Способ встраивания днк в геном аденовируса и рекомбинантный аденовирусный вектор celo/puc 19

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и позволяет получить рекомбинантный вектор - аденовирус CELO/pUC 19. С целью упрощения способа встраивания ДНК в геном аденовируса проводят гидролиз рестриктазой HbaI ДНК генома аденовируса CELO и плазмидной ДНК и неполный гидролиз рестриктазой Bgli ДНК генома аденовируса CELO затем смешивают Bgli фрагменты ДНК, содержащие 39% левой части генома аденовируса и два Xbal-фрагмента аденовируса CELO, содержащие 33-100% генома аденовируса CELO, которые предварительно последовательно лигированы в XbaI сайте на 94% генома с линейной плазмидной ДНК pUC 19 смесью, указанных фрагментов проводят трансфекцию клеток аллантоисной оболочки куриных эмбрионов. В результате рекомбинации in vivo в куриных эмбрионах из двух перекрывающихся фрагментов образуется полноценный геном Ad CELO содержащий в несущественной области гетерологическую ДНК - плазмиду pUC 9. 2 с.п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии и вирусологии, представляет собой способ встраивания ДНК в геном аденовируса и рекомбинантный реактор аденовирус СЕLО/pUC 19, полученный с помощью комбинирования методов генетической инженерии in vitro и рекомбинации in vivo. Целью предлагаемых изобретений является упрощение способа встраивания ДНК в геном аденовируса. Упрощение способа достигается за счет следующих открытых авторами свойств аденовируса СЕLО: интеграция гетерологического гена и 3'-терминальный ХbaI сайт генома СЕLО не нарушает жизненно важные функции вируса; генно-инженерными конструированиями in vitro возможно создание двух взаимно перекрывающихся рекомбинантных фрагментов генома СЕLО (0-39% от 33-100%), содержащих гетерологичный ген в ХbaI сайте генома; реконструкция вирулентной рекомбинантной вирусной частицы возможна при помощи трансфекции куриных эмбрионов смесью ДНК двух фрагментов. П р и м е р 1. Очищенные и сконцентрированные аденовирионы СЕLО диализуют против 100 объемов 0,01хSSC; 1 мМ ЭДТА, ночь при 4^оС. Затем добавляют до 0,5% SDS и до 1 мг/мл протеиназу К, инкубируют при 37^оС 5 ч. Экстрагируют равным объемом водонасыщенного фенола (рН 7,5) дважды, затем экстракцию проводят равным объемом фенол: хлороформ (1:1) и хлороформом. ДНК осаждают 2 объемами этанола и оставляют на ночь на 20^оС. Осадок собирают центрифугированием. 5000 об/мин, 10 мин, 5^оС. Осадок подсушивают, растворяют в 1 мл 0,01хSSC и вновь осаждают этанолом, как указано выше, ДНК СЕLО растворяют в 0,01хSSC в концентрации 300 мг/мл. Гидролиз ДНК СЕLО рестриктазой ХbaI. ДНК СЕLО 60 мкл (20 мкг) инкубируют 40 ед (40 мкл) рестриктазы ХbaI в присутствии 50 мМ NaCl, 6 мМ трис-НСl, рН 7-9; 6 мМ МgCl₂; 100 мкг/мл желатины; 10 мМ 2-Ме, при 37^оС, сутки, общий объем инкубационной смеси был равен 200 мкл. Полноту гидролиза контролируют путем отбора аликвот из инкубационной смеси и проведением мини-гель-электрофореза. Продукты полного гидролиза ДНК СЕLО наносят на 0,8%-ный горизонтальный агарозный гель и проводят электрофорез в трис-боратном буфере (0,1М трис-НСl, рН 8,0; 0,1 М борной кислоты; 2,4 мМ ЭДТА) при напряжении 20 В. Гель окрашивают этидиумбромидом (0,5 мкг/мг) 15 мин в темноте при 4^оС. Из геля вырезают фрагменты А и Е, замораживают жидким азотом и растирают в