Способ контроля генетической однородности мышей инбредных линий

 

Изобретение относится к биологии и может быть использовано для генетического контроля количества инбредных животных. Целью изобретения -является упрощение способа. На инбредных мышах с каждым конкретным гаплотипом Н-2 индивидуально получают полиспецифические аллоиммунные сыворотки против антигенов других гаплотипов Н-2, что позволяет при проверке на гомозиготность инбредных мышей, имеющих определенный гаплотип Н-2, использовать панель сывороток, полученных на мышах с этим гаплотипом , а тестирование животных проводить с применением метода гемагглютинации . Если тестируемые инбредные мыши имеют стандартный гаплотип Н-2, серологическая реакция будет отрицательная . В случае контаминации мьш1ей исследуемой линии одна из сывороток панели даст положительную реакцию. 4 табл. а (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 424301 2/28-13 (22) 30.03 ° 87 (46) 15.02.89. Бюл. )i - 6 (71) Всесоюзный онкологический научный центр AMH СССР (72) Н.Н. Клепиков, Л.С. Павлова, Л.Я. Шевякова и С.А. Хрусталев (53) 575.148(088.8) (56) Дж, Снелл,.Ж. Доссе, С, Нэтепсон. Совместимость тканей, M.: Мир, 1979, с. 498. (54) СПОСОБ КОНТРОЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ

ОДНОРОДНОСТИ МИНЕИ ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЙ (57) Изобретение относится к биологии и может быть использовано для генетического контроля количества инбредных животных. Целью изобретения является упрощение способа. На

ИзоЬретение относится к биологии и может Ьыть использовано для генетического контроля качества инбредных живо тных, Цель изобретения — упрощение спо-. соба.

На инЬредных мышах с каждым конкретным гаплотипом Н-2 индивидуально получают полиспецифические аллоиммунные сыворотки против антигенов других гаплотипов Н-2, что позволяет при проверке на гомозиготность инбредных мышей, имеющих определенный гаплотип Н-2, использовать панель сывороток, полученных на мышах с этим гаплотипом, а тестирование животных .проводить с применением только метода гемагглютинации. Если тестируемые (5ц 4 G 01 N 33 50 С 12 N 15 00 инбредных мышах с каждым конкретным гаплотипом Н-2 индивидуально получают полиспецифические аллоиммунные сыворотки против антигенов других гаплотипов Н-2, что позволяет при проверке на гомозиготность инбредных мышей, имеющих определенный гаплотип

Н-2, использовать панель сывороток, пОлученных на мышах с этим гаплотипом, а тестирование животных проводить с применением метода гемагглютинации. Если тестируемые инбредные мыши имеют стандартный гаплотип Н-2, серологическая реакция будет отрицательная, В случае контаминации мышей исследуемой линии одна из сывороток панели даст положительную реакцию.

4 табл. инбредные мыши имеют стандартный гапло тип Н-2, серологическая реакция отрицательная, При контаминации мышей исследуемой линии одна из сывороток панели дает положительную реакцию. В случае получения полиспецифических аллоиммунных сывороток против Н-2 антигенев на мышах конгеннорезистентных линий, контроль генетической однородности инбредных мьппей можно осуществлять как с помощью реакции гемагглвтинации, так и с помощью цитотоксического теста. Полученные полиспецифические аллоиммунные сыворотки могут быть использова. ны как с применением известного метода гемагглютинации в пробирках, так и с применением предлагаемого

14588

35 метода в микрокамере для иммунологических реакций.

Пример 1. Проверка активности полученных полиспецифических аллоан5 тисывороток с применением известного метода гемагглютинации (макрометод в пробирках). От тестируемых животных получают кровь из ретроорбитального синуса, выделяют и отмывают 10 эритроциты и готовят их 2%-ную суспензию на фосфатно-солевом буфере рН 7,4. В пробирки для гемагглютинации раскапывают по 100 мкл полученных аллоантисывороток, разведенных 15 в фосфатно-соленом буфере рН 7,4, содержащем 1% поливинилпирролидона и 0,1% бычьего сывороточного альбу.мина. Затем к иммунным сывороткам добавляют по 50 мкл 2%-ной суспензии тестируемых эритроцитов, Инкубируют при комнатной температуре 1,5 ч, центрифугируют 30 с, добавляют в каждую пробирку 0 5 мл физиологического раствора и с помощью пастеровой пи- 25 петки смывают эритроцитарную бляшку, учитывая таким образом силу реакции.

