Штамм бактерий viвriо сноlеrае сноlеrае серовара огава- продуцент холерного токсина

 

Изобретение относится к области микробиологии. Цель изобретения - повьштение выхода целевого продукта. Штамм V.cholerae cholerae серовара Огава получен путем конъюгативного введения гибридной плазмиды в клетки штамма Дакка 35, депонирован под номером КМ68 рС0107-2. Характерная особенность штамма - прототроф. Продуцирует в питательную среду 35-45 мг токсина на 1 л культурального фильтрата .

СОЮЗ СОВЕТСНИХ . СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (!И

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMY СВИД=ТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

IlPN ГННТ СССР (21) 4260558/28-13 (22) 10.06.87 (46) 07.02.89, Бюл. Ф 5 (7 1) Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт ,"Микроб" и Институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи (72) Н.И.Смирнова, Л.Ф.Ливанова, А.Л.Гинцбург, Н.В.Янишевский, Ю.В.Вертиев и Т.С.Ильина (53) 576.8.097 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

11 1400075, кл. С 12 N 15/00

А 61 К 35/74, С 12 R 1:63, 01.04.87.

Изббретение относится к микробиологии,, а именно к получению штамма холерного вибриона классического биовара, серовара Огана, продуцирующего и секретирующего холерный токсин.

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта.

Штамм U. cholerae cholerae КИ68 создан путем конъюгативного введе ния гибридной плаэмиды рС0107-2 в клетки выделенного от человека прототрофного штамма Ч.cholerae cholerae Дакка 35 серовара Огава. Плазмида рС0107-2 содержит оперон vct, детерминирующий синтез холерного токсина, и является производной плазмиды рС0107, содержащей мини-транспо-. зон, определяющий реэистентность к канамицину. В результате введения в клетки штамма Дакка 35 плазмиды рС0107-2 получены клоны, устойчивые (51)4 С 12 К 1/20, 15/00, А 61 К 35/74//(С 12 N t/20, С 12 R 1:63) .(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ UIBRIO CHOLERAE

CHOLERAE СЕРОВАРА ОГАВА-ПРОДУЦЕНТ

ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА (57) Изобретение относится к области микробиологии.. Цель иэобретения— повышение выхода целевого продукта.

Штамм Ч.cholerae cholerae серовара

Огана получен путем конъюгативного введения гибридной плазмиды в клетки штамма Дакка 35, депонирован под номером КМ68 рС0107-2. Характерная особенность штамма — прототроф. Продуцирует в питательную среду 35-45 мг токсина на 1 л культурального фильтрата.

2 к тетрациклину и канамицину, вырабатывакицие заметно большее количество токсина по сравнению с исходным штаммом. Штамм депонирован под номером КМ68 pCOt07-2 и характеризуется

,следующими признаками.

Культурально- морфологические признаки. Подвижные, слегка изогнутые палочки.

На твердых питательных средах растет в виде круглых серовато-голубоватых полупрозрачных колоний. При посеве в бульон вызывает равномерное помутнение этой среды.

Прототроф. Физиолого-биохимические свойства.

Ферментирует до кислоты без газа манноэу, сахароэу, маннит, мальтозу.

Не ферментирует лактозу и арабиноэу.

Не лиэирует эритроциты барана, не агглютинирует куриные эритроциты. 3 . 145646

Не растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина.

Чувствителен к холерномудиагностическому фагу С.

Агглютинируется до титра холерными диагностическими сыворотками

0(1:3200) и Огава (1т 1600).

Патогенные свойства.

Вирулентен для кроликов-сосунков 10 в весьма небольших дозах 10—

10 м.т../мл.

lI p и м е р. Высушенную ампульную культуру штамма V.cholerae cholerae

КМ68 засевают на агар Хоттингера iS рН 7,6, содержащий 5 мкг/мл тетрациклина или 50 мкг/мп канамицина и инкубируют 18 ч при 37 С.

Для количественного определения холерного экзотоксина используют 20 иммуноферментный метод Gm ELISA. В качестве контроля и для определения чувствительности метода используют очищенный. препарат холерного токсина.

Клетки штамма КМ68 и исходного штам- 25 ма Дакка 35 в объеме 10 мл выращиваап .18 ч при 30 С .в 0,1.л. колбах в среде, содержащей З казаминовых кислот и 0,5Х .дрожжевого экстракта при рН 7,6. Клетки осаждают центрифуги- 30 рованием, в супернатанте определяют экзотоксин. Пробы инкубирут в течение часа в сенсибилизированной ганглиозидами поверхности. лунок микроплат.

Инкубацию с антитокСической противохолерной сывороткой, разведенной

1:200, проводят в течение 18 ч при комнатной температуре. После промывания 0,05 М. фосфатным буфером рН 7,2 в лунки добавляют по 0,2 мп 40 раствора иммуноферментных конъюга-. тов в разведении. 1: 150. Конъюгаты состоят из А-белка стафилококка и пероксидазы. Реакцию учитывают через

30 мин после добавления субстратаО, 003 перекиси водорода в О, 15 И

NaC1 и п-фенилендиамина..Чувствительность метода в данной серии опытов. составляет 1 нг/мл.. Штамм КМ68

8 продуцирует 35-45 мг токсина на 1 л культурального фильтрата, исходный

1 штамм Дакка 35-6-8 мг/л, а известный штамм — 12 мг/л. Для получения экзотоксина и титрации его в кожной. пробе по Крейгу агаровые культуры штаммов V.cholerae cholerae KM68 и Ч.cholerae cholerae Дакка 35 засевают в пробирки казаминового (казаминовые кислоты 30 г/л, дрожжевой экстракт

5 г/л, рН 7,6) или казеинового бульона с 2-3 мкг/мл тетрацнклина или с

25 мкг/мл канамицина и выращивают при интенсивной аэрации 16-18 ч при

30 С. Затем культуру центрифугируют при 400 g 15 мин, к супернатанту добавляют мертиолат натрия в конечной концентрации 1:5000. Полученный экзотоксин титруют в кожной пробе по

Крейгу на трех кроликах. Препарат раститровывают двукратно, начиная с концентрации 1:100, и вводят внутрикожно в количестве 0 1 мп. Учет проводят через 24 ч.

В случае штамма КМ68 положительная реакция зарегистрирована в разведении токсина 1:6000 — 1:8000, у ис- . ходного штамма Дакка 35 — 1: 16001: 1800 у известного штамма — 1:8001: 1300.

Таким образом, созданный штамм

V.cholerae cholerae КМ68 рС0107-2 серовара Огана является гиперпродуцентом специфического холерного экзотоксина, секретирующегося во внешнюю среду, и может быть использован в качестве производственного штамма для получения холерного токсина и его В-субъединичного комплекса, также для создания синтетических противохолерных вакцин.

Формула

45 изобретения

Штамм. бактерий Vibrio cholerae

cholerae серовара Огава КМ68 рС0107-2-продуцент холерного токсина.

Составитель Г.Смирнова

Техред Л.Олийнык Корректор Л.Патай

Редактор Г.Гербер

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Заказ 7521/23 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5