Способ получения иммобилизованных бактериальных клеток

 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способам получения микробных клеток-деструкторов анионных поверхностно-активных веществ. Целью изобретения является упрощение процесса и повышение активности иммобилизованных клеток при деструкции анионных поверхностно-активных веществ. Способ заключается в иммобилизации бактериальных клеток путем смешивания водной суспензии клеток - деструкторов анионных поверхностно-активных веществ PSEUDOMONAS AERUGINOSA 1 С или P.ALCALIGENES TR с анионообменным поливинилспиртовым или поликапроамидным волокном, содержащим химически закрепленный флокулянт, и проведении связывания при модуле ванны 20-30, температуре 28-33°С в течение 20-30 мин. При этом поливинилспиртовое или поликапроамидное волокно содержит 1-1,5 моль полиэтиленимина и/или полиэпоксидоамина на 1г волокна, а его обработку осуществляют водной суспензией микробных клеток с концентрацией 0,6-1,0 ед. оптической плотности. Способ упрощает процесс иммобилизации бактериальных клеток и позволяет увеличить их активности при деструкции анионных поверхностно-активных веществ в 4-6 раз. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„ЯЦ„„14795 I 5

А1

}5}},} С 12 N 1 }1/Оо

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К Д ВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4278459/28-13 (22) 02.06.87 (46) 15.05.89. Бюл. }1 - 18 (71) Ленинградский институт текстильной и легкой промышленности . им. С.M. Кирова (72) А.Б.Лобова, И.И.Шамолина, С.С.Ставская, Л.А.Таранова и О.С.Радченко (53) 577.15(088.8) (56) Синицьн. А.А. и др. Иммобилизация дрожжей Saccharomyces cerevisiae на алюмоборосиликатных стекловолокнах. Биотехнология., 1986, У 3, с. 66-69.

Патент США Ф 4 177107, кл. С 07 С 7/02, 1979. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИИБИЛИЗОВАННЫХ БАКТЕРИАЛЬННХ КЛЕТОК (57) Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способам получения микробных клеток-деструкторов анионных поверхностно-активных веществ. Целью изобретения является упрощение процесса и повышение активИзобретение относится к биотехнологии, в частности к получению иммобилизованных микробных клеток — дест.рукторов анионных поверхностно-активных веществ (АПАВ), которые могут быть использованы как катализаторы со специфической и контролируемой активностью в очистке вредных промышленных выбросов ряда химических производств. ности иммобилпзованных клеток при деструкции анионных поверхностно-активных веществ. Способ заключаетсл в иммобилизации бактериальных клеток путем смешивания водной суспензии клеток-деструкторов анионных поверхностно-активных веществ Pseudomonas

aeruginosa 1С или P. alcaligenes TR с анионообменным поливинилспиртовым или поликапроамидным волокном, содержащим химически закрепленный флокулянт, и проведении связывания при модуле ванны 20-30, температуре 28=33"C в течение 20-30 мин. При этом голивинилспиртовое или поликапроамидное волокно содержит 1 — 1,5 моль полиэтиленимина и/или полиэпоксидоамина на

1 г волокна, а его обработку осуществляют водной суспензией микробных клеток с концентрацией 0,6-1,0 ед. оптической плотности. Способ упрощает процесс иммобилизации бактериальных клеток и позволяет увеличить их активности при деструкции анионных поверхностно-активных веществ в 46 раз. 1 з.п. ф-лы, 1 таол.

Цель изобретения — упрощение процесса и повышение активности иммобилизованных клеток при деструкции анионных поверхностно-активных веществ.

Способ получения иммобилизованных клеток деструкторов АПАВ заключается в смешивании водной сусттензии клеток

Pseudomonas alcaligenes TR (ВКПБ

В-2981) или Pseudomonas aeruginosa

1С с пористым адсорбентом — анионо3 4795 обменным поливи»»илспиртовым и»»и поликапроамидным волокном, содержащим химически закрепленный флокулянт полиэтиленимин и/или полиэпоксидоамин в количестве 1,0 —.1,5 моль па 5

1 г адсорбента, а иммобилизации осуществляют при модуле ванны 20-30, температуре 28-33 С в течение 2030 мин. Предпочтительно использовать водную суспензию клеток с концентра10 цией 0,6-1,0 единиц оптической плотности.

Поливинилспиртовое или поликапроамидное волокно, 1 r которого содержит 1 — 1,5 моль химически эакрепленно15 го»1»покуля»»та, обладает повышенным сродством к микробным клеткам-деструкторам анионных поверхностно-активных веществ за счет включения полиэтиленимина и/или полиэпоксидоамина

20 в структуру носителя, Это позволяет осуществлять иммобилизацию клеток в течение 20-30 мин в мягких условиях без использования сложного оборудования, необходимого для т-облучения.

