Способ получения препарата для определения моноаминов на основе иммобилизованной моноаминооксидазы

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению иммобилизованных органоидов клетки и ферментов, и может найти применение при получении биокатализаторов, а также в химическом, клиническом и токсилогическом анализе. Цель изобретения - улучшение характеристик препарата для определения моноаминов за счет повышения активности моноаминооксидазы, механической прочности и антимикробных свойств пленки. Способ заключается во введении ферментного препарата с моноаминооксидазной активностью (гомогенат митохондрий печени) в водный раствор желатина с последующим добавлением террилитина в количестве 1-10 протеолитических единиц на 1 мл суспензии, немедленном нанесении суспензии на нерастворимую подложку, высушивании суспензии на воздухе и обработке полученной пленки в течение 3-5 мин глутаровым альдегидом. Полученный препарат обладает повышенными механической прочностью и антимикробными свойствами, а также в 1,5 раза более высокой активностью моноаминооксидазы. 1 з.п. ф-лы. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР! (21 ) 4290684/28-1 3 (22) 27.07.87 (46) 23.07 ° 89. Бюл. ¹ 27 (71) Научно-производственное объединение "Биолар" и Латвийский государственный университет им. П. Стучки (72) Д. IO.,Iaëöåðå, Б. А. Гринберг, А. А. Прикулис, Е. Б. Никольская, А. В. Святковский и О. В. Ягодина (53) 577.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 1146322, кл. С 12 N 11/12, 1983.

Durand. P. et al. An enzyme electrode Biophys. — Biochim Acta, 1978, 2, 277-281. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНОАМИНОВ НА ОСНОВЕ ИИИОБИЛИЗОВАННОЙ ИОНОАМИНООКСИДАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению иммобилизованных органоидов клетки и ферментов, и может найти применение при получении биокатализаторов, а также

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к области получения иммобилизованных органоидов клетки и ферментов, и может найти применение при получении биокатализаторов, а также в химическом, клиническом и токсикологическом анализе.

Целью изобретения является улучшение характеристик препарата дпя определения моноаминов за счет повышения активности моноаминооксидазы (MA0), механической прочности и антимикробных свойств пленки. (51) 4 С 12 N 11/12 G 01 N 33/50

2 в химическом, клиническом и токсило гическом анализе. Цель изобретения улучшение характеристик препарата дпя определения моноаминов за счет повышения активности моноаминооксидазы, механической прочности и антимикробных свойств пленки. Способ заключается во введении ферментного препарата с моноаминооксидазной активностью (гомогенат митохондрий печени) в водный раствор желатина с последующим добавлением террилитина в количестве 1-10 протеолитических единиц на 1 мл суспензии, немедленном нанесении суспензии на нерастворимую подложку, высушивании суспензии на воздухе и обработке полученной пленки в течение 3-5 мин глутаровым альдегидом. Полученный препарат обладает повышенными механической прочностью и антимикробными свойствами, а также в 1,5 раза более высокой активностью моноаминооксидазы. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

Способ заключается во введении ферментного препарата (гомогената. митохондрий печени) в водный раствор желатина с последующим добавлением террилитина в количестве 1-10 протеолитических единиц на I мл объема суспензии, немедленном нанесении полученной суспензии на нерастворимую подложку, высушивании суспензии на воздухе и обработке полученной пленки глутаровым альдегидом (предпочтительно в течение 3-5 мин) ° Введение террилитина приводит к частичному

3 149537 разрушению митохондриальных мембран, что увеличивает активность моноаминооксидазы. Кратковременность воздействия террилитина на моноаминооксидазу (до высушивания пленки) позволяет избежать ее инактивации за счет протеолиза. Способ позволяет получить целевой продукт с улучшенными характеристиками: активность иммобилизованной моноаминооксидазы возрастает в 1,5 раза, увеличивается также прочность пленки и ее бактериостатическое действие.

Пример 1. 0 2 r желатина 15 помещают в стаканчик с 4 мл дистиллированной воды для набухания. Затем туда же добавляют 5 мл 0,05 M фосфатного буфера с рН 7,4 и нагревают при перемешивании до полного растворения 20

° желатина. Далее раствор охлаждают до о

+25 С и вносят в него 2 r гомогената митохондрий печени свиньи в 0,05 M фосфатном буфере, рН 7,4 и перемешивают. К полученной суспензии добавля- 25 ют 1 мл раствора террилитина в воде с суммарной активностью 10 протеолитических единиц (ПЕ), т.е. 1 ПЕ/1 мл состава. Смесь немедленно порциями по