ступке до порошкообразного состояния. К порошкообразной массе добавляют 5 объемов 1,0 М NaCl, интенсивно встряхивают и центрифугируют 5 мин при 10000 об/мин. Супернатант экстрагируют фенол хлороформом (1:1), добавляют тРНК до концентрации 200 мкг/мл и осаждают 3 объемами этанола при -20^оС ночь. Осадок собирают центрифугированием 100000 g, 5 мин, затем растворяют в 100 мкл 0,01хSSC и переосаждают повторно этанолом, как указано выше. Растворяют в 50 мкл 0,01хSSC. Полученные фрагменты ХbaI-А и ХbaI-Е используют далее для лигирования с плазмидой рUC 19. Гидролиз ДНК рUC 19 рестриктазой ХbaI проводят в следующих условиях. 10 мкг (20 мкл) ДНК рUC 19 инкубируют с 5 ед (5 мкл) рестриктазы ХbaI в присутствии 50 мМ NaCl; 6 мМ трис-НСl, рН 7,9; 6 мМ MgCl₂. 100 мкг/мл желатины, 10 мМ 2-МЕ в объеме 100 мкл при 37^оС, 5 ч. Затем отбирают аликвоту (5 мкл) и анализируют гель-электрофорезом полноту гидролиза. Продукты полного гидролиза экстрагируют равным объемом фенол:хлороформа (1:1), доводят концентрацию Na-ацетата до 0,3 М и осаждают 3 объемами этанола. Осадок собирают центрифугированием при 10000 g 15 мин и растворяют в 20 мкл ТЕ. Обработку гидролизованной ХbaI ДНК рUC 19 щелочной фосфатазой из Е.соli проводят следующим образом. К 20 мкл ДНК рUC 19 добавляют 0,1 ед. (1 мкл) щелочной фосфатазы Е. соli; 0,05 М трис-НСl, рН 9,0; 10 мМ МgCl₂; 0,1 мМ ZnCl₂. Инкубацию проводят в 50 мкл при 65^оС, 1 ч. Затем пробу разводят до 100 мкл Н₂О, трижды экстрагируют равным объемом фенола, добавляют до 200 мкг/мл тРНК и осаждают 3 объемами при 20^оС ночь. Лигирование обработанной щелочной фосфатазой ДНК рUC 19 c фрагментом ХbaI-E проводят следующим образом. Фрагмент ХbaI-E 50 мкг (10 мкл) и 10 мкг (15 мкл) ДНК рUC 19 инкубируют с 60 ед. (3 мкл) ДНК-лигазы в присутствии 1 мМ АТФ; 50 мМ трис-РСl, рН 7,8; 10 мМ МgCl₂, 10 мМ дитиотриэтол; 100 мкг/мл БСА в общем объеме 100 мкл при 8^оС, сутки. Экстрагируют равным объемом фенол-хлороформом (1: 1) и осаждают 3 объемами этанола при -20^оС, ночь. Осадок собирают центрифугированием при 100000 g 15 мин. Растворяют в 50 мкл 0,01хSSC и продукты лигирования разделяют электрофорезом (20 В). После окрашивания геля этидиумбромидом (0,5 мкг/мл) под ультрафиолетом вырезают фрагмент ХbaI-E, легировавший с рUC 19. Кусочек геля замораживают в жидком азоте и растирают в ступке до порошкообразного состояния. К этой массе добавляют 5 объемов 1 М NaCl, интенсивно экстрагируют, центрифугируют при 10000 g 5 мин, отбирают супернатант, добавляют до 200 мкг/мл тРНК и осаждают 3 объемами этанола при 10000 g 5 мин. Осадок растворяют в 50 мкл 0,01хSSC и лигируют с 20 мкг (50 мкл) фрагмента ХbaI-А, инкубируя с 60 ед (3 мкл) ДНК-лигазы, 1 мМ АТФ; 50 мМ трис-НСl, рН 7,8; 10 мМ МgСl₂; 20 мМ дитиотриэтол; 100 мкг/мл желатины в объеме 150 мкл при 8^оС, ночь. Отбирают аликвоту и анализируют на полноту лигирования методом электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле. Таким образом получают правый фрагмент генома Аd CELО. Левый фрагмент генома Аd CELО получают путем неполного гидролиза ДНК СЕLО рестриктазой ВglI. Проводят это следующим образом: 20 мкг (60 мл) ДНК СЕLО инкубируют с 50 ед (5 мкл) ВglI в присутствии 1 мкг (2 мкл) дистамицина 66 мМ NaCl; 10 мМ МgCl₂; 10 мМ трис-НСl, рН 7,4; 1 мМ 2-МЕ; 100 мкг/мл БСА и в объеме 100 мкл при 37^оС 30 