Закрепление микробной клетки на некотором расстоянии от волокнистой матрицы через содержащиеся в волокне молекулы химически связанного

30 полиэтиленимина и/или полиэпоксидоамина обеспечивает этой клетке большую подвижность, чем если бы последняя находилась в массе полимера, улучшает доступ к ней субстрата, способствует эффективной работа фермент- 35 ной системы иммобилизованной микробной клетки и полному сохранению ее активности.

Использование предлагаемого способа позволяет упростить процесс за ,счет устранения стадии радиационной полимеризации, а также повысить активность иммобилизованных клеток при деструкции анионных поверхностноактивных веществ от 1,5-3,6 (при пол- 45 ном сохранении активности клеток) до

9,2-15,3 мг деструктированных АПАВ на 1 мг клеток, т.е. в 4-6 раз.

Способ илл»острируется следующими примерами. 50

Пример 1. Анионообменное поливинилспиртовое волокно (1 г), содержащее химически закрепленный полиэтиленимин в количестве 1 моль/г, обрабатывают в течение 20 мин водной 55 суспензией микробной культуры P.al—

caligenes ТR (ВКПБ В-2981) (20 мл) с концентрацией клеток 0,6 ед. оптио ческой плотности при 28 С. Волокно

»J»Icy»»»è»»»»þT на воздух», а затем промь»лаю J дисти3!РIHpn»J а»»»»ой водой, Сод ер жанне клеток, пммобилизованиых на волокне, составляет 12 мг/г. Лктивност», клеток, иммобилизованных на волокне, 9,2 мг деструктированного АПАВ»а мг клеток (таблица) .

Пример 2. Лнионообменное поливинилспиртовое волокно (1 г), содержащее химически закрепленный полиэтиленимин в количестве 1,3 моль/г, обрабатывают в течение 25 мин водной суспензией микробной культуры P.alca1igenes TR (25 мл) с концентрацией клеток 0,8 ед. оптической плотности

О при температуре 30 С.. Волокно высушивают на воздухе, а затем промывают дистиплированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет 15 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне, 9,6 мг деструктированного АПАВ на

1 мг клеток.

Пример 3. Анионообменное поливинилспиртовое волокно (1 г), содержащее химически закрепленный пав лиэтиленимин в количестве 1,5 моль/г, обрабатывают в течение 30 мин водной суспензией микробной культуры P alcaligenes TR (30 мл) с концентрацией клеток 1,0 ед. оптической плотности о при 33 С. Волокно высушивают на воздухе, а затем промывают дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет 21 мг /г, Активность клеток, иммобилизованных на волокне,11,8 мг деструктированного АПАВ на 1 мг клеток.

Пример 4. Лнионообменное ноливинилспиртовое волокно (1 r), содержащее химически закрепленный полиэтиленимин в количестве 0,6 моль/г обрабатывают в течение 20 мин водной суспензией микробной культуры P.alca ligenes TR (20 мл) с концентрацией клеток 0,6 ед. оптической плотности при 28 С. Волокно высушивают на воздухе, а затем промывают дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет

6 мг/г. Активность клеток, иммобилиэованных на волокне снижаемся в два раза — до 5,0 мг деструктированного

АПЛВ на 1 мг клеток.

Лнионообменное поливинилспиртовое (поликапроамидное) волокно, содержащее флокулянт в количестве более

1,5 моль на 1 грамм, обладает низкой прочностью и повышенной хрупкостью, 14 79515

t1()этом" li(по:lt зон.t7 1 ° eго лля пммоби— яизации микрс бных клеток представляется нецелесообразньж.

Пример 5, Лпионообменное по5 ливинилспиртовое(1 r) волокно, содержащее химически закрепленный полиэтиленимин в количестве 1,3 моль/г, обрабатывают в течение 30 мин водной суспензией микробной культуры P. aeru- 10

ginosa 1С (30 мл) с концентрацией клеток 0,9 ед. оптической плотности, при 30 С. Волокно высушивают на воздухе, а затем промывают.дистиллированной водой. Содержание клеток, им- 15 мобилизованных на волокне, составляет 23 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне, равна 15,5 мг деструктированного ЛПАВ íà 1 мг клеток. 20

Пример 6. Анионообменное попивипилспиртовое волокно (1 г),содержащее химически закрепленный по— лиэпоксидоамин в количестве

1,2 моль/г, обрабатывают в течение 25

25 мин водной суспензией микробной культуры P.alcaligenes TR . (25 мл) с концентрацией клеток 0,8 ед. оптической плотности при 30 С. Волокно высушивают на воздухе, а затем промы- д0 вают дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет 18 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне, 1l,2 мг деструктированного ЛПЛВ на

1 мг клеток.

