Способ раннего прогнозирования гетерезиса по хозяйственным признакам у гибридов тутового шелкопряда

 

Изобретение относится к биохимии и селекции хозяйственно ценного вида насекомых - тутового шелкопряда. Цель изобретения - повышение достоверности и сокращение времени прогнозирования. Проводят определение удельной активности ферментов кислой фосфатазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и кислой ДНКазы в белковых экстрактах грены пород и гибридов тутового шекопряда спектрофотометрическим методом , сравнивают значение удельной активности всех трех ферментов в грене тестируемых гибридов со среднеарифметическим значением удельной активности соответствующих ферментов в грене родительских пород и в случае повышенной удельной активности грены гибридов в сравнении с греной родительских пород делают заключение о наличии гетерозиса у тестируемых гибридов. 2 табл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5l)4 А01 К67 04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4227805/30-15 (22) 10.04.87 (46) 30.03.89. Бюл. № 12 (71) Московский государственный педагогический институт им. В. И. Ленина и Российская республиканская станция шелководства (72) 1О. Б. Филиппович, А. С. Коничев, E В. Борзаковская, А. П. Эчкалов, М. Н. Шулика, А. А. Климова и Г. Н. Тищенко (53) 638.2(088.8) (56) Егорова Т. А., Остапенко В. А. Филиппович fG. Б. Изучение активности некоторых ферментов гемолимфы и грены у родительских пород и гибридов тутового шелкопряда.— В сб.: Биохимия насекомых, 1977., вып. 19, с. 29.

Изобретение относится к биохимии и селекции хозяйственно ценного вида насекомых — тутового шелкопряда.

Цель изобретения — повышение достоверности и сокращение времени прогнозирования.

Способ осуществляют следующим образом.

Наьеску грены (0,2 г) гомогенизируют в ступках при 0 С и белки экстрагируют 2 мл

0,15 М раствора хлорида натрия в течение 15 мин. Экстракт центрифугируют при

18000 д в течение 20 мин. В полученном супернатанте определяют концентрацию белка по методу Бредфорд и исследуют его для определения активности ферментов. АкÄÄSUÄÄ 1468486 А1 (54) СПОСОБ РАННЕГО ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ГЕТЕРОЗИСА ПО ХОЗЯЙСТВЕННЫМ ПРИЗНАКАМ У ГИБРИДОВ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА (57) Изобретение относится к биохимии и селекции хозяйственно ценного вида насекомых — тутового шелкопряда. Цель изобретения — повышение достоверности и сокращение времени прогнозирования. Проводят определение удельной активности ферментов кислой фосфатазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и кислой ДНКазы в белковых экстрактах грены пород и гибридов тутового шекопряда спектрофотометрическим методом, сравнивают значение удельной активности всех трех ферментов в грене тестируемых гибридов со среднеарифметическим значением удельной активности соответствующих ферментов в- грене родительских пород и в случае повышенной удельной активности грены гибридов в сравнении с греной родительских пород делают заключение о наличии гетерозиса у тестируемых гибридов. 2 табл.

2 тивность кислой фосфатазы определяют спектрофотометрически, в качестве субстрата используют и-нитрофенилфосфат. Для определения активности к 0,1 мл белкового экстракта добавляют 1,5 мл субстрата, растворенного в 1,4 мл 0,05 М ацетатного буфера, рН 4,6. Смесь инкубируют при 37 С в течение 20 мин. Реакцию останавливают добавлением 2 мл 0,2 М раствора NaOH. В контроль белковый экстракт вносят после добавления щелочи. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при 405 нм.

3а единицу активности фермента принимают гакое его количество, которое катализирует высвобождение 1 мкмоль и-нитрофенола за

1 мин. Количество выделившегося нитрофенола определяют по калибровочной кривой.

1468486

„,0

Ы

Удельную активность рассчитывают в единицах активности на 1 мг белка, Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы определяют непосредственно в кювете спектрофотометра, внося в нее реакционную смесь в следующем составе: 1 мл глицинАаОН буферного раствора (рН 9,5), содержащего 6 мМ р-меркаптоэтанола; 1 мл 3 мМ раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты; 1,8 мг глюкозо-6-фосфата в О,! мл дистиллированной воды; 1,8 мг НАДФ в 0,1 мл дистиллированной воды и 0,1 мл экстракта грены. Экстракт предварительно разбавля;от в 3 раза дистиллированной водой. Величину поглощения НАДФН измеряют в течение 5 мин при 340 нм. Активность рассчитывают по формуле

34 Х (° 6,22 где Ап4о — прирост поглощения при 340 н.;:

Š— активность фермента (в единицах активности); — объем пробы. мл; — время инкубации, мин:

6,22 — коэффициент пересчета.

За единицу активности фермента прини. мают такое его количество, которое катализирует образование 2 мкмоль НАДФН в

1 мин. Удельную активность рассчитывают з единицах активности на 1 кг белка, Активность кислой ДНКазы определяют спектрофотометрически, используя в качестве субстрата предварительно денатурированную нагреванием (100 С, 10 мин) высокомолекулярную ДНК. Инкуб" öèîííàÿ смесь для определения активности ДНКазы содержит

0,1 мл 0,2%-ного водного. раствора субстрата; 0,2 мл 0,5 М ацетатного буфера (pH 5,2);

0,1 мл 0,01 M раствора M С4; 0,4 мл дистиллированной воды и 0,2 мл белкового экстракта. После инкубации в течение 1 ч при

37 С смесь охлаждают в ледяной бане, добавляют 2 мл 0,5 М раствора хлорной кислоты и выдерживают при 0 С в течение

20 мин. Осадок отделяют центрифугирова1.ием при 6000 g в течение 10 мин H измеряют оптическую плотность супернатанта при

260 мм против контрольной пробы, в которую фермент добавляют после инкубации. За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое вызывает увеличение оптической плотности на 1 единицу за ч. Удельную активность рассчитыва|от в единицах активности «а 1 кг белка.