Полученные результаты с использованием известного метода представлены в табл. 1. 30

Из табл. 1 видно, что каждая полиспецифическая аллоиммунная сыворотка хорошо выявляет гаплотип, против антигенов которого она получена. Так, эритроциты мышей линии С57В1/10, имеющих генотип Н-2 /Н-2 дают поло. 5 b жительную реакцию с иммунной сывороткой анти-H-2 ; эритроциты мышей линии

ВА18/с, имеющих генотип Н-2 /Н-2 ., d d дают положительную реакцию с иммун- 40 ной сывороткой анти-Н-2 ; эритроциты мышей линии СВА, имеющих генотип

Н-2 /Н-2, дают положительную реакцию . к с иммунной сыво ро ткой анти-Н-2

Пример 2. Проверка активности 45 полученных полисиецифических аллоантисывороток с применением предлагаемого метода гемагглютинации (микрометод в микрокамере для иммунологических реакций). От тестируемых животных получают кровь из ретроорбитального синуса, выделяют и отмывают эритроциты и готовят их 1%-ную суспензию на фосфатно-солевом буфере рН .7,4, В микрокамеры для иммунологических реакций раскапывают по

10 мкл полученных аллоантисывороток, разведенных в фосфатно-солевом буфере рН 7,4, содержащем 0,3% поливинил25

4 пирролидона и 17. нормальной мышиной сыворотки. Затем к иммунным сывороткам добавляют по 5 мкл 17.-ной суспензии тестируемых эритроцитов (использовано общепринятое соотношение обьемов аллоиммунной сыворотки и тестируемых эритроцитов). Инкубируют при комнатной температуре 1 ч и учитывают реакцию. Для учета реакции микрокамеры поворачивают.на ребро и выдерживают в таком положении 5 мин.

В случае отрицательной реакции эритроциты вытекают из лунки. При положительной реакции эритроциты склеиваются и образуют плотное кольцо на дне лунки. Реакцию можно также учитывать в микрокамере под -микроскопом.

Полученные результаты с использованием предлагаемого мстода представлены в табл. 2.

Из табл, 2 видно, что каждая полученная аллоиммунная.сыворотка хорошо выявляет гаплотип, против антигенов которого она получена. Так, эритроциты,мышей линии C57B1/10, имеющих генотип Н-. 2 /Н-2, дают положительэ в ную реакцию с иммунной сывороткой, s анти-Н-2 ; эритроциты мышей линии

ВА1В/с, имеющих генотип Н-2 /Н-2 дают положительную реакцию с иммунной сывороткой анти-Н-2 ; эритроциты мышей линии СВА, имеющих генотип к к

Н-2 /Н-2, дают положительную реакцию с иммунной сывороткой анти-Н-2".Таким образом, полученные полиспецифические аллоантисыворотки можно использовать как с применением макрометода гемагглютинации в пробирках, так и с применением микрометода гемагглютинации в микрокамере для иммунологических реакций.

Пример 3. Использование предлагаемого способа для контроля генетической однородности мышей инбредных линий. Способ осуществляют аналогично примеру 2, но в микрокамеры раскапывают по 10 мкл буфера, содержащего 0,9% нормальной мышиной сыворотки, Полученная аллоиммунная сыворотка хорошо выявляет гаплотип, против антигенов которого она получена.

Пример 4. Способ осуществляют аналогично примеру 2, но в микрокамеры раскапывают по 10 мкл буфера, содержащего I 1% нормальной сыворотки.

Полученная аллоиммунная сыворотка хорошо.выявляет гаплотип, против антигенов которого она получена.

35 типом.

Таблица l

Аллоиммунные сыворотки против различных антигенов Н-2

Генотип Н-2 мышей исследуемых линий

Мьпци линий

d1

Анти-Н- 2 Ан ти- Н- 2 Ан ти- Н-2

Н-2 /Н-2 в в

d d

Н-2 /Н-2 ,к к

Н-2 /Н-2

С5 7В1/10

BA1 В/с

СВА

+++

II р и м е ч а н и е: 0 — реакция отрицательная,"

+ ++ +++ — положительная реакция различной силы, В экспериментах использовано не менее 10 мышей каждой линии, 5 14

Н р и м е р 5, Контроль генетической однородности мышей линии СВА, а также мышей других линий, имеющих к гаплотип Н-2 . Формируют группы мышей по числу гаплотипов Н-2, являющихся потенциальными контаминаторами. Для получения полиспецифических аллоиммунных сывороток каждую группу животных иммунизируют клетками лимфоидной ткани мышей с определенным гаплоти— пом Н-2 по стандартной методике.