Пример 7. Анионообменное поликапроамидное волокно (1 r), содержащее химически закрепленный полиэпоксидоамин в количестве 1, 1 моль/г, 40 обрабатывают в течение 20 мин водной суспензией микробной культуры

P. aeruginosa 1С (20 мл) с концентрацией клеток 0,7 ед. оптической плотности при 28 С.Волокно высушивают на 4В воздухе, а затем промывают дистиллированной водой. Содержание клеток,иммобилизованных на волокне, составляет

13 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне, 9, 1 мг деструктированного АПАВ на мг 1 клеток.

Пример 8. Анионообменное поликапроамидное волокно (1 г), содержащее химически закрепленный полиэпоксидоамин в количестве 1,0 моль/г, 55 обрабатывают в течение 20 мин водной суспензией микробной культуры P.alcaligenes TR (25 мл) с концентрацией клеток 0,6 ед. оптической плотности прН 28 С. Волокно духе, а затем промывают дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет

12 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне 9,3 мг деструктированного AITAB на 1 мг клеток .

Пример 9. Анионообменное поликапроамидное волокно (i г), содержащее химически закрепленный полиэтиленимин в количестве 1,2 моль/г, обрабатывают в течение 25 мин водной суспензией микробной культуры P.alca1igenes TR (30 мл) с концентрацией клеток 0,8 ед. оптической плотности при 30 С. Волокно высушивают на воздухе, а затем промывают дистиллиро— ванной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет 15 мг/г. .Активность клеток, иммобилизованных на волокне, 9,9 мг деструктированного АПЛВ на мг клеток.

Пример 10. Анионообменное поликапроамидное волокно (1 г), содержащее химически закрепленный полиэтиленимин в количестве 1,4 моль/г, обрабатывают в течение 30 мин водной суспензией микробной культуры P.aeruginosa 1С (30 мл) с концентрацией клеток 1,0 ед. оптической плотности при 33 С. Волокно высушивают tta воздухе, а затем промывают дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет

22 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне, 14,2 мг деструктированного АПАВ на 1 мг клеток.

Пример 1 1. Анионообменное поливинилспиртовое волокно (1 r), содержащее химически закрепленный полиэтиленимин и полиэпоксидоамин в количестве 1,3 моль/г, обрабатывают в течение 25 мип водной суспензией микробной культуры P.alcaligenes TR (28 мл) с концентрацией клеток 0,9 ед. оптической плотности при 30 С. Волокно высушивают на воздухе, а затем промывают дистиллированной водой.

Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет 21 мг/г. AKтивность клеток; иммобилизованных на волокне, 12,6 мг деструктированного

ЛПАВ на 1 мг клеток.

Пример 12. Анпонообменное поликапроамидное волокно (1 г), содержащее химически закрепленные полиэтиленимин и полиэпоксндоамин в количестве 1,2 моль/I обрабатывают

14795! 5 тс !(.Isle 20 лп>п в )>1!1О!! Оуспензней м1!краб Ой кул! турь! . aeruginosa 1С (26 мл) с ко11це!!кряциЕй клеток 1,0 ед. оптической плотности при 33 С. Во.покно !зысукп(г(ают ня воздухе, а за5 тeM промывают дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилиэованных ня волокне, составляет 20 мг/г.

Активность клеток, иммобилизованных 1ð на волокне, равна 13,4 мг деструктираван13аг О AHAB пя мг клеток

Пример ы 13-24. Иммабилиэацию проводят, как описано в примерах

1 — 12, варьируя содержание ПЭИ и/или

11ЭЛ в состагзе поликяпроамидного (1 3 — 18 примеры) или по>ливи илспиртоваго (19-24) волокон.

Пример ы 25 32. ИммабилизаTlpHMe- zp рях 1 — 12, изменяя модуль волны (объем cycf !el !six! в 1 мг, добавленный па 1 г волокна), температуру, продолжительность иммобилизации и концентрацш0 клеток D суспензии. 25

Анализ данных примера 25 показывает, чта уменьшение модуля обработки (соотгзетственна, объема суспензии в 1 мл необходимого для обработки 1 г волокна) до 15 ггриводит к 30 снижению количества клеток, эакрепляемь!х на волокне, вследствие недостаточного количества обрабатывающей суспензии и неравномерности обработки носителя. Увеличение модуля до 35

Ъ 35 (пример 26) нецелесообразно, поскольку при возрастании объема обрабатывающей суспенэии волокно (при прочих равных условиях иммобилизации) сорбирует — в силу своей анионообменной емкости и структурных особенностей такое же количество клеток, как и при мацуле 30 (пример 3).