Прирост или убыль удельной активности каждого из исследованных ферментов в грене гибрида по отношению к таковой в грене,эодительских пород рассчитывают по формуле

S=А — — А"-Х100

А1 где S — прирост или убыль ферментативной активности (в процентах);

15 0

7с

А — — удельная активность фермента у гибрида;

А — среднее значение активности фермента у родительских пород.

Если активность всех трех исследованных ферментов в грене гибридов превосходит среднее арифметическое значение активности ферментов в грене родительских пород, делают заключение о целесообразности выращивания данного гибрида, у которого следует ожидать гетерозис по ряду показателей (срелнему весу коконов, весу шелковой оболочки) . Сопоставляют результать: определения удельной активности ферментов в грене пород и гибридов тутового шелкопряда (табл. 1). В грене гибрида ПС5 ул х СК2 наблюдается прирост удельной активности исследованных ферментов по сравнению со срелнеродительским показателем: значения лля активности кислой фосфатазы, кислой

ДНКазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы состав. яют у данного гибрида +61,1 -+63,3 и

+38,8% соответственно. Гибрид ПС5 ул х

СК2 яв.ляется перспективным. В грене гибрида СК2 х САНИИШ 30 наблюдается снижение удельной активности по сравнению со среднеро,.«ительским показателем: значения для активности киспой фосфатазы, кислой

ДНКазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы составляют у данного гибрида — 38,8%—

60,4%, — 26,7% соответственно. Гибрид

СК2 х САНИИШ 30 следует признать неперспективным для выращивания.

В результате контрольных выкормок данных гибридов было установлено, что гибрид

ПС5 ул х СК2 проявляет гетерозис по среднему весу коконов и весу щелковой оболочки (на 10,4% и 7,! % соответственно), а гибрид СК2 х САНИИШ 30 не обладает гетерозисными свойствами по данным показателям (табл. 2) .

Результаты определения удельной активности кислой фосфатазы, кислой ДИКазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в грене пород и гибридов тутового шелкопряда представлены в табл. 1.

Средний вес кокона и вес шелковой оболочки у порол и I ибри «08 прелставлсны в табл. 2.

Предлагаемый способ, основанный на точном количественном определении активности ферментов, позволяет в короткое время (в течение 1 рабочего дня проанализировать большое количество (несколько десятков) образцов грены. Данный способ более экономичен, поскольку не требует дополнительного оборудования (приборов для проведения электрофореза и сканирования энзимограмм), открывает возможность быстрого массового определения удельной активности в большом количестве образцов грены тутового шелко",ряда с целью раннего (на стадии яйца) прогнозирования гетерозиса у

1468486 щийся тем, что, с целью повышения достоверности и сокращения времени прогнозирования, проводят определение удельной активности перечисленных ферментов и дополнительно кислой ДНКазы спектрофотометрическим методом, сравнивают значение удельной активности всех трех ферментов в грене тестируемых гибридов са среднеарифметическим значением удельной активности соответствующих ферментов в грене родительских пород и в случае повышенной удельной активности грены гибридов в сравнении с греной родительских пород делают заключение о наличии гетерозиса у тестируемых гибридов. тутового шелкопряда, что позволяет избежать дорогостоящих выкормок, необходимых для сопоставления показателей продуктивности у пород и гибридов насекомых.

Формула изобретения

Способ раннего прогнозирования гетерозиса по хозяйственным признакам у гибридов тутового шелкопряда, включающий определение активности ферментов кислой фосфатазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в белковых экстрактах грены пород и гибридов тутового шелкопряда и суждение о гетерозисе выращиваемых гибридов, отличаюТаблица 1

Удельная активность (единиц/мг белка) х 10

Породы и гибриды

Глюкозо — Кислая — 6-фосфат- ДНКаза дегидрогеназа

Кислая фосфотаза

6,49

2,57 — 60,4

8,48

6,05

-28,7

10,45

6,42

-38,6

П р и м е ч а н и е. S — превосходство гибрида по сравнению со среднеродительеким показателем у исходных пород по уровню ферментативной активности.

Таблица2

Породы и гибриды Средний вес ко- Вес щелковой кона, г оболочки, г

0,417

0,315

0,392(+7,1)

0,315

0,508

0,298(-5,8) 2,14

1,59

1, 95 (+10, 4)

1,59

2,04

1,81(-0,2) ПС5ул

СН2

ПС5ул х СК2

СК2

САНИИШ

СК2 х САНИИШ 30

П р и м е ч а н и е. В скобках указан прирост (+) или убыль (-) соответствующего показателя у гибрида по сравнению со среднеродительским показателем (в процентах).

ПС5

СК2

Среднеродительский

ПС5ул х СК2

8(Х)

СК2

САНИИШ 30

Среднеродительский показатель

СК2 + САНИИШ 30

Б(Е) 10,27

8,38

9,32

15,02

+61,1

8,38

12,53

13,23

7,03

10,13

14.04

+38,6

7,03

9,93

11,73

5,03

8,35

14,71

+63,3

5,03

8,45