Рекомбинантная плазмидная днк рук11, кодирующая рестриктазу и метилазу е corii, способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент рестриктазы и метилазы е corii

 

Изобретение относится к микробиологии , в частности к технологии рекомбинантных ДНК, и позволяет получить рёстриктазу и метилазу Есо RII ферментов, используемых в научно-исследовательской практике. Целью изобретения является повыпение содержания рестриктазы и метипазы Есо RII в клетках бактерий, С этой целью ; сконструирована рекомбинантная ДНК pVK I, содержа1цая фрагмент ДНК с полными генами рестриктазы и метипазы Есо RII и левый промотор фага лямбда, обеспечивающий эффективную экспрессию генов Есо RII. pVKlI трансформирована в клетки Escherichia Есо RII не менее 50000 ед. каждого фермента на I г сырой биомассы клеток. 3 с.п. ф-лы. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СО!,1ИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (46} 30.09.90.Бюл. - 36 (21) 4249217/31-13 (22) 27.05,87 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) В. Г. Косых, И. В. Витенене и Я. И. Бурьянов (53) 575 ° 224 ° 2; 577.2(048)(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

В 1026407, кл, С 12 N 15/00, опублик.

1983. (54) РЕКО1БИНАНТНАЯ ПЛАЗ! !ИДНАЯ ДНК

pYKII, КОДИРУКЗЦАЯ РЕСТРИКТАЗУ И NE

ТИЛАЗУ Есо RII, СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHfA

COLI — ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ И NETHЛАЗЫ Есо RII

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой реком бинантную плазмидную ДНК, обуславливающую синтез рестриктазы и метилазы

Есо RII спрсрб конструирования данной рекомбинатной плазмидной ДНК и, штамм, содержащий эту рекомбинантную плазмиду — продуцент рестриктазы и . метилаэы Есо RII.

I Рестрикционная эндонуклеаза (рестриктаза) Есо RII и ДНК-метилтрансфе-. раза (метилаза) Есо RII широко ис" пользуются в научно-исследовательской практике (генетическая инженерия, структурно-4инкциоиальный анализ ДНК

„„SU,„, 3453896 А1 (57) Изобретение относится к микробиологии, в частности к технологии рекомбинантных ДНК, и позволяет получить рестриктазу и метилазу Есо RII ферментов, используемых. в научно-исследовательской практике. Целью изобретения является повышение содержания рестриктаэы и метилаэы Есо RII в клетках бактерий. С этой целью сконструирована рекомбинантная ДНК

pVK 11, содержащая фрагмент ДНК с полными генами рестриктаэы и метипаэы

Есо RII и левый промотор фага лямбда, обеспечивающий эффективную экспрессию генов Есо RII. Плазмида pVK1! транс- формирована в клетки Escherichia Eco g

RII не менее 50000 ед. каждого фермента на 1 г сырой биомассы клеток.

3 с.п. ф-лы.

С:

3аа4 изучение белок-нуклеинового взаимо-. действия и др.). Сл

Целью изобретения является увели- М чение содержания рестриктазы и мети- ОО лазы Есо RII в клетках бактерий. (©

1. Получена рекомбинантная плаэми-.

I да pVK1 !, обеспечивающая повышейный синтез рестриктазы и метилазы Есо RII.

:2. Разработан способ конструирова- ния рекомбинантной плазмиды pVKI1, м в которой гены рестриктазы и метнлазы Есо REI находятся под левым промотором фага лямбда (Р!), что обеспечивает эффективную экспрессию генов рестриктаэы и метилазы Есо RII, 3 ° Получен штамм Escherichie coli

ВКИ CR-288D, имеющий более высокий

Кпетки,.прямые, палочковндной фор мы (1,2-1,6)х(2,0"6,0) мкм, подвижграмотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо, растут на простых питательных средах.

При росте на мясо-пептоином ara-. ре, питательном arape "Дифко" колонии гладкие, круглые, прижатые, бле" стящие, серые, с ровнычи краями.