5 мл выливают на ровную поверхность полиэтиленовой пластины и высушивают в потоке воздуха в течение 1,5 ч. Су.хую пленку желатина обрабатывают

10 мл 2Х-ного раствора глутарового альдегида (ГА) в течение 3 мин. После 35 этого избыток раствора ГА сливают, а пленку многократно промывают водой и

0,05 М фосфатным буфером, рН 7,4, и снова высушивают в потоке воздуха в течение 1 ч. Сухие препараты хранят 40 о в холодильнике при 4-10 С. МАО активность диагностического препарата:

6,83 10 Е/мг белка (по тирамину);

5,60 10 Е/мг белка (по серотонину); 45

4,65 ° 10 E/ìã белка (по бензиламину) .

Активность препарата сохраняется в течение года.

Бактериостатическая активность.

Задержка роста культуры кишечной палочки в пробах с пленкой полученного диагностического препарата по сравнению с контролем 86,4Х.

Механическая "îõðàííîñòü в условиях многократного использования: препарат стабилен в 50 циклах работы.

Один цикл работы — пять дней по пять определений в день. После каждого

8 4 цикла работы препарат высушивается на воздухе и взвешивается.

Характеристики препаратов приведены в табл. 1.!

За единицу протелитической активности террилитина принято такое количество фермента, которое расщепляет 1 смоль субстрата за 1 мин при

+25 С и рН 7,0.

Пример 2. 0,7 г желатина обливают 4 мл дистиллированной воды для набухания. Затем туда же добавляют 5 мл 0 05 M фосфатного буфера, рН 7,4 и нагревают при перемешивании до полного растворения желатина. Дао лее раствор охлаждают до +20 С и вносят в него при перемешивании 1 г гомогената митохондрий печени свиньи в О, 07 М фосфатном буфере, рН 7, 4.

К полученной суспензии добавляют 1 мл раствора террилитина в воде с активностью 100 ПЕ, т.е. 10 ПЕ/1 мл. Немедленно из полученной смеси 5 мл выливают на алюминиевую фольгу, 5 мл— на кафель, на котором натянута капроновая сетка, и сушат в потоке воздуха в течение 2 ч. Сухую пленку в обоих случаях обрабатывают 5 мл 87.-ного раствора ГА в течение 5 мин. После этого избыток раствора ГА сливают, а пленки многократно промывают водой и 0,05 M фосфатным буфером, рН 7,5.

Капроновую сетку с желатиновой пленкой осторожно снимают с поверхности кафеля. Обе пленки высушивают в потоке воздуха при +25 С в течение 1 ч.

МАО активность диагностического препарата:

6,85 ° 10 Е/мг белка (по тирамину);

5,50 1О Е/мг белка (по серото-0 нину);

4,52 10 Е/мг белка (по бензипамину) .

Бактериостатическая активность.

Задержка роста культуры кишечной палочки в пробах с пленкой диагностического препарата по сравнению с контролем без пленки 86,07 Препарат стабилен в 50 циклах работы.

П риме р 3. 0,5 гжелатина обливают 4 мп дистиллированной воды для набухания. Затем туда же добавляют 5 мл 0,05 М фосфатного буфера. рН 7,4 и нагревают при перемешивании до полного растворения желатина. Дао лее раствор охлаждают до +20 С и вносят в него при перемешивании 2 г ro1495378 могената митохондрий печени крысы (40 мг белка) в 0,07 M фосфатном буфере, рН 7,4. К полученному раствору добавляют 1 мл раствора террилитина в воде с суммарной активностью 50 ПЕ, т.е. 5 ПЕ/1 мл. Смесь перемешивают и по 5 мл выливают на полимерную мембрану и капроновую сетку, натянутую на кафель, и высушивают в потоке о воздуха при 20 С в течение 1 ч. Сухую пленку обрабатывают 5 мл 8%-ного раствора ГА в течение 4 мин. После этого избыток ГА сливают, а пленку многократно промывают водой и 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,5. Капроновую сетку с желатиновой пленкой снимают с поверхности кафеля. Пленки о высушивают в потоке воздуха при +25 С в течение 1 ч.

МА0 активность полученного диагностического препарата:

6,76 ° 10 Е/мг белка (по тирамину);

-4

5,62 ° 10 Е/мг белка (по серотонину);

4,71 ° 10 Е/мг белка (по бензиламину)

Бактериостатическая активность.

Задержка роста культуры кишечной палочки в пробах с пленкой диагностического препарата по сравнению с контролем без пленки 85,9 .

Препарат стабилен в 50 циклах работы. !

