Способ определения активности гликогенфосфорилазы

 

Изобретение относится к биохимическому анализу и может быть использовано для определения гликогенфосфорилазы в сыворотке крови. Целью изобретения является повышение чувствительности определения, сокращение времени анализа, расширение диапазона определяемых активностей и упрощение процесса. Изобретение состоит в том, что используют четырехферментную систему: фосфоглюкомутаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, НАДН<SB POS="POST">2</SB>: ФМН-оксидоредуктаза, бактериальная люцифераза, соиммобилизованную на BRCN -агарозе при PH 7,5 - 8,0, и процесс регистрации ведут люминесцентным способом по начальной реакции, катализируемой гликогенфосфорилазой. 1 табл.

СОЮЗ СОНЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51) 4 С 12 Я 1/бб

3ИКЗЗЫ3

ИНГОЮ- li":!:; Е ь "

Е ; БЛ1О;. :Г,й, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ лиза.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4291695/31 — 13 (22) 11.08.87 (46) 30.07.89. Бюп, ¹ 28 (71) МГУ им. M.Â.Ëîìîíoñîâà и Всесоюзный кардиологический научный центр AMH СССР (72) И.Г.Фрумкина, О.В.Лебедева, Н.Н.Угарова, В.А.Амелюшкина, И.Ф.Чернядьева и В.Н.Титов (53) 577.15.07(088,8) (56) Anal Biochem, 1981, 110, №- 1, р.43-48.

Arch Bioch. Bioph., 1983, 226, № 1, р.285-291.

Meth. Enzym, 1976, v.44, р ° 453

488 °

Anal Biochem, l983, 131, № 2, р. 318-323 .

Изобретение относится к биохимическому анализу, а именно к способу определения активности гликогенфосфорилазы, и может быть использовано для определения гликогенфосфорилазы в сыворотке крови.

Цель изобретения — повышение чувствительности определения, сокращение времени проведения анализа, расширение диапазона измеряемых активностей, упрощение процесса.

Изобретение заключается в том, что используют четырехферментную систему, включающую: фосфоглюкомутазу. глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу, НАДН

ФМН-оксидоредуктазу и бактериальную

„„SU„„1497218 А 1, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Al(ThBHOCTH

ГЛИКОГЕНФОСФОРИЛАЗЫ (57) Изобретение относится к биохимическому анализу, и может быть использовано для определения гликогенфосфорилазы в сыворотке крови.

Целью изобретения является повышение чувствительности определения, сокращение времени анализа, расширение диапазона определяемых активностей и упрощение процесса. Изобретение состоит в том, что используют четырехферментную систему: фосфоглю,комутаза, глюкозо — 6-фосфатдегидрогеназа, НАДН : ФМН-оксидоредук таза, бактериальная люцифераза, соиммобилизованную Ha BrCN-агарозе при рН 7,5-8,0, и процесс регистрации ведут люминесцентным способом по на- . чальной реакции, катализируемой гликогенфосфорилазой.

1 люциферазу, .которые предварительно соиммобилизуют на BrCN-агарозе. .Соиммобилизацию ферментов проводят путем инкубации буферного раствора с рН 7,5-8,0, содержащего фосфоглюкомутазу (20-200 Е/мп), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (10-100 Е/

/мп), НАДН . ФМН-оксидоредуктазу (2-20 Е/ип) и люциферазу (20-200 Е/

/мп) с суспензией BrCN-агарозы.

Указанный диапазон активностей ферментов, используемый для анализа,, является необходимым условием достижения высокой чувствительности ана218

3 1497

Каждому значению активностей любого из четырех ферментов соответ- . ствуют определенные оптимальные значения активностей трех других ферментов, лежащие строго в указанных диапазонах. Использование ферментов с активностями, лежащими за пределами указанных диапазонов, приводит к снижению чувствительности анализа, поскольку зависимость активности иммобилиэованпых ферментов . от их исходных активностей имеет колоколообразный характер.

Для проведения анализа может быть использован экстракт светящихся бактерий, получаемый фракционированием экстрактов бактерий Beneckea harveyi сульфатом аммония от 50 до 100 насыщения.

Предлагаемый способ позволяет определять гликогенфосфорилаэу в диапазоне активностей 0,01-10 Е, т.е. предел обнаружения снижается в пять раз по сравнению с известным и наблюдается необходимое для целей медицинской диагностики расширение диапазона измеряемых активностей. Достигаемое повышение чувствительности анализа связано, по-видимому, с акти° вацией полиферментной системы в соиммобилизованном состоянии.