При росте в жидких средах - мясо-пептонном бульоне, питательном бульоне

"Дифко" образует ровную интенсивную муть е

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах 4—

45 С при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органичес" кие кислоты, в частности d-глюкозу, d-фруктозу, арабинозу, лактозу; трегалоэу. Не усваивает ацетат, аданит, галактоэу. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной н нитратной формах, так и в органической в виде пептона, аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатнну не разжижают.

Индол не образуют. Уреазная актив-. ность не обнаруживается.

Устойнивость к антибиотикам.

Проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием плазми", ды pVK 11, а также к канамнцину, обусловленную наличием плазмиды рС 1857.

Штамм Е. coli ВКИ CR-288D проявляет иммунитет к.фагу лямбда. Продуктивность штамма составляет

500000 ед. каждого фермента на 1 r сырой биомассы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример

Клетки бактерий Е. coli, содержащие плазмндную ДНК, выращивают в бульоне "Дифко" до титра 2х10 кл/мл.

Клетки . собирают центрнфугированнем н из них вьделяют ДНК, Полученные пре" параты ДНК плазмиды pLC 2833 и плазмиды yVK 33 используют для конструирования плаэмнды pVK 11. 2 мкг ДНК плазмиды pLC 2833 инкубируют с зндо-. нуклеазой рестрикции Pst Х (0,5 е).

Реакцию проводят при 37 С 1 ч. 3 мкг

ДНК плазмнды pVK 33 расщепляют эндонуклеаэой рестрикции Pst I (5 е).

: 14538у6 . 4 уровейь синтеза рестриктазы и метиаазы Есо RXX по сравнению <с известны ми штаммами " продуцентами ферментов ные, с перитрихиапьньии жгутиками, Есо КХХ. А. Плазмида pVKll,.кодирующая ре5 . стриктаэу и метиаазу Есо RXI состоит иэ ДНК вектфра pLC 2833 (размер кото. рого 2,8 TOO) содержащего левый про- мотор фага лямбда (Рь); Pst Х - фраг. мента ДНК плазмиды pVK 33, содержащего гены рестрнктазы и метилазы Есо

ЙХХ (размер которого 5 ТПО), и имеет . уникальные участки рестрикции для эндонуклеаэ Eco RI, Sal I, ХЬа I, рас- 15 положен-ные на расстоянии О,1 ТПО от промотора Р, селективные маркеры Ар

imm, хозяин Escherichia eoli.

В.. Для достижения цели используют сйособ конструирования плазмидной 20 .

ДИКА кодирующей рестриктаэу и,метилаэу Eco RII, заключающийся в том, что плазмидную ДНК pLG 2833 и ДНК

pVK 33 подвергают совместному гидроПизу зндоиуклеаэой рестрикции Pst I. 25.

Образовавшиеся фрагменты соединяют

ДНК лигаэой, затем полученной смесью рекомбинантных молекул трансформируют клетки E. coli C600 (Я+). Трансформан. ты высевают на среду с .ампициллином 30 и выросшие колонии проверяют на способность, рестрнктировать и модифицировать фаг лямбда хп vivo. Из отоб< раиных трансформантов вьделяют плазмидную ДНК, обозначенную как pVK В. Для достижения цели получен также штамм бактерий Echerichia coli

ВКИ CR-2880 - продуцент рестриктазы . . и метилазы Есо RII. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ AH СССР под номером BKN CR-2889.

Штамм - продуцент рестриктаэы.и . Йетилазы Есо RII получен трансформацией клеток Е. соЯ 3834/рС1857 45 плазмидной ДНК pVK. 11. Выбор штамма

E. соН В834(рС1857),обусловлен тем, <что штамм не содержит интерферирую их с ферментами Есо RII примесей и содержит плаэмиду с геном термочувст- 5О вительного репрессора cI фага ляйбда.