Уменьшение концентрации клеток в суспензии до 0,4 ед. опт. г!лотности при модуле обработки 20 (пример 27) не обеспечивает высокое садер>кание, клеток на г)олокне вследствие их недостаточного количества в исходной суспензии, тогда кяк использование для иммоби.lH 3aIIHII с5 спензий с 17QI3f>f шеннай концентрацией клеток (при— мер ?Я), по-пергзых, ".-,àòðóäíÿåò процесс иммобилизации вследствие агрегирования бактерий в концентрированных растворах„ ва-вторых, в любом с>1У !а<1 fin 5 >lac Tc:fl saIмкагтные и структурnf!1(Особ (lf ffoc тii f fp(дл(3 Га eма Га floeè теля.

Продолжительность обработки определяется периодом, после которого наступает равновесие между клетками, иммобилизаванными на волокне и находягцимися в свободном состоянии в суспензии. Следовательно, уменьшение времени контакта волокон с суспензией клеток (пример 29) не позволяет достигнуть такого равновесия, вследствие чего на волокне успевает закрепиться необходимое количества клеток. После наступления равновесия продолжение иммобилизации (увеличение времени контакта клеток с волокном — пример 30) нецелесообразно, так как с носителем уже связалось такое количество клеток, которое максимально возможно г1ри прочих равных условиях (npHMep 3).

Аналогичные закономерности наблюдаются и при уменьшении (ниже 28 С)

1 либо при увеличении (выше 33 С) температуры иммо били за ции (примеры 31 и 32).

Описанные примеры (для удобства сравнеггия) приведены для ПВС волокна, содержащего ПЭИ в количестве 1,0 и 1,5 моль/г, и микробной культуры

P.а1са1igenes TR. Однако подобные закономерности распространяются и на все прочие виды волокон, которые приведены в примерах 1-24, а также оба вида микробных культур °

Активности бактерий-деструкторов

AHAB определяют по изменению концентрации АПАВ (додецилсульфата натрия— для культуры P aeruginosa 1С и алкилбензолсульфаната — для культуры

P.aIca1igenes TR) в водном растворе колориметрически по реакции с метиленовым синим и выражают в 1 мг спи>кения концентрации соответствующего

АПАВ на 1 мг свободных или иммобили— зованных клеток. При этом содер>кание клеток в водном растворе АПАВ подбирают равным количеству клеток, иммобилизованных на 1 г волокна.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет упростить процесс за счет исключения стадии радиационной полимеризации и повысить активность иммобилизованных клеток при деструкции АПАВ в 4-6 раза — от

1,5-3,6 до 9,2-15,3 мг деструктираванного AHAB ía мг клеток, поскольку активность клеток в известном спо1479515!

О веществ, и!!мобили 3ации подвергRioT клетки Pseudomonas aeruginosa 1С или

P. alcal igenes ВКГР! В-2981, в качестве адсорбента используют анионооб1 менное поливи1п1лспиртовое или поликапроамидное волокно, содержащее

1>0 — 1>5 моль полиэтиленимина и/или полиэпсксидоамина на 1 r волокна, а инкубацию проводят в течение 2030 мин при 28-33 С, устанавливая соотношение суспензии клеток — адсорбент, равным 20-30 мл на 1 r адсор,бента.

2, Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что концентрацию клеток в водной суспензии устанавливают равной 0,6-1>0 единицам оптической плотности, Вид воПри- локме р на вид

Иодификатор (полиамин) Концентрация клеток в суспензия, ед.опт.

Объ

ТемпеКоличество хтивность кле ок f мг дестуктировапного

AtthD на 1 мг суспенратура обработки, »С

Вид микробной культуры

Врем обре ботки клеток, иммобнсодераание на в зии, мп дизован ных на клеток покие, моль/r ммоби- свободплотности волокне мг/r зован- нык