Прим е р 4. 0,8гжелатина обливают 9 мл воды для набухания.

Затем добавляют 10 мл фосфатного буфера с рН 7,4 и нагревают при перемешивании до растворения. Далее расто вор охлаждают до +20 С и вносят в него при перемешивании 2 r суспензии митохондрий в фосфатном буфере, рН 7,4. К полученному раствору до-. бавляют 1 мл раствора террилитина в воде с суммарной концентрацией 10 ПЕ, т.е. 0,5 ПЕ/1 мл. Смесь перемешивают, и выливают на полимерной мембране.

Высушивают в потоке воздуха в течение

1 ч . Сухую пленку обрабатывают раствором ГА в течение 2 мин и промывают аналогично примеру 3.

NA0 активность диагностического препарата.

4,55 ° 10 Е/мг белка (по тирамину);

3,7 10 F./ìã белка (по серотонину);

3, 1 ° 10 F./èã белка (по бензиламину) °

Бактериостатическая RKòèâíoñòü.

Задержка роста культуры в пробах с пленкой по сравнению с контролем

74,2,. . Препарат пригоден для 20 циклов работы.

Пример 5. !,6 г желатина обливают 15,6 мл воды для набухания.

Затем добавляют 20 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,4 и нагревают при перемешивании до растворения. Далее о раствор охлаждают до +20 С и вносят в него при перемешивании 4 г суспензии митохондрий в фосфатном буфере, рН 7,4. К полученному раствору добавляют 4,4 мл раствора террилитина в воде с суммарной протеолитической активностью, равной 440 единиц, т. е °

2р 11 ПЕ/1 мл. Смесь перемешивают и выливают на нерастворимую подложку.

Высушивают в потоке воздуха в течение 1 ч. Сухую пленку обрабатывают

8 -ным раствором ГА в течение 6 мин

25 и промывают.

NA0 активность диагностического препарата:

4,50 10 Е/мг белка (по тирамину);

3,72 ° 10 Е/мг белка (по серото-4

3,2 10 Е/мг белка (по бензиламинУ) .

Бактериостатическая активность.

Задержка роста культуры в пробах с пленкой по сравнению с контролем

Пленка имеет жесткую структуру, что проявляется как повышенная хрупкость, Препарат расслаивается после

40 18-20 циклов работы.

Пример 6. 0,2 гжелатина помещают в пробирку с 2 мл дистиллированной воды для набухания. Затем туда же добавляют 1 мл стандартного

45 фосфатного буфера, рН 6,86, нагрева. ют, перемешивая до кипения, при котором происходит полное растворение желатина. Далее раствор охлаждают о до +35 С и вносят в него при переме50 шивании 0,4 мл гомогената митохондрий печени крыс (таких же, как в примере 3). Добавляют 1,6 мл раствора террилитина с активностью 50 ПЕ, Затем в пробирку со смесью опускают

55 чувствительную головку электрода, слегка подсушивают (1 мин) его в о струе воздуха при +?О С в снова опускают в раствор. Операцию повторяют

5 раз, после чего высушивают пленку

1495378 на поверхности электрода в струе воздуха в течение 15 мин при +20 С. Далее электрод с сухой пленкой опускают на 4 мин в 5 -ный раствор глутарового альдегида. Затем вынимают электрод и тщательно промывают его водой и фосфатным буфером. Йоверхность электрода с планкой высушивают в о струе воздуха при +20 С в течение

15 мин и хранят в холодипьнике при

4-10 С. Для градуировки и в период работы электрод вымачивают в фосфатном буфере при рН 7,4 и хранят в нем в холодильнике.

MAO активность электрода:

6,7 10 Е/мг белка (по триамину);

5,45 10 Е/мг белка (по серото— 4 нину);

4,0, 10 Е/мг белка (но бензил1 амину).

MAO активность электрода сохраняется в течение года. Желатиновая пленка на электроде механически стабильна в условиях использования и может применяться для определения моноаминов в течение года. Предел обнаружения 4,55 10 моль/л.

Бактериостатическая характеристика пленки на электроде аналогична примерам 1, 2, 3.

MAO активность диагностического препарата в Е/мг, т.е. ц моль/мг белка по всем субстратам определяют электрохимическим методом с помощью электрода с газовым затвором по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции — аммиака. !

Бактериостатическую активность определяют и рассчитывают по задержке роста культуры кишечной палочки. в присутствии желатиновых пленок без добавок, с. добавкой МАО и с добавкой

МАО и террилитина. Для этих проб по сравнению с контролем задержка составляет соответственно 57, 75 и 86 .