Содержаний рестриктаэы и метилазы

Есо RII в сконструированном штамме равно 500000 ед. каждого фермента на

1 r сырой биомассы клятОе 56

Штами Escherichia coli ВКИ CK288D характеризуется следующими при знаками;

Иорфологические признаки.

6 6 ную как pVK 11 и содержащую в своем . составе три фрагмента, которые обра.зуются при гидролизе плазмидной ДНК эндонуклеаэой рестрикции Pat I °

Выделенную .ДНК pVK .11 трансформируют в штамм Е. coli В834/рС1857

Трансформаиты отбирают на среде, содержащей ампициплин (50 мкг/мл) -и канамицин (25 мкг/мл). Плаэмида рС1857 несет термочувствительную мутацию в гене репрессора CI. Таким образом можно увеличить транскрипцию, эа счет температурных условий культи вирования.

Клетки E. co 1 i B834/pC1857/pVK11 выращивают при 28 С до плотности 24 10 кл/мл, резко повышают температуру до .42 С и проводят инкубацию в . течение 4 ч. Клетки собирают центрифугировакием, ресуспендируют в буфере 0,01 М калий-фосфат (рН 7,0), 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптозтанол;

0,4 мМ NaC1, разрушают ультразвуком.

После разрушения центрифугируют (100000 g, 1 ч, 0 С). Бесклеточный экстракт используют для определения ферментативной активности. Активность .метилазы определяют в реакционной смеси общим объемом 150 мкл, содержащей 40 мМ калий-фосфат (рН 7,8), 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптозтанола, 20 мкг ДПК К. coli B834, 4 мМ $-аденозила (метил- kl) метионина и 50 мкл

5 фермента в различных разведениях.

Реакцию проводят 1 ч при 37 С,,добавляют равный объем О, 75 N н атриевой щелочи, инкубируют 30 мин при 60 С.

Затем к пробам добавляют 2 мл воды и

2 мл 10Х трихлоруксусной кислоты.

Осажденную ДНК наносят на стекловолокнистые фильтры, прбмывают 0,01 М

НС1 и спиртом. После просушки фильтров считают радиоактивность. 3а еди ницу активности метилазы Есо RII . принимают то количество фермента, которое в указанных условиях включает

1 пкМ СН вЂ” групп в ДНК за 1 ч при

37 С. Активность рестриктазы Eco RII определяют в смеси 20 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 10 мМ МяС1, 50 MH NaC1, 1 мкг ДНК плазмщ ы pBR 322 (из Е. cali B834/pBR322) и различные разведе ния фермента. Реакцию ведут 15 мин при 37 С. Продукты гидролиза ДНК анализируют в 1Х агаровом геле. За едк- ницу активности принимают,то количество фермента рестриктазы Eco RII, которое необходимо для полного рас5 145389

Пробы после инкубации крогревают при о

65 С 10 мин. Продукты гидролиэа ана" лизируют электрофоре зом B 1Я-ном аг.а- . роэиом геле.

Соединение фрагментов ДНК йлазиид

5 проводят в буфере для рестрикции е добавлением АТФ и дитиотраитола до конечной концентрации I и 5 мМ соответственно и ДНК-лигазы (10 е).

Реакцию проводят 10-,12 ч при 1416 С. Полученную смесь плазмид используют для трансформации клеток

Е. coli С600 (Л ). Клетки E. coli

С600 (Л+) вносят в 10 мл питательного бульона и выращивают до титра Iх х10 кл7мл. Клетки собирают центриВ фугированием (5000 g, 10 мин, 0"С), суспендируют в 10 мл 0,2 М р-ра СаС1 и выдерживают 1 ч при ООС. Клетки 2р повторно собирают центрифугированием, ресуспендируют в 0,5 мл 0,08 М СаС1 (О С) и испольэуют для трансформации.

