Гексапептид, обладающий способностью в составе конъюгата с тироглобулином или гемоцианином индуцировать антитела, взаимодействующие с вирусом гриппа н @ n @

 

Изобретение касается пептдов, в частности гексапептида ф-лы H-LYS-GLY-PRO-ASP-SER-GLY-OH, который обладает способностью в качестве конъюгата с тироглобулином или гемоцианом индукцировать антитела, взаимодействующие с вирусом гриппа H<SB POS="POST">3</SB>N<SB POS="POST">2</SB>, что может быть использовано в медицине и ветеринарии. Цель - создание новых пептидов с более простой структурой для указанного назначения. Синтез ведут карбодиимидным методом для образования пептидной связи и метода активированных эфиров с использованием блокирования функциональных групп и последующего деблокирования. Новый пептид обладает действием, аналогичным известному, но более сложному по структуре, пептиду. 1 ил., 6 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

1 4 А1 (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4281730/31-04 (22) 10. 07. 87 (46) 30. 10. 89. Бюл. В 40 (71) Институт молекулярной биологии

Ah СССР, Таджикский государственный университет им. В.И.Ленина и Научноисследовательский институт коммунальной и общей гигиены им. А.Н.Сысина (72) В.А.Шибнев, А.Н.Шарецкий, Л,В.Аристовская, Ш.Х.Халиков и P.Â.Âàëèåâ (53) 547.964.4.07 (088.8) (56) Sbapira М., Jibson N. Ми1ler G., Auron К. Immunity and protection against influenza virus by syntHetic

peptide corresponding to antigeniс

sits of. hemagg1utinin. — PNAS USA, 1984, v. 81, р. 2461-246 . (54) ГЕКСАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ В СОСТАВЕ КОНЪЮГАТА С ТИРОГЛОБУЛИНОМ ИЛИ ГЕМОЦИАНИНОМ ИНДУЦИРОВАТЬ

Изобретение относится к новым биологическим соединениям — пептидам, способным в составе конъюгата с тироглобулином и гемоцианином индуцировать образование антител, взаимодей--.ьую их с вирусом гриппа H>N<, которые могут найти применение в медицине и ветеринарии.

Цель изобретения — поиск в ряду производных пептидов, обладающих высокой эффективностью в отношении индуцироваиия антител, взаимодействующих с вирусом гриппа Н 1",, и имеющих более просгую структуру. (51) 4 С 0 7 К 7 / 06 А 6 1 К 3 7 / 0 2

АНТИТЕЛА, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С ВИРУСОМ ГРИППА Н Х (57) Изобретение касается пептидов, в частности гексапептида ф-лы Н-Lys-Gly-Pro-Asp-Ser-Gly-ОН, который о6ладает способностью в качестве коньюгата с тироглобулином или гемоцианом индуцировать антитела, взаимодействующие с вирусом гриппа H N что может быть использовано в медицине и ьетеринарии. Цель — создание новых пептидов с более простой структурой для указанного назначения, Синтез ведут карбодиимидным методом для обре=;ования пептидной связи и метода активированных эфиров с использованием блокирования функциональных групп и последующего деблокирования.

Новый пептид обладает действием, аналогичным известному, но более сложному по структуре пептиду. 1 ил., 6 табл.

Индивидуальность полученных соединений контролиру..т тонкослойной хроматографией в сис,.емких. A — хлороформ — метанол (6u;13), Б — н,бутанол вода — уксусная кислота (4:1:1), b— втор.бутанол — 3/-ный Nh > (водный), à — н.бутанол — вода — пиридин - уксусная кислота (30:24:20:6). Вещества характеризуются температурой плавления, показателем удельного оптического вращения. Приняты следующие обозначения: DCC — дициклогексилкарбодиимид, Вос — трет. бутилоксикарбонил, Z — бензилоксикарбонил, 013zl — бен1518340 зильная группа, ONP — р-нитрофенильная группа.

Характеристика и выход промежуточных соединений приведены в табл.1.

Пример 1. Получение синтети еского пептида. Вос-Ser(OBzl)-Gly-OBzl (I).

