемым способом — примерно со нимум я 10 раз. Так, в соответствии 100 колониями. Такое значительное с базовым объектом из 100 колоний, сокращение объема теста на аЛлелиэм выросших на селективной среде после приводит к сокращению времени на обработки исходной суспензии Р --про- выявление мутантов примерно в 10 раз.

5 пиолактоном, только примерно 9 колоний (8,5Х) оказываются мутантами по Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я гену 1ЛБ5, а в соответствии с предлагаемым способом - примерно 97 ко10

Способ получения мутантов по гелоний (96,7%), т.е. почти все коло- ну ЬУЯ5 у дрожжей Saccharomyces нии. cerevisiae, заключающийся в обраОтобрано Отбор мутантов по гену

Штамм ауксотрофов по лизину

LYS2 . LYS5

53-Д327

88(99,97) 5(9,1Ж) 1(1 17) 50.(90,9X) Тра 1-53ТД327 (PLL 12) 55

Таблица2

Отбор мутантов по гену

Штамм

Отобрано аук сотрофов по лизину

LYS2 LYS5

53-Д327

89(91,5Ж) 7(8,5X) 89

Тра 2-53ТД327 (РТД.12) 60

2(З,ЗХ) 58(96,7X) Составитель Н.Кузенкова

Техред Л,Сердюкова КорректорА.Обручар Редактор И. Горная

Заказ 6934/28 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г . Ужгород, ул . Проектная, 4

Используя предлагаемый способ, можно сократить затраты времени на выявление мутантов по гену LYS5.

Так, в соответствии с базовым объек.— том для выявления 100-мутантов по гену 1Л85 надо провести тест на аллелизм примерно с 1000 колоний, выросших на селективной среде после обработки суспензии клеток Р --пропиолактоном, а в соответствии с предботке мутагеном суспензии клеток исходного штамма, высеве на селексреду c аминоадипиновой кислотой и отборе мутантов, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения селективности,системыот-! бора мутантов и сокращения времени

20 на их выявление, в качестве суспензии исходного штамма используют суспензию клеток штамма S.ñåãåviçÛÛ, не сущего дупликацию гена LYS2. .Т а б л и ц а 1