Предел обнаружения моноаминов с помощью полученных препаратов МАО составляет 4,4 10 — 4, 55 ° 10 М.

Значительно возрастает активность целевого продукта по всем субстратам за счет добавления террилитина при иммобилизации (табл. 1) . Улучшаются также механические свойства пленок, что поз в оля ет длител ьно и с пол ьз ов ат ь их для проведения анализа.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет получить препараты пленок для определения мо-. ноаминов с улучшенными характеристиками за .счет повышения активности

MAO в 1,5 раза, увеличения механической прочности пленок и их антимикробного действия (от 75 до 86 ).

20@ормулаизобретения

1. Способ получения препарата для определения моноаминов на основе. иммобилизованной моноаминооксидазы, включающий введение гомогената мито25 хондрий, обладаюцих активностью моноаминооксидазы, в водный раствор желатина„ получение желатиновой пленки путем высушивания нанесенного на нерастворимую подложку раствора желати30 на и обработку полученной пленки глутаровым альдегидом, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью улучшения характеристик препарата за счет повышения активности моноаминооксидазы, механической прочности и антимикробных свойств пленки, после введения гомогената митохондрий в водный раствор желатина к полученной суспензии добавляют террилитин в ко40 личестве 1-10 протеолитических единиц на 1 мл обьема и полученную смесь немедленно наносят на нерастворимую подложку.

2. Способ по п. 1, о т ли чав

45 ю щ н и с я тем, что обработку пленки глутаровым альдегидом ведут в течение 3-5 мин.

1495378

Таблица 1

Образец смоль/мг условные ед./г белк а препарата по тирамину по серотонину

3,7 10 3,1 10

4,55 ° 10

1600

5,6 1Ь 4,6 10

6,8 ° 10

2400

Т а блица 2

Образец ачаль- 5 IO ный

20 30

50

Препарат с MAO активностью (без террилитина) 7,3 7,3 7, 1 5,6 Пленка расслаиваетт ся

7,5 7,5 7,5 7,5 7,2

12,0 12,0 12,0 12,0 )1,7

6,9

11,3

6,8

11,3

Составитель В. Муронец Редактор Н. Гунько Техред А.Кравчук Корректор О. Кравцова

Заказ 4217/26 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðîä, ул. Гагарина,101

Препарат с MAO активностью (без террилитина)

Предлагаемый диагностический препарат с МАО активностью (содержаций террилитин) Предлагаемый диагностический препарат с MAO активностью: образец 1 образец 2

Активность, смоль/мг Активность по бензиламину белка ес воздушносухого препарата, мг после количества циклов

Способ получения препарата для определения моноаминов на основе иммобилизованной моноаминооксидазы Способ получения препарата для определения моноаминов на основе иммобилизованной моноаминооксидазы Способ получения препарата для определения моноаминов на основе иммобилизованной моноаминооксидазы Способ получения препарата для определения моноаминов на основе иммобилизованной моноаминооксидазы Способ получения препарата для определения моноаминов на основе иммобилизованной моноаминооксидазы 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к иммунохимии и может быть использовано при проведении иммуноферментного анализа

Изобретение относится к вирусологии , в частности к экспресс-определению вирусных инфекций

Изобретение относится к биологии и может быть использовано для генетического контроля количества инбредных животных

Изобретение относится к медици- -не, в частности к кардиологии, и предназначено для прогноза заживления инфаркта миокарда

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики и определения степени тяжести синдрома малабсорции у детей

Изобретение относится к медицине , точнее к способу получения средств для извлечения из крови атерогенных липопротеинов, предназначено для ленения различных форм холестеринозов

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к технике проведения ферментативного анализа, может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, химической, пищевой и фармацевтической промышленности , а также в биотехнологии и постановке биохимических экспериментов

Изобретение относится к медицине , точнее к психиатрии и лредназначено для диагностики эпилепсии

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к способу получения иммобилизованной люциферазы светляков

Изобретение относится к биокатализаторам, которые могут быть использованы для окислительной деструкции вредных органических соединений, например тиодигликоля
Изобретение относится к пищевой промышленности

Изобретение относится к области биохимии
Изобретение относится к области контроля загрязнения окружающей среды, в частности, фосфорорганическими отравляющими веществами, инсектицидами, карбаматами и токсинами сине-зеленых водорослей

Изобретение относится к биотехнологии и экологии, конкретно к системам на основе микроорганизмов, осуществляющих расщепление углеводородов, причем микроорганизмы иммобилизованы на целлюлозосодержащем носителе
Наверх