Пример 1. Получение соиммобилизованной четырехферментной системы

Лиофилизованную ВгСИ-агароэу замачивают на 3 ч в дистиллированной воде, затем промывают 1 мМ НС1 и

0,1 M Na-фосфатным буферным раствором, рН 7,8. В 0,1 M Na-фосфатном буферном растворе, рН 7,8, готовят раствор ферментов с общей концентрацией .белка 4-8 мг/мл, который содержит 100 E/ìë фосфоглюкомутазы, 50 Е/мл глюкоэо-6-фосфатдегидрогеназы, 10 Е/мл НАДН : ФМН-оксидоредуктазы и 100 Е/мл бактериальной люциферазы. К полученному раствору добавляют BrCN-агарозу из расчета

100 мп/мл и полученную суспензию о встряхивают на качалке 20 ч при 4 С.

Затем носитель промывают 0,1 М Na-фосфатным буферным раствором, рН .

7,0, содержащим 0,5 М NaC1, до исчезнования ферментативной активности в промывных водах. Носитель с иммобилизованными ферментами суспендируют в 0,5 M трис-ацетатном буферном растворе, рН 6,0, содержащем

1 мг/мл аэида натрия, получают суспен эию с содержанием носителя

100 мг/мп, которую хранят при 4 С.

Для длительного хранения суспензию лиофилизуют порциями по О, 5 мл.Удельная активность получаемых препаратов 40 Е/мп агарозы, Пример 2. Иммобилизацию проводят так же, как в примере 1 за исключением того, что раствор ферментов содержит 200 Е/мл фосфоглюкомутазы,. 100 Е/мп глюкозо-6-фосфатдегидрогенаэы, 20 Е/мп НАДН

ФМН-оксидоредуктазы и 200 Е/мл бактериальной люциферазы. Удельная активность получаемых препаратов

30 E/ìë агарозы.

Пример 3. Иммобилизацию проводят так же, как в примере 1 за исключением того, что раствор ферментов содержит 20 Е/мл фосфоглюкомутаэы, 10 E/ìë глюкоэо-6 — фосфат дегидрогенаэы, 2 Е/мл НАДН . ФМН-оксидоредуктазы и 20 Е/мл бактериальной люциферазы. Удельная активность получаемых препаратов 20 Е/мп агароэы.

Пример 4. Иммобилиэацию проводят так же, как в примере 1 за исключением того, что раствор ферментов готовят в 0,1 М Иа-фосфатном буферном растворе, рН 7,57.

Удельная активность получаемых препаратов 30 Е/мл агарозы.

Пример 5. Иммобилиэацию проводят так же, как в примере 1 за исключением того, что раствор ферментов готовят в 0,1 М Na-фосфатном буферном растворе, рН 7,0. Удельная активность получаемых препаратов 25 E/ìë агарозы.

Пример 6. Определение активности глюкогенфосфорилаэы.

При определении активности гликогенфосфорилазы в кювету люминометра последовательно вносят: 1 мл

0,05 М трис-ацетатного буферного раствора, рН 6,8-7,0, 0,05 мл раствора гликогенфосфорилазы, 0,05 мл раствора, содержащего 0,06 М ацетата магния, 30 мг/мп гликогена, 0,15 мМ глюкозо-1,6-дифосфата.Смесь инкубируют в течение 8-12 мин при

30 С. Затем в кювету добавляют 0,05мп суспензии соиммобилизованной четырехферментной системы, приготовленной, как указано в примере 1, 0,1 мл

0,3 мМ раствора деканаля в 2 -ном у = 1,00х — 8,20, где у — 1g 1 (интенсивность свечения, В); х — 1g С (интенсивность глюкозо — 1 — фосфата, И).

Расчет активности гликогенфосфорилазы в ME (мкМ/мин) проводят по формул е

А=kА активность гликогенфосфорилазы, МЕ; — активность гликогенфосфорилазы, В/мин; где А

А где V объем реакционной смеси, мл (1, 5); объем раствора гликогенфосфорилазы, мп (0,05).

5 149 п-пропаноле, 0,05 мл 30 мМ раствора

НАД в воде и регистрируют фоновое свечение. Добавляют 0,1 мл раствора 0,15 M фосфата и полученную смесь инкубируют в течение 1 мин. Затем в течение 2 мин регистрируют увеличение интенсивности свечения при постоянном перемешивании. За меру активности гликогенфосфорилазы принимают тангенс угла наклона получаемой прямой (В/мин).