ых

12 9,2 1,5

15 9,6 2,0

21 11 8 2 1

6 5,0 поэтому нецелесообразно

ПВС ПЭИ 1 О

ПВС ЛЭИ 1 3

ПВС ЛЭИ 1,5

tIBC ПЗИ 0,6

ПВС ПЭИ Более 1>5

0,6

0,8

1>0

0,6

20 прочность за пни

28

33

28 низкая волокна, иммобнли

5 ПВС ПЗИ

6 ПВС ПЭА

7 ПКА ПЗА

8 ПКА ПЭА

9 ПКА ПЭИ

I0 ЛКА ПЭИ

II ПВС ПЗИ,ЛЭА

12 ПКА ПЗИ ПЭА

1Э ПКА ПЗИ

1,3

1,2

1,1

1,О

1,2

1,4

1,3

1,2

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0>S

1,0

0,9

1,О

0,6

0,8

1,0

1,0

0,6

1,0

l,0

t,0

З,б

2,0

1,8

1,5

2>0

3,1

2,1

2,7

t,5

2,3

14 ПКА ПЗИ

15 ПКА ПЭА

16 ЛКА ЛЭА

1,5

1,0

1>5

17 ПКА ПЗИ,ЛЭА 1,0

18 III!A ПЭИ >ПЭА 1, 5

0,6

0,8

О ° 8

1,0

0,6

1,0

19 IIBC ПЭИ

20 ПВС ПЭИ

21 ПВС ПЗА

1,0

1,5

1,0

О,б

0,8

1,О

1,0

0,8

1,0

1,0

1,0

0,6

1,0

22 ЛВС ПЭА

1,5

23 ЛВС ПЭА,ЛЭИ 1,0

24 ПВС ПЭИ,ПЭА 1,5

25 ПВС ПЭИ

26 ПВС ПЭИ

27 ПВС ПЭИ

28 ПВС ПЭИ

29 ПВС ЛЗИ

30 ПВС ЛЗИ

31 ПВС ЛЗИ

32 lIBC ЛЭИ

1,0

1,5

1,0

1,5

1>0

1,5

1,0

1,5

0,4

1,2

0,6

1,0

0,6

1,0 собе при tfttht C>tttttt зацпи сохрапяетс л, а в предлагаемом R0зрастает в 46 раз.

Формулаизобретенил

1. Способ получения иммобилизованных бактериальных клеток, заключающийся в смешивании водного раствора клеток бактерий с пористым ионообменным синтетическим адсорбентом, инкубации смеси для закрепления клеток на адсорбенте и промывании адсорбента водным раствором, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения процесса и повьнления активности иммобилизованных клеток при деструкции анионных поверхностно †активн

P.à1ña1. TR 20

P.à1ña1. TR 25

P.alcal TR 30

P. alcal TR 20

Повышенная хрупкость и испольэовать его дпя

P.aerug, 1С 30

Р.аlсаl. TR 25

Р.aerug. 1С . 20

P.alcal. TR 25

P.alcal. TR 30

P.aerug. !С 30

P.alca1. TR 28

Р.alcal. IC 26

P.Alcal. TR 20

P.aerug. IС 25

Р.а1саl. TR 30

Р,aerug. !С 25

Р.alcal. TR 20

P.aerug. IC 30

Р.alcal. TR 30 . Р.aerug. IС 30

P.à1ñà1. TR 20

P.aerug. 1С 20,8

P.alcal. TR 25

P.aerug. 1С 30

Р.aerug. IС . 20

Р.aerug. IС 30

Р.alcal. TR 20

P.aerug. 1С 20

Р.alcal. TR 30

P.aerug. 1С 25

Р.alcal. TR 20

Р.aerug. IС 25

Р.аlсаl. TR 30

P.aerug. 1С 30

P.à1ñà1. TR 15

Р.alcal. TR 35

P.alcal. TR 20

P.à1ñà1. TR 30

P.a1ñà1 TR 20

P.alcal. TR 30

P.â1ñà1. TR 20

Р.alcal. TR 30

33

28

28

33

33

28

30 го

33

28

33

33

28

33

33, 28

33

28

28

33

33

33

33

ЗЗ г8

33

28

33

28

33

23

18

13

12

22

21

23

12

16

1З,о

21

it

18

23

16

19

22

23

14

23

13

16

22

23

l7 .20

23

23

21

21

9 г!

iO

15 5

11,2

9,1

9>3

9,9

14,2

12,6

13,4.9,2

10,8

2,4

12,8

9,7

12,6

13,2

15,3

11,1

13, 1

14,9

15,8

9,7

l4,4

8,5

10,5

13,6

14 >9

»,4

15,0

15,1

15,8

5,2

»,8

4,6

» 8

7,6

»,8

8,4

»,8

2,6

1,9

2,3

2,4

3,6

2,2

2,5

2,9

3,6

2,1

3,6

1,7

2,3

2,9

3,6

2,4

2,7

3,2

3,6

1,1 г,!

0,7

2 ° 1

1,4

2,1

1 ° 9

2,1