К раствору 2 г (5,6 ммоль) Boc-Ser(0Bzl)-ОН в 15 мл этилацетата при охлаждении до (— 10) — (-15) С и перемешивании добавляют 1, 16 г (5,6 ммоль)

DCC и через 5 мин 0,93 г (5,6 ммоль)

H N-Gly-OBzl в 10 мл этилацетата.

Смесь перемеыивают 2 ч при О-(-5) С и оставляют на ночь в морозильнике,после этого перемешивают 1 ч при 20 (, и прибавляют 1-2 капли Ch CÎOh, ох3 лаждают до -5 C и отфильтровывают ди20 циклогексилмочевину, растворитель упаривают в вакууме, остаток растворяют в минимальном количестве этилацетата и отфильтровывают остатки дициклогексилмочевины, фильтрат разбавляют этилацетатом до 50 мл и последовательно промывают 10Х-ной ли— монной кислотой (10 мл х 21), 0,5 н.

ИаНСО, (10 мл х 2) и водой. Раствор сушат над безводным Na SO< и растворитель упаривают в вакууме. Получают твердое аморфное вещество.

НС1 Н-Ser(OBzl.)-Gly-OBzl (II).

2, 1 r (5,2 ммс пь) (1) растворяют в 10 мл абс. атил.ъцетата и, добавив

3 мл 3 н. НС1 в эl. ëàöåòàòå, выдер35 живают 40 мин при 20 С. Продукт осаждают абс. эфиром. Эфирный раствор отделяют от осадка декантацией, осадок сушат в вакууме и переосаждают из метанола эфиром.

Вос-Asp-ф-OBzl)-Ser(08zl)-Gló-Obz1 (II1)

Получают аналогично (1) исходя из 1,52 г (4,7 ммоль) Вос-Лзр(Р-Obz1)—

-OH в 15 мл этилацетата, 0,97 г (4,7 ммоль) DCC и 1,8 г (4,7 ммоль) (II) в 10 мл этилацетата, содержащего 0,66 мл (14,7 ммоль) 1 триэтил,;мина. Фильтрат после отделения дициклогексилмочевины упаривают в ваку50 уме, остаток растворяют в 50 мл этилацетата и обрабатывают аналогично (I)

НС1 H-Asp(p-OBzl)-Ser(OBzl)-Gly-0bzl (IV)

Получают аналогично (II), используя 0,5 г (0,77 ммоль) (111) и 0,5 мл

3 H. НС1 в этилацетате. Смесь выдерживают 40 мин при 20 С и переосг :лают из сухого ацетона абс. эфиром.

Вос-Pro-Asp(P-OBzl)-Ser(OBzl)—

-Gly-0Bzl (V).

Получают аналогично (I), используя 0,54 г (12 ммоль)(I) Вос-Pro-ОН в 20 мл СН Cl„, 0,42 г (2 ммоль)

DCC 1,2 г (2 ммоль) (IV) и 0,4 мл (2 ммоль) триэтиламина.

Продукт очищают переосаждением из этилацетата абс. эфиром.

НС1 Н-Pro-As> (P — OBzl)-Ser(OBzl)—

-Gly-ОВгl (VI) .

Получают аналогично (11), исходя из 0,8 г (1 ммоль) (V) и 0,7 мл 3 н.

НС1 в этилацетате. Через 45 мин продукт высаждают абс. эфиром. Очищают переосаждением из метанола эфиром.

Вос-Lys ((-а) -G1y-OH (VII) .

К раствору 0,9 r (1,7 ммоль) BocLys((-4)-ONP в 5 мл диметилформамида прибавляют О, 13 г (11,7 ммоль) 1 Н-01у-OH растворенного в 1,7 мл 1 н.

ha0H. Смесь перемешивают 15 ч при

20 С. Растворитель упаривают в вакууме, остаток растворяют в 15 мл воды и промывают эфиром (5 мл х 3). Водный слой подкисляют при охлаждении кристаллической лимонной кислотой до рН 3-4 и продукт экстрагируют этилаце татом (10 мл х 3), экстракт ггромывают водой, сушат безводным Иа 80 и растворитель упаривают в вакууме и получают твердый аморфный продукт.