Укаэанная последовательность операций при проведении анализа, а именно раздельное добавление субстратов гликогенфосфорилазы (сначала гликогена, а затем после инкубации неорганического фосфата), необходима для стандартизации условий регистрации свечения. В противном случае не наблюдается воспроизводимости экспериментальных данных.

Перевод активности гликогенфосфорилазы в международные единицы (MKM/ìèí) осуществляют по калибровочному графику зависимости свечения от концентрации глюкоэо-1-фосфата (продукта гликогенфосфорилазной реакции).

Калибровочный график представляет собой прямую в интервале концентраций глюкозо-1-фосфата от 1 нМ до

10 мкМ. Калибровочную прямую обрабатывают по методу наименьших квадратов. Получают уравнение

7218

Проводят определение активнс сти приготовленггых раствс ров . лпкогенфосфорилазы. Результаты препставлсны ниже .

Введено гликогенфосфорилаэы, МЕ

Сигнал, мВ/мин

3,0

5 3

7,5

18

62,5

307

613

0,01

0 05

0,10

0,25

0 50

1,00

5,00

10,00

15

Полученные данные с бработали по методу наименьших квадрато». Полу20 чили уравнение: у =- 61,04х + 2,44, где у — сигнал (мВ/мг гг); х — введенное количество гликогенфосфорилазы (ИЕ) .

Ошибка определения не превышает

25 157

Пример 7. Определение ак— тивности гликогенфосфорггла зы В.

Определение активности гликогенфосфорилазы В проводят так же, как

30 и определение активности гликогенфосфорилаэы, за счет исключения того, что раствор, содержащий гликоген, ацетат магния и глюкоэо — 1, 6-дифосфат, содержит еще 0,03 И АИР.

Соиммобилизованная система приготовлена, как указано в примере 1.

Введено 0,3 Е гликогенфосфорилазы.

Определено 0,28 E гилкогенфосфорилазы. Ошибка определения 107,.

40 Пример 8. Определение активности гликогенфосфорилазы в сыворотке крови.

Сыворотку крови пропускают через колонку, заполненную крахмалом. Крах45 мал (20 г) суспенидруют в 40 мп

0,02 М трис-ацетатного буферного раствора, содержащего 1 мМ дитиотреитола, и оставляют набухать в течение о

2 ч при 4 С. В колонку (1 х 5 см) вносят 2 мл суспензии крахмала.

Затем пипеткой 1 мл сыворотки крови.

После нанесения сыворотки крови в колонку вводят 2 мл 0,02 M трис-

-ацетатного буферного раствора, рН

55 7 0 затем элюируют Глггг<ОГ еггфосфорилазу 1 мл 0,05 M трис-ацетатного буферного раствора, рН 7,6, содержащего 10 мг/мп гликогена и 0,05 мМ

ЭДИА, при 20 С.

1497218

Способ определения активности гликогенфосфорилазы, пр едусматриващий использование четырехферментной системы, содержащей фосфоглюкомутаСоставитель А.Пугач

Техред М.Ходанич .

Корректор M.Øàðoøè

Редактор Н. Киштул,инец

Заказ 4406/29 Тираж 501 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина,101

Для очистки следующей. порции сыворотки используют новую порцию крахмального геля.

Активность .гликогенфосфорилазы в элюате определяют, как описано в примере 2, но вместо 1 мл трис-ацетатного буферного раствора и 0,05 мл раствора фермента используют 0,5 мп элюата с колонки и 0,5 мл трис-ацетатного раствора, рН 7,0 Использованная четырехферментная соиммобилизованная система приготовлена, как указано в примере 1. Расчет активности гликогенфосфорилазы в МЕ проводят так же, как в примере 6, за исключением того,- что объем сыворотки

0,5 мп.

Формула изобретения. 20

5У глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу, оксидоредуктазу и бактериальную лю" циферазу, с последующей оценкой результатов биолюминесценцией, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности определения гликогенфосфорилазы, сокращения времени анализа, расширения диапазона измеряеМлх активностей и упрощения процесса, используют ферменты, соиммобилизованные на BrCN-агарозе при рН 7,5-8,0, при содержании фосфоглюкомутазы 20-200 Е/мп, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 10-100 Е/мл, H Hz . ФМН-оксидоредуктазы 2-20 Е/

/мл и бактериальной люциферазы 20—

200 Е/мл, определение ведут путем последовательного добавления к анализируемому образцу гликогена суспензии соиммобилизованных ферментов и их субстратов и затем неорганического фосфата,а результат оценивают по начальной скорости реакции, катализируемой гликогенфосфорилазой.