Способ определения количества высокомолекулярных спиртов в растворе

 

Изобретение относится к способам определения количества биологически активных органических соединений и может быть применено в аналитической химии, биохимии, физиологии, в сельском хозяйстве для анализа феромонов спиртовой природы, микробиологии. Целью изобретения является расширение разрешающей способности способа, повышение чувствительности. Предложенный способ является принципиально новым подходом к определению количества высокомолекулярных спиртов, т.к. детекция ведется по образовавшемуся в результате реакции алкогольдегидрогеназы со спиртом длинноцепочечному альдегиду, чувствительность к которому бактериальной люциферазы чрезвычайно высока. Способ заключается в том, что раствор исследуемого спирта инкубируют в буферной среде с алкогольдегидрогеназой в присутствии никотинамидадениндинуклеотида, а затем в реакционную среду вводят очищенную бактериальную люциферазу B.HARVEYI, флавинмононуклеотид и дитионит натрия. Измеряют уровень биолюминесценции смеси, по которому судят о количестве исследуемого спирта. Чувствительность предлагаемого способа составляет 10<SP POS="POST">-13</SP>-10<SP POS="POST">-11</SP> моль для спиртов от деканола до гексадеканола. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИх.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК. (19) (11) (51) 4 С 12 Q 1/66

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

r1O ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4338753/31-13 (22) 03.12.87 (46) 23.07.89. Бил. № 27 (71) МГУ им. M. В. Ломоносова (72) Е. Г. Киселева, А. Д. Исмаилов и В. С. Данилов (53) 663.15(088.8) (56) Boss В. D., Haslett R. N. Application of pyrolisis, gas cromatography and шазз spectrometry for indentification of alcohols and carbonyl

isomers. — Anal. Chem. 1976, V. 48, № 2, р. 4 17-420.

Мартинек К., Хмельницкий Ю. А., Левашов А. В. и Березин И. В. Субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы в коллоидном растворе воды в. органическом растворителе. — Докл.

AH СССР, 1982, т, 263, № 2, с. 737—

741; (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СПИРТОВ В РАСТВОРЕ (57) Изобретение относится к способам определения количества биологически активных органических соединений и может быть применено в аналитической химии, биохимии, физиологии, s

Изобретение относится к способам: определения количества биологически активных органических соединений и может быть применено в аналитической химии, биохимии, физиологии, в сельском хозяйстве для анализа феромонов спиртовой природы насекомых.

2 сельском хозяйстве для анализа феромонов спиртовой природы, микробиологии. Целью изобретения является расширение разрешающей способности способа, повнпение чувствительности.

Предложенный способ является принципиально новым подходом к определению количества высокомолекулярных спиртов, т.к. детекция ведется по образовавшемуся в результате реакции алкогольдегидрогеназы со спиртом длинно— цепочечному альдегиду, чувствительность к которому бактериальной люциферазы черезвычайно высока. Способ заключается в том, что раствор исследуемого спирта инкубируют в буферной среде с алкогольдегидрогеназой в присутствии никотинамидадениндинуклеотида, а затем в реакционную среду вводят очищенную бактериальную люциферазу В. harveyi, флавинмононуклеотид и дитионит натрия. Измеряют уровень биолюминесценции смеси, по которому судят о количестве исследуемого спирта.

Чувствительность предлагаемого cnoco-i8 — и ба составляет 10 — 10 моль для спиртов от деканола до гексадеканола. 1 табл.

Целью изобретения является расширение разрешающей способности способа, повьппение чувствительности.

Способ заключается н том, что готовят смесь следующего состава в

0,1 М фосфатном буфере, рН 7,8-8,1

8 — 7 (конечные концентрации): 10 — 10 M

3, 149538 алкогольдегидрогеназы, 5 10 — 10 М никотинамилалениндинуклеотида, раствор исследуемого спирта. Смесь инкубируют 4-5 мин при комнатной темпе5 ратуре, затем добавляют 0,005—

0,001 мг/мп очищенной бактериальной люциферазы Benekea harveyi 2,5 ° 10 М флавинмононуклеотида и непосредственно перед измерением вводят 2-3 ° 10 M дитионита натрия. Конечный объем смеси составляет 0„5-0,6 мл. Затем измеряют уровень биолюминесценции сме си, по которому,с помощью калибровоч- ной кривой определяют количество ис- 15 следуемого спирта.

Предлагаемый способ является принципиально новым подходом к определению количества высокомолекулярных спиртов, так как детекция ведется не 20 по образовавшемуся в результате peaicции НАДН, а по высокомолекулярноЪф альдегиду, чувствительность к которому бактериальной люциферазы очень высока.

Предлагаемый способ позволяет определять количество высокомолекулярных спиртов, включая иепредельные, от деканола до гексадеканола, что невозможно с помощью известного спосо 30 ба.

Пороговая чувствительность приведена в таблице.

Пороговая чувстви-.35 тельность, моль

Соединение

Калибровочную кривую строят с учетом эффекта ингибирования люциферазы додеканолом, вводя поправочные коэффициенты, начиная с 10 M концентра". ции додеканола, полученные при измерении интенсивности свечения смеси при отсутствии алкогольдегидрогеназы.

Кроме того, из полученного значения интенсивности вычитают фоновое свечение, измеряемое при отсутствии в смеси додеканола.

Диапазон линейности калибровочной кривой в координатах 1g 61/1g С для додеканола составляет 10 — 10 M.

Например, если I = 0,8 мВ при

I< 0,7 мВ и к = 1, то получают кон. центрацию додеканола в пробе, равную

10 М, Пример 2. Все операции проводят аналогично примеру 1, но берут тетрадеканол. Например, если Х 0,9 мВ при Тф = 0,75 мВ и к = 1, 7 ° 10

Гексанол

Октанол.