Вос-Lys(-(-Z)-Gly-Pro-Asp(P-ОВгl)-Ser(OBzl)-Gly-OBzl (VIII).

Получают аналогично (Т), исходя иэ 0,33 г (0,8 ммоль) (VII) в 15 мл

СН Сl, 0,16 r (0,8 ммоль) DCC u

0,6 г (0,8 ммоль) (VI) и 0,11 мл (0,8 ммоль) триэтиламина. Продукт очищают на колонке с силикагелем

- †1/160 (3 х 55 см). Продукт элюируют смесью СНС1 -СН ОН-СН СООН (20:1:0,5) со 15 мл/ч. фракции отбирают по 5 мл.

Н-Ьуз(1-2,)-Gly-Pro-Asp(p-OBzl)-her(OBzl)-Gly-0Bzl (IX).

Получают аналогично (II), растворяя 0,3 r (0,26 ммоль) (VIII) в

0,34 мл 3,5 н. НС1 в этилацетате.

Через 45 мин продукт высаждают абсолютным эфиром и обрабатывают амберлитом IRA-401 (ОН-форма) .

Н-Lys-Gly-Pro-Asp-Ser-Gly-Îh (Х)

0,2 г (0,36 ммоль) (IX) растворяют в 20 мл СН OH, содержащего 0,5 мл

СН СООН, и гидрируют над Pd-чернью

1518340

10 до полного отщепления бензильных групп. Растворитель упаривают, а остаток очищают переосаждением из метанола эфиром. Аминокислотный анализ:

Lys — 0.94 (1), Gly — 1,96 (2), Fro — 1,00 (E), Asp — 0,9 (1), Ser—

0,89 (1) .

Пример 2. Получение конъюгатов гексапептида с тироглобулином (ХЕ).

К раствору 0,85 г тироглобулина в 5 мл воды добавляют 0,1 г 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и 0,03 г (Х). Смесь перемешивают

24 ч при 20 С, затем диализуют 20 ч против воды. Продукт лиофильно высушивают, получают 0,037 г. Эпитопная плотность пептида на один моль белканосителя, определенная методом Лоури, 17 моль (Х) на один моль тироглобулина. Конъюгат гексапептида (Х) с гемоцианином улитки (XII) получают в условиях, аналогичных (ХЕ), исходя из 0,05 г гемоцнанина, 0,1 г 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид и 0,03 г (Х). Выход (XII) 0,04 г.

Определение эпитопной плотности конъюгатов (ХЕ) и (XII) проводят по методу Лоури из кривых зависимости 0 оптической плотности от концентрации построенных для тиреоглобулина (ТГ), гемоцианина (ГЦ) и гексапептида.

Полученные данные представлены в табл.2.

Таким образом, эпитопная плотность

35 пептида на белке-носителе соответствует Тà — пептид соединение (ХЕ)

17, ГЦ вЂ” пептид соединение (XII) — 15.

Определена биологическая активность предлагаемых конъюгатов.

Пример 3. Получение антител против конъюгатов гексапептида с тироглобулином и гемоцианином.

Полученные конъюгаты использовали 45 в качестве аытигенов для иммунизации мышей самцов линии СВА массой 25-30 r.

Первые две инъекции соединениями (XZ) и (XII) производили в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) в дозе 150 мкг/мьш ь под кожу холки и корня хвоста с 3-не50 дельным интервалом. Разрешающую дозу вводили через 4 недели без адъюванта в дозе 100 мкг/мышь.

В сыворотке крови определяли титр антител непрямым вариантом твердофаэного иммуноферментного метода (EL, ISA) в стандартных 96-луночных полистироловых камерах. Характер взаимодействия антител с антигеном, иммобилизованным на полистироле, оценивали методом конкурентного ингибирования.

Результаты исследования (табл.3) показали, что гексапептид Х, конъюгированный с молекулой белка-носителя после 3-кратного введения мышам способен индуцировать образование специфических антител. При этом характер иммунного ответа зависит от носителя. Если носителем является тироглобулин, то у подопытных животных определяется высокий уровень антител к гексапептиду, которые способны перекрестно взаимодействовать с гемагглютинином и самим вирусом гриппа H ii . Если в качестве