Штамм бактерий вrаdyrнizовiuм sp.(lотus) для производства бактериального удобрения под лядвенец рогатый

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для производства бактериального удобрения под бобовую культуру лядвенец рогатый. Целью : изобретения является получение нового штамма клубеньковых бактерий, повышающего при инокуляции лядвенца рогатого , урожай зеленой массы и содержание в ней общего азота. Штамм Bradyr- hizobium sp. (Lotus) выделен из клу-.. 6eHbkoB лядвенца рогатого. Штамм Bradyrhizobium sp, (Lotus) депонирован и хранится в колллекции ВНИИСХМ под № 476. Новый штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium sp. (Lotus) ВНИИСХМ № 476 по сравнению со неинокулированньм контролем (спонтанной природной популяцией) в вегетационных опытах повышает урожай зеленой массы лядвенца рогатого на 32,9-50,6% и содержание общего азота на 0,47-1,35%, в полевых - урожай зеленой массы на 25,1.-35,5%. 3 табл. (Л С

CQO3 СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

5 А1

09) (И)

y)) 4 С 05 F 11/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ с

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ., (21) 4201402/31- 1 3 .:(22) 27.02.87 (46) 15.02.89. Бюл. В.б (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии 1 (72) А ° Т ° Новикова, В.Л. Князева, Н.М. Лазарева, А.П. Кожемяков и Н.Г. Орищенко (53) 576.8.631.84(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР.

Ф 489750, кл. С 05 F 11/08, 1976. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BRADYRHIZOBIUN

SP. (LOTUS) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД ЛЯДВЕНЕЦ РОГА- .

ТЫЙ (57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может. быть использовано для производства бактериального удобрения под бобовую

Изобретение относится к микробио-. логическим средствам повышения урожая бобовых культур и представляет собой штамм клубеньковых бактерий для инокуляции лядвенца рогатого.

Цель изобретения — получение но-. вого штамма клубеньковых бактерий, повышающего при инокуляции лядвенца рогатого урожай зеденой массы и со». держание в ней общего азота.

Штамм Вгас1угЫгоЬ3лип sp. (Lotus)

476 выделен из клубеньков лядвенца рогатого.

Штамм клубеньковых бактерий лядвенца рогатого Bradyrhizobium

sp. (Lotus) депонирован и хранится в коллекции ВНИИСХМ под У 476. культуру лядвенец рогатый. Целью изобретения является получение нового штамма клубеньковых бактерий, повышающего при инокуляции лядвенца рогатого. урожай зеленой массы и содержание в ней общего азота. Штамм Bradyrhizobium sp.(Lotus) выделен из клу- .. беньков лядвенца рогатого. Штамм

Bradyrhizobium sp. (Lotus) депонирован и хранится в колллекции ВНИИСХМ под У 476. Новый штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium sp. (Lotus)

ВНИИСХМ У 476 по сравнению со неинокулированным контролем (спонтанной природной популяцией) в вегетационных опытах повьппает урожай зеленой массы и лядвенца рогатого на 32,9-50,6Х и содержание общего азота на 0,47-1,35Х, в полевых — урожай зеленой массы на

25,1.-35,5Х. 3 табл.

4ь

Культурально-морфологические признаки штамма Bradyrhizobium sp. (Lotus) р)

476.

Культивировать штамм 476 можно на гороховом, люпиновом и маннитнодрожжевом агаре.

Ж

1. Гороховый агар, г/л: горох

100,0; сахароза 20,0; агар-агар 20,0; рН среды 6,8-7,0.

Величина клеток 2-суточной культуры на гороховом агаре 1,2-1,9х0,60,9 мкм. Короткие палочки, слегка изогнутые подвижные в молодом возрасте.

Перитрихи. Бактероиды имеют вильчатую форму. Грамотрицательные. Медленно растущая культура. Штрих обильный, сли- . зистый, бесцветный. Колонии однотипные, 1458359 беловатые, круглые, слизистые,с четкими краями,3-5 мм в диаметре, появляются на 4-е сутки.

2. Люпиновый агар, г/л: К НРО Оф5; 5

КН Р04 0,5; MgSO@>7H<0 0,2; NaCl 0,2;

Са$0 О, 1 ; (NH4) МоΠ— следы; маннит

20,0; люпиновая мука 10 6- агар-агар

20,0; рН среды 6,8-7,0.

Штрих обильный, слизистый, белова- 10 тый. Колонии отнотипные, беловатые, круглые, слизистые, слабо растекающиеся, 4-5 мм в диаметре„ появляются на 4-е сутки.

3. Маинитно-дрожжевой агар, г/л: 15 маннит 10,0; К НРО 0,5; MgS04, 7Н О

0,2; NaC1 0 1; дрожжевой экстракт

0,4; агар-агар 15 0, рН среды 6,87,0.

Штрих обильными, слизистый, бесцветный, стекающий. Колонии однотипные, беловатые, круглые, слизистые, растекающиеся, 4-6 мм в диаметре,появляются на 4-е сутки. !

Физиолого-биохимические признаки

; штамма Bradyrhizobium зр. (Lotus) 476. !

Молоко с лакмусом не пептонизирует, подщелачивает с образованием слизистой зоны на поверхности. Желатину не разжижает Аэроб. Оптимальная температура 26-28 С.

Отношение к углеводам. Используемые многие углеводы с подкислением среды. Хорошо растет на средах с глю козой, галактозой, маннитом, рамноэой, менее активно — с декстрином, 35 сахарозой, мальтозой, лактозой, слабо. — с ксилозой и сорбитом. Клетчатку и крахмал не усваивает.

1 40

Отношение к источникам азота. Хорошо растет на средах с азотнокислым натрием, аммонийными солями, тирози ном. На МПА бактерии не растут. Признаки штамма устойчивы. Штамм не пато- 45 генен; Хранится íà rapoxosoM arape при 4-5О и пересевается один раз в

6 месяцев. Штамм Bradyrhizobium

sp. (Lotus) 476 идентифицирован по определению Bergey s Nanual. of

sistematic bacteriology, 1984.

Методика приготовления препарата для инокуляции лядвенца рогатого на основе штамма клубеньковых бактерий

Bradyrhizobium sp. (Lotus) 476.

Технология получения препарата включает следующие операции:

1. приготовление жидкой посевной культуры;

2, приготовление жидкой рабочей культуры;

3. подготовка торфа и его гаммастерилизация;

4. заражение торфа рабочей культурой;

5. подращивание бактерий в торфе.

Приготовление жидкой посевной куль туры. Жидкую культуру выращивают в качалочных колбах и в пятилитровых бу; тылях в течение 2 суток на среде следующего состава, мас. 7.: гороховый отвар 10 0; сахар (пищевой) 1,0 (NH4)ISO О,05; КН РО 0,05; КуНРО х х ЗН О 0,5; fgSO<7H>0 0,2; САСО> 0,1; вода водопроводная — остальное. рН после. стерилизации 6,8-7,0. Титр

5-8 млрд./мл.

Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культуры в пятилитровых бутылях или ферментаторах на среде следующего состава, мас. Ж; кукурузный экстракт 1,0 ; меласса 2,0; (НН4) 80» О, t; KHgO 0,025;

К НРО «ЗН О 0,025; HgSO «7Н О 0,02;

СаС03 0,1; вода водопроводная — остальное. рН после стерилизации 6,87,0. . Бутыли и ферментаторы засевают по" севной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5Х. Бутыли встряхи. вают на качалке в течение 40-48 ч.

В ферментаторах бактерии выращивают

18-36 ч при аэрации 0,7-1,5.об/мин под избыточным давлением 0,3-0,5 ати при 28-30 С. Титр не менее 5 млрд./мл.

После микробиологического контроля культуральную жидкость. иэ бутылей или ферментаторов — инокулюм — используют для смешивания с торфом.

Подготовка торфа. Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7,2 с влажностью 30-. 40X в полиэтиленовых пакетах до 200-400 r стерилизуют гамма"облучением при дозе 2,5 Мрад. Стерильный торф в . пакетах инокулируют инъекцией смеси: культуральная жидкость + меласса (63) из расчета исходного титра, бактерий 0,3-0,5 млрд../г торфа и влажности 45-60Х. Затем пакеты загружают в специальные смесители, при вращении которых перемешивается их содержимое.

Культуру в торфе подращивают выдерживая пакеты 3«5 суток при 15-20 C затем пакеты хранят при температуре

3-8 С в темном сухом помещении.от дельно от ядохимикатов.

1458359

Характеристика готового продукта.

Ризоторфин для лядвенца на предлагаемом штамме представляет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета без запаха, нерастворяемую в воде. Влажность готового препарата 50-55Х. Ризоторфин содержит 4-6 млрд. клубеньковых бактерий на 1 r, препарата. Срок годности препарата 6 месяцев со дня.изготовления. Расход препарата 200 г на гектарную норму семян, Технология предпосевной инокуля; ции семян лядвенца.

Для инокуляции семян лядвенца в ! вегетационных опытах выращивали чистую культуру предлагаемого штамма на скошенном гороховом arape. Культуру смывали водопроводной водой и наносили на семена лядвенца, разложенные в лунки в почве каждого сосуда. В

S сосуд вносили 10 клеток.

В полевых опытах семена лядвенца обрабатывали торфяным препаратом— ризоторфином, изготовленным на штамме 476. Для этого 200 г препарата разводили в 1 л водопроводной воды,и не давая суспензии отстаиваться, наносили ее на гектарную норму семян (10 кг/га). Затем семена тщательно . 30 перемешивали до равномерного. распределения препарата. Обработанные риэоторфином семена высевали в. тот же день во влажную почву.

Методика проведения вегетационных 35 и цолевых опытов. Вегетационные опыты проводили в сосудах с 6 кг дерново-подзолистой почвы с внесением солей по прописи Прянишникова, но без азота. Повторность опыта 4-кратная. 40

Использован районированный сорт лядвенца рогатого Весело-Подолянский.

Полевые опыты проводили на хорошо окультуренных дерново-подзолистых почвах. Площадь делянки 50 м2 . Пов- 45 ,торность 4-кратная.

Применение препарата на основе штамма Bradyrhizobium sp.(Lotus) 476 для инокуляции лядвейца рогатого.

Пример 1. В вегетационном опыте с лядвенцем рогатым быпо проведено сравнение эффективности штамма Bradyrhizobium sp.(Lotus) 476 со штаммом клубеньковых бактерий, используемым для получения препарата под горох Rhizobium leguminosarum

250а (штаммов клубеньковых бактерий

\ - ° для повьппения урожая лядвенца рогатого пока не предложено).

Методика проведения опытов и приготовления препарата аналогична описанной. с

Данные по примеру 1 приведены в табл. 1.

Приведенные в табл. 1 данные свидетельствуют о том, что клубеньковые бактерии из группы К. leguminosarum не эффективны на лядвенце рогатом, высокая прибавка урожая получена лишь в варианте с инокуляцией этого растения специфичными для него клубеньковыми бактериями лядвенца.

Пример 2. Эффективность симбиотической азотфиксации у штамма

Bradyrhizobium sp..(Lotus) 476 определена в вегетационных и полевых опытах по величине урожай зеленой массы лядвенца рогатого и накопление в ней азота или протеина в сравнении со спонтанным заражением растений

I природной популяцией специфичных для лядвенца клубеньковых бактерий, находящихся в почве (вариант без инокуляции).

Результаты.вегетационных опытов приведены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, клубеньковые бактерии лядвенца штамма 476 активно фиксируют атмосферный азот в симбиозе с лядвенцем рогатым,в результате чего урожай зеленой массы растений, бактеризованных этим штаммом, на 32-50Х выше, чем у растений без инокуляции.

Содержание общего азота у растений в варианте с инокуляцией штаммом 476 увеличивается на 0,47-0,99Х. В итоге общее накопление азота у растений, бактеризованных штаммом 476, в 1,62,8 раза выше, чем у неинокулированных.

Пример 3. Эффективность штамма 476 была определена в полевых опытах на районированных сортах лядвенца.

Результаты опытов представлены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, предлагаемый штамм обеспечивает повьппение урожая зеленой массы лядвенца рогатого в среднем на 37,4 ц/га (33,0X) и увеличение содержания в урожае протеина в среднем на 1,ОХ.

1458359

Формула изобретения

Штамм бактерий Bradyrhizobium

sp. (Lotus) ВНИИСХМ Р 476 для произ водства бактериального удобрения под лядвенец рогатый.

Таблица 1

Сравнительная эффективность штаммов Bradyrhizobium

sp. 476 и Rhizobium 1eguminosarum 250а при инокуляции лядвенца рогатого

Вариант инокуляции

Урожай зе- Прибавка урожая леной массы, г/сос ° г/сос ° Ж

Без инокуляции

9,5

1,06, Шт..250а

Шт. 576

О 2

1,05

13 3

3,8

40,0

2,41

P 2,8%; НСР() 1,0 г/сос.

Таблица 2 !

1, Эффективность симбиотической азотфиксации штамма Bradyrhizobium

sp. (Lorus) 476 в вегетационных опытах

Накопление

Сорт лядвенца

Урожай надземной

Прибавка урожая

Вариант инокуляции

Статистическая обработка

r/сос

Hcpo g, г/сос массы, г/сос в растениях, Е

Без ино- 16,8 куляции

Весело-Подолянский

1, 74 292

8,5 50 6 2,78 691

1,8

1,9

Шт. 476 25,8.Без ино- 16,1 куляции

1,4

2,00 322

Гельсвис

1,2

5,3, 32,9 2,47 529

Шт. 476 . 21,4

Таким образом, получен новый штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium

sp. (Lotus) ВНИИСХМ Р 476, повышающий при инокуляции урожай зеленой массы и содержание в ней общего азота ляд5 венца рогатого.

Содержание общего азота

Содержание общего азота в растениях, 7 азота на сосуд, мг

1458359

Таблица 3

Эффективность штамма Bradyrhizobium sp. (Lotus) 476 в полевых опытах

Сорт лядвенца

Прибавка урожая ц/га

P Х массы, м/га

Всего Прибавка

16,1

Московский

Без ино- 55,0 куляции

8,0 6 5

Шт. 476 67,8

Без ино- 162 куляции

Шт. 476 233

42 8,8

Дединовский

Среднее

Без ино- 113,5 куляции

37,4 33.0 15,2 1.0

Шт. 476 150,9.Составитель А. Кураков

Редактор А. Огар Техред К.Дидык Корректор М. Шароши

1.

Заказ 323/27 Тираж 392 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, И-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Вариант инокуляции

Урожай зеленой

Содержание протеина 8 урожае, Х от инокуляции

13,8 25,1 16,6 0,5

12,2

610 355 128 16

14,2

Статистическая обработка

НСР >, ц/га