мин. Продукты неполного гидролиза ДНК разделяют электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле в трис-боратном буфере при напряжении 20 В, фрагменты вырезают из геля и из кусочков геля выделяют ДНК, используя жидкий азот, как указано выше. Каждый выделенный фрагмент подвергается полному гидролизу рестриктазой ВglI следующим образом. Аликвоту (5-10%) фрагмента ДНК 1 мкг (10 мкл) инкубируют с 10 ед (1 мкл) рестриктазы ВglIв присутствии 66 мМ NaCl; 10 мМ МgCl₂; 10 мМ трис-НСl, рН 7,4; 1 мМ 2-МЕ; 100 мкг/мл БСА в объеме 30 мкл при 37^оС 1 ч. Продукты гидролиза анализируют проведением геля-электрофореза в трис-боратном буфере. Фрагменты, содержащие сайты рестрикции ВglI для фрагментов ВglI-А; ВglI-C и ВglI-Д отбирают и используют для конструирования вектора (такие фрагменты представляют левую половину генома Аd CELО от 0 до 39% карты генома). Трансфекцию куриных эмбрионов сконструированными фрагментами генома Аd CELО проводят следующим образом. Фрагмент правой половины генома Аd CELО, содержащий в несущественной области плазмиду рUC 19, а также фрагменты ХbaI и ХbaI-E протяженностью 33-100% карты генома Аd CELО в количестве 10 мкг растворяют в 50 мкл стерильного физиологического раствора, фрагмент ДНК СЕLО получен неполным гидролизом ДНК СЕLО рестриктазой ВglI и представляет собой левый конец генома (0-39%) карты генома, 10 мкг. Оба фрагмента смешивают in vitro и стерильным стеклянным капилляром вводят в 9-дневный куриный эмбрион. Куриный эмбрион инкубируют 72 ч при 37^оС. Затем эмбрион охлаждают в течение ночи при 4^оС. Стерильно отбирают аллантоисную жидкость и заражают по 0,2 мл пять 9-дневных куриных эмбрионов, инкубируют их также 72 ч при 37,5^оС. Охлаждают и отбирают аллантоисную жидкость, как указано выше, и повторяют процедуру заражения еще 3 раза. Затем собирают аллантоисную жидкость от 5 эмбрионов и заражают 30 9-дневных куриных эмбрионов. После инкубирования 72 ч при температуре 37,5^оС эмбрионы охлаждают ночь при 4^оС. Затем осторожно и стерильно отсасывают аллантоисную жидкость, наносят на раствор СsCl с плотностью 1,345 г/см³ и центрифугируют при 25000 об/мин 15 ч. Отбирают раствор СsCl и наслаивают ее на раствор СsCl (рефрактивный индекс 1,355-1,375) и центрифугируют при 26000 об/мин 20 ч, 5^оС. Раскапывают на 30 фракций и исследуют их на наличие рекомбинантного Аd CELО иммунодот анализом. Проводят анализ следующим образом. 5 мкл с каждой фракции наносят на нитроцеллюлозный фильтр, высушивают 30 мин при комнатной температуре. Затем инкубируют в буфере трис-НСl (рН 7-5; 140 мМ NaCl; 0,5% NaN₃, 0,05% твин-20, 8% БСА) 2 ч при 37^оС. Затем буфер сливают и фильтр инкубируют в таком же буфере, дополнительно содержащем 20 мкг/мл IgG к вирусу СЕLО в течение 2 ч при 37^оС. Промывают 3 раза по 15 мин буфером без антител к вирусу СЕLО и инкубируют в том же буфере, но содержащем 125 1-меченый протеин А из расчета 1-10⁶ имп/мин/мл. Инкубируют 4 ч при 37^оС. Фильтр промывают 5 раз по 15 мин стандартным буфером, подсушивают и ставят на авторадиографию на ночь на -70^оС. Фракции, давшие положительный сигнал, объединяют, наносят на раствор СsCl (рефрактивный индекс 1,355-1:375) и центрифугируют при 40000 об/мин 20 ч, 5^оС. Раскапывают на 20 фракций и анализируют иммунологически, как указано выше. Фракции, содержащие вирус СЕLО, объединяют