Деканол

До де к анол

Тетрадеканол

5 10

Цис-6-гек садеценол

Иис-11-гексадеценол

5 10

Известный Предлагаспособ гаемый способ 40

Из таблицы видно, что пороговая чувствительность предлагаемого способа в 10 раз выше по сравнению с из-. вестным (для деканола).

4

Пример 1. Берут слеклянный стаканчик, снабженный мешалкой, и в нем готовят смесь следующего состава в 0,1 М фосфатном буфере, рН

7,9 (конечные концентрации): 10 M алкогольдегидрогеназы (Agf) с активностью 25 ед/мг, 5 10 М никотинамидадениндинуклеотида (НАД). В смесь вносят 0,01 мл раствора додеканола и инкубируют при комнатной температуре и перемешивании 4 мин.

Затем в реакционную смесь добавляют

0,005 мг/мп очищенной бактериальной люциферазы В. harveyi с удельной активностью. 75 мВ/мг по дитиониту натрия, 2-10 М флавинмононуклеотида (ФМН) и непосредственно перед измерением вводят 2 10 М дитионита натрия.

Конечный объем смеси составляет

0,5 мл.

Стаканчик помещают в кюветное отделение фотоиетра с детектором света и значение интенсивности биолюминесценции (I ) определяют по второй вспышке, которое выражают в милливольтах (мВ). Полученное значение

I с учетом поправочного коэффициента на ингибирование (к) и за вычетом фонового свечения (I<) используют для определения концентрации додекаиола в пробе по калибровочной кривой.

Для построения калибровочной кри-т вой используют. 10 М раствор додекаиола в этаноле, разбавленный водой B

10 — 10 раз. а в

95382 тельности способа.

5 14 то получают концентрации тетрадеканола в пробе, равнуи 10 s M.

Диапазон линейности калибровочной кривой 10 8 — 10 М, Ингибирование и введение поправочных коэффициентов начинается с 10 М.

Пример 3. Все операции проводят аналогично примеру 1, но берут цис-6-гексадеценол. Например, если

I = 0 85 мВ при Т, = 0,7 мВ и к = 1, то получают концентрацию в пробе, равнуи 10 М.

Диапазон линейности калибровочной кривой 10 8 — 10 M.

Ингибирование и введение поправочных коэффициентов начинается с 5 х х 10 М.

Пример 4. Все операции проводят аналогично примеру 1, но берут реагенты в следующих соотношениях:

l0 М АДГ, 10 M НАД, 0,01 мг/мл люциферазы, 5 ° 10 M ФИН, 3 10 M дитионита натрия в 0,1 М фосфатном буфере, рН 8,1. Конечный объем смеси составляет 0,6 мл.

Диапазон линейности калибровочной кривой для деканола 10 — 10 М, Например, если 1 7,0 мВ при

I = 6,2 мВ и к = 1, то получают концентрацию деканола в пробе, равную

10 M.

Ингибирование и введение поправочных коэффициентов начинается с 5 х х 10 M.

Пример 5. Все операции проводят аналогично примеру 4, но берут цис-11-гексадеценол. Например, если Io = 7,6 мВ при I = 6 3 мВ и к = l,l,то ? с учетом к равно

8, 4 мВ, что соответствует 5 10 М . ° концентрации в пробе.

Диапазон линейности калибровочной кривой 5 ° 10 — 10 M.

Ингибирование и введение поправочных коэффициентов начинается с 5 х х 10 М.

Пример 6. Все операции проводят аналогично примеру 1, но берут . реагенты в следующих соотношениях:

5 10 М АДГ, 10 М НАД, 0,001 мг/мл люцеферазы, 2-10 М ФИН, 2.10 М дитионита натрия в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,5. Конечный обьем смеси составляет 0,5 мл.

Например, если при определении

- додеканола Т = 0,2 мВ при I

= 0,2 мВ и к = 1, то превьнпейия над фоном не наблюдается и додеканол не определяется.

Выход за диапазон оптимальных кон5 центраций реагентов в сторону уменьшения приводит к невозможности определения спиртов.

Пример 7. Все операции проводят аналогично примеру 1, но берут реагенты B следующих соотношениях.

5 10 М АДГ, 5 10 М НАД, О 05 мг/мл лициферазы, 5 IO М ФМН, 3 -10 M дитионита натрия в О, 1 М фосфатном буфере, рН 8, О. Конечный объем смеси составляет 0,6 мл.

Например, если при определении тетрадеканола ? = 17,6 мВ при I P

17,4 мВ и к = 1, то получаит концентрации, равную 10 М.

Выход за диапазон оптимальных концентраций реагентов в сторону увеличения приводит к ухудшению чувствиИспользование предлагаемого способа имеет следующие преимущества перед известными способами подобного рода: возможность определения количества насыщенных и ненасыщенных спиртов от деканола до гексадеканола, ловленная чувствительность способа.

Ф о р м у л а и з о б.р е т е н и я

Способ определения количества высокомолекулярных спиртов в растворе, включающий приготовление реакционной смеси в фосфатном буфере, содержащей алкогольдегидрогеназу, никотинамилалениндинуклеотид и раствор исследуемого спирта, определение скорости ферментативной реакции физико-химическим методом с последующей оценкой количества исследуемого спирта, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью расширения разрешающей способности и повыпения чувствительности способа, в реакционнуи смесь дополнительно вводят 0,005-0,001 мг/мл очищенной бактериальной лициферазы

Benekea harveyi, 2 ° 10 — 5 10 M флавинмононуклеотида, 2 10 — 3.10 M дитионита натрия, а скорость ферментативной реакции определяит по уровню биолиминисценции смеси, ло которой при помощи калибровочной кривой. проводят оценку количества исследуемого спирта.