Смесь лигированных фрагментов ДНК инкубируют с клетками E. coli 25

B834/рС1857, обработанными раствором

СаС1, ч при 0 С и 10 мин при комнатной температуре (18-20" С). После .десятикратного разбавления суспензии питательным бульоном трансформирован- ЗО кые клетки подращивают 2 ч при 28 С и высевают на агаризованную среду с амнициллнном (50 мкг/мл). Клетки, выросшие на среде с антибиотиками, проверяют на pacTpHK+H!o и модификацию 35 фагаЛ системой Eco RII, Степень рестрикции фага Л vir, выращенного на штамме Е, cali С600, оп. ределяют сравнением титра фага при посеве его на штаммы Е. coli С600 4р (Л ) и Е. coli C600/р7КЗЗ и клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды.

При высеве фага на клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды, несущие гены рестриктазы и метилазы Есо RII 45 . они ограничивают рост фага по сравне" нию со штаммом,С600 (Л+) на два порядка, как и на штамме С600/р7КЗЗ. Фа ги, выросшие на этих клонах, содержащих рекомбинантные ДНК, высевают на штаммы С600 (Л+) и С600/р7КЗЗ, Фаги, выросшие на клонах, содержащих рекомбинантные плазмиды, несущие гены

Есо RII, дают одинаковый титр как иа штамме С600 (Л }, TBK H ía штамме

С600/р7КЗЗ.

Иэ клеток клонов, обеспечивающих рестрикцию и модификацию фага h vir„ выделяют плазмидную ДНК, обозначенl453896 . 8 ще леиия мкг ДНК рВВ 322 за )5 мнн ori репликацин плазмнды рВЕ 322! се" епле при 37аС. Йектицные маркеры: Ap 1ппп ; хозяИзобретенне; позволяет получить ин - Escherichia eo1.k, "етееем продуцен Рестриктазы и ме 5 типазы Есо. RXX с овн ур ем синтева в 2. Способ конструирования плазмид- .. этих ферментов не менее 500000 ед. ной ДНК pVK 11, кодирующей рестриктакщкдого íà l r сырой биомассы клеток.,i sy и метилазу Есо RII, заключающийся что в !О раз вьиие уровня синтеза зтнх в том, что ДИК плазмиды р!.С 2833 и,. ферментов в сравйении с лучпп н из fo ДНК плазмиды pVK 33 подвергают гидро.нзвестных штаммов. лизу зндонуклеазой рестрикции Рой I, . полученйые *рагменты смешивают н соФ о р м у л а i u s о 6 р е т е и и я - единяют ДНК-лигазой, затем смесью ре- комбинантных молекул трансформируют

VK !! ко

1, Рекомбинантная плазмидная ДНК 1В клетки Е с li C600 (Л+) транс орф и ° исдируееееи рестриетееу и ме- меитм высееиот ие среду с ем*ицииии-. тилнзу Есо RII> размером 7,8 т.пео, ном и выросшие клоны проверяют на содержащая ДНК вектора AC 2833, раз- способность рестриктировать и модифимером 2,8 т II.o, с левым промотором цировать фаг лямбда из клонов котоl !

Э .фагот лямбда (Р1)! Pst X - фрагмент 20 рые рестриктировали и модифицировали.

ДНК плазмиды yVK 33 с геном рестрик- фаг лямбда со специфичностью системы

Тазы н метилазы Eco RII размербм Есо RII, выделяют плазмидную ДНК

5,0 т.п.о.; уникальные участки ре- pVK 11. стрикции для эндонуклеаз Есо kl, 3. Штамм бактерий Escherichia соХЬа Х, За1 I, расположенные на рас- 2 li BKM СВ.-288D - продуцент рестрикта.стоянии О,-1 т.rt.o от промотора Р, зы.и метилазы Eco RII.

"Составитель Т. Забойкина

:,Редактор T. Куркова 1ехред М.Ходанич) Корректор М.Пожо юеед е ее ееем ю

I. . Заказ 3335 .:Тираж 493! . Подписное .ВНИИПИ Госжарственногр коы ета по изобретениям и Открытиям при ГКНТ СССР

3!3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., -д. 4/5

Производственно;полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 -