и диализуют против 100 объемов 0,01хSSC, 1 мМ ЭДТА, ночь при 4^оС. Отдиализованный материал исследуют электронномикроскопически на наличие аденовирионов СЕLО. Электронномикроскопический анализ проводят на угольно-формваровой подложке, обработанной в течение 1 мин в тлеющем электрическом разряде, с констатированием уранилацетатом. Изучение вирионов ведут на электронном микроскопе при увеличении 12˙10⁴ и ускоряющем напряжении 80 кВ. Были обнаружены аденовирионы с нечетко выраженной морфологией. Из вирусосодержащего материала выделяют вирионную ДНК стандартным методом, т.е. обработкой протеиназой К с последующей экстракцией фенолом. Рекомбинантную вирионную ДНК исследуют методом блотгибридизации на идентичность с геномом Аd CELО и на содержание нуклеотидных последовательностей в геноме рекомбинанта плазмиды рUC 19. Рекомбинантную ДНК метят методом ник-трансляции следующим образом: 0,1-0,5 мкг (5 мкл) рекомбинантной ДНК инкубируют с 1 ед (2 мкл) ДНК-полимеразы 1 E.соli в присутствии 2 нмоль немеченных дНТФ и 50-100 μ Сi 32 Р-меченных дНТФ; 50 нмоль ДНК-азы 1; 500 мкг/мл БСА; 50 мМ трис-НСl, рН 7,2; 10 мМ МgCl₂, 0,1 мМ дитиотриэтола в объеме 50 мкл в течение 2 ч при 16-18^оС. Добавляют 5 мкл 0,25 М ЭДТА, разводят до 100 мкл Н₂О, добавляют 0,4 объема 5 М уксуснокислого аммония, 200 мкг/мл тРНК и 3 объема этанола и осаждают, ночь при -20^оС. Осадок собирают центрифугированием при 10000 g/15 мин. Подсушивают, растворяют в 100 мкл Н₂О и вновь переосаждают этанолом. После второго переосаждения растворяют в 500 мкл Н₂О, измеряют удельную активность меченой ДНК. Она составляет 4-10˙10⁷ имп/мин/мкг по Черенкову. Аналогично метят и ДНК СЕLО. Рекомбинантную меченую ДНК СЕLО параллельно гибридизируют с ДНК СЕLО, рекомбинантной ДНК СЕLО, ДНК плазмиды рUC 19, ДНК фага Т5 методом блот-гибридизации. Перед блот-гибридизацией ДНК СЕLО и ДНК рUC 19 гидролизуют рестриктазой ЕсоRI, ДНК фага Т5 рестриктазой НindIII. Гидролиз ДНК СЕLО и ДНК рUC 19 проводят следующим образом. 1 мкг (5 мкл) ДНК инкубируют с 2 ед (1 мкл) рестриктазы ЕсоRI в присутствии 100 мМ трис-НСl, рН 7,5; 50 мМ NaCl; 5 мМ MgCl₂; 100 мкг/мл БСА в объеме 20 мкл в течение 2 ч при 37^оС. 1 мкг (5 мкл) ДНК фага Т5 инкубируют с 2 ед 1 мкл (рестриктазы) НindIII в присутствии 50 мМ NaCl; 50 мМ трис-НСl, рН 8,0; 10 мМ МgCl₂; 100 мкг/мл БСА в объеме 30 мкл в течение 1 ч при 37^оС. Продукты гидролиза наносят на 1%-ный агарозный гель и ведут электрофорез в трис-боратном буфере при напряжении 40 В. Обработку геля и перенос продуктов гидролиза на нитроцеллюлозную подложку проводят по стандартной методике. Гибридизацию проводят следующим образом. Нитроцеллюлозный фактор погружают в предгибридизационный буфер (6хSSC, 5xДенхардт, 200 мкг/мл дрожжевой РНК) и инкубируют при 65^оС, 4 ч. Затем предгибридизационный буфер сливают и заливают гибридизационным буфером (6хSSC, 2хДенхардт, 200 мкг/мл дрожжевой РНК и предварительно прогревая на кипящей водяной бане 5 мин меченая рекомбинантная ДНК СЕLО 1-2˙10⁶ имп/мин на 1 мл гибридизационного буфера), и инкубируют в течение ночи при 65^оС. Затем гибридизационный буфер сливают и ведут отмывку фильтра, инкубируя его с 2xSSC 3 раза по 15 мин. Затем фильтр подсушивают, заворачивают в полиэтиленовую пленку и ведут авторадиографию ночь или 3-6 дней при 70^оС. На авторадиограммах видно, что рекомбинантная ДНК СЕLО гидролизуется с ДНК СЕLО и с ДНК рUC 19, но не гибридизуется с ДНК фага Т5. В то же время меченая ДНК СЕLО гибридизуется с ДНК СЕLО, но не гибридизуется с ДНК рUC 19. Таким образом, полученные данные показывают, что рекомбинантная ДНК СЕLО несет в своем составе нуклеотидные последовательности ДНК рUC 19. Полученный рекомбинантный вирус СЕLО имеет мол.