Схема получения полиспецифических аллоантисывороток на мышах линии к

СВА, имеющих гаплотип Н вЂ” 2, представ— лена в табл. 3.

Тестирование генетической однород ности исследуемых мышей с использованием полученных аллоантисывороток проводят с помощью микрометода гемагглютинации аналогично примеру 2..

Из табл. 4 видно, что каждая полученная иммунная сыворотка хорошо выявляет гаплотип, против антигенов которого она получена. Так, эритроциты мышей линии С57В!/6, имеющих генотип Н-2 /Н-2, дают положительную ,е в реакцию с иммунной сывороткой антиН-2; эритроциты мышей линии ВА1В/с, имеющих генотип Н вЂ” 2 /Н вЂ” 2, дают поло—

Ь Ь жительную реакцию с иммунной сывороткой анти-Н-2 ; эритроциты мышей линии

SWR имеющих генотип Н-2 /H-2, дают

° Ф положительную реакцию с иммунной сывороткой анти-Н вЂ” 2 ; эритроциты мышей

58825 6 линии SJL, имеющих генотип Н-2 /Н-2 дают положительную реакцию с иммунной сывороткой анти-Н вЂ” 2 . В то же время мыши линии СВА и AKR, имеющие генотип Н-2 /H 2 со всеми исполь,к к. зованными аллоантисыворотками дают положительную реакцию.

Результаты контроля генетической однородности мышей линий CBA H AKR в реакции гемагглютинации с использованием аллоантисывороток, получен,,к ных на мышах линии СВА (H- 2 ), при— ведены в табл. 4.

)Ф о р м у л а и з о б р е т е .н и я

Способ контроля генетической однородности мышей инбредных линий путем получения специфической антисыворотки против антигенов Н-2, проведения серологического анализа и оценки генетической однородности по результатам серологического анализа, 25 о тлич ающий ся тем, что, с целью упрощения способа и повышения его эффективности за счет возможности проведения серологической реакции микрометодом, получают панель поли30 специфических антисывороток в результате иммунизации подлежащих проверке линий клетками лимфоидной ткани мышей, являющихся потенциальными контаминаторами с другим Н-2 гапло1458825

Таблица 2

Mbt1IIH JIHHHH

Генотип Н-2 мышей исследуемых линий

C57B1/10

ВА1В/С

Н-2 /Н-2

Ь, 8

Н-2 /Н-2 ,d d

+++ к

Н-2 /Н-2

СВА

+++

П р и м е ч а н и е: 0 — реакция.отрицательная;

+ ++ +++ — положительная реакция различной силы. В зкспериментах использовано не менее 10 мышей каждой линии.

Таблица 3

Специфич" ность по

Иммунизирующие гаплотипы Н-2 мышей

Мыши линий доноров клеток лимфоидных тканей лученной аллоантисыдоноров воротки

Н-2 ,d

ВА1Б/с

C57B1/6, Ь

Н-2,%

Н-2

SUR з

Н-2

$Л.

Группы иммунизируемых мышей линии

C 13A (мыш и реципиенты) Лллоиммунные сыворотки против различных антигенов Н-2 к з Г в

Анти-Н-2 Анти-Н-2 Анти-Н-2 к d

Н-2 анти-Н-2 .к в

Н-2 анти-Н-2, к, Ф

Н-2 анти-Н-2 к в

Н-2 анти-Н-2

1458825 о

I I о

Ф о I

I I

О +

+ о +

+ о +

I 11 4Г 3

53

Рю о о!

1 о I

Il о о о о о о! 1

° Ф

Э

Э

1 I

+ б

+ о

+

+ о о о + о о о о о о о о о о

+

+ о о

+

Ю

+

1 1! ! ! ! о

Э

O о

I 1

+

+ о + ж

I о о о о

+

+!!

1 ж сч

Ж. е еч сч

-1 1 C ,у а сч сч

I ж ж

Ф

"сч

И! М

1 Ю

1ОО

1 В о о й О с ф ф ил Я

-o

Рю

Cl

«ф ф ф и г ф

Гм в л о

Ж

h! 11o

I и 3 ,g

Ф О Х 1

IC»ХЦ1

Ф 1 ! Ц х, о о о о о о

О ! о о + о о +

+ о о +

+ о о,.+ о i +

+ + о + + о о

М Ю

1Ч СЧ СЧ

Ж Ю Я сч вч еч О

° а ф . ф ф л

8 ф о

Р

5 о

° Ф

i о