м 3,2˙10⁷ дальтон, состоит из ВglI фрагмента ДНК аденовируса СЕLО, содержащего 39% левой части генома аденовируса; двух ХbaI фрагментов аденовируса СЕLО, содержащих 33-100% генома аденовируса, которые лигированы в ХbaI сайте на 94% генома с линейной ДНК плазмиды рUC 19, и содержит все генетические элементы аденовируса СЕLО и плазмиды рUC 19, в том числе ген устойчивости к ампициллину; рекликатор плазмиды рUC 19, вирус способен трансфицировать куриные эмбрионы и размножаться в них. Данные электронной микроскопии, иммунологического анализа вирионных белков и гибридизации нуклеиновых кислот показывают, что в результате рекомбинации in vivo в куриных эмбрионах из двух перекрывающих фрагментов образуется полноценный геном Аd CELО, содержащий в несущественной области гетерологическую ДНК плазмиду рUC 19. Использование в способе эукариотического вектора на основе аденовируса СЕLО позволяет, во-первых, использовать для репродукции введенного гена простую, дешевую, высокотехнологичную систему куриные эмбрионы вместо культуры клеток. Во-вторых, значительная по размерам несущественная область генома позволяет включать в него крупные фрагменты чужеродной ДНК (до 5000-6000 нуклеотидных пар). В-третьих, аденовирусы селективно ингибируют синтез белков клетки хозяина на поздней стадии инфекции, что облегчает тестирование и очистку белков, экспрессируемых с включенного в вектор гена. В-четвертых, для данного вектора характерна высокая репродуктивная (до 10¹³ вирионов/мл) и высоко экспрессируемая (до 5 мг вирионных белков на куриный эмбрион) активность. В-пятых, весь препродуцируемый и экспрессируемый материал содержится в аллантоисной жидкости, что значительно упрощает выделение и очистку такого материала.

Формула изобретения

1. Способ встраивания ДНК в геном аденовируса, включающий гидролиз ДНКрестриктазой Xbal и трансфекцию ДНК, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, проводят гидролиз рестриктазой Xbal плазмидной ДНК и ДНК генома аденовируса CELO с последующим неполным гидролизом рестриктазои Bgli ДНК генома аденовируса CELO, затем смешивают Bgli фрагменты ДНК с мол.м. 12 мегадальтон, и два Xbal фрагмента Ad CELO с мол.м.18 и 2,4 мегадальтон, которые предварительно последовательно лигируют в Xbal сайте с линейной плазмидной ДНК, смесью указанных фрагментов проводят трансфекцию куриных эмбрионов и выделяют рекомбинантный вирус. 2. Рекомбинантный аденовирусный вектор CELO/pVC 19 мол.м. 3,2 · 10⁷ дальтон, содержащий Bgli-Bgli фрагмент ДНК Ad CELO мол.м. 12 мегадальтон, включающий 39% левой части генома аденовируса, два Xbal-Xbal фрагмента Ad CELO с мол.м. 18 и 2,4 мегадальтон, включающие 33-100% генома аденовируса, которые лигированы в Xbal саите с линеиной ДНК плазмиды pVC 19, регуляторную область аденовируса; ген устойчивости к ампициллину; репликон плазмиды pVC 19, трансфицирует куриные эмбрионы и размножается в них, емкость вектора от 1,5 до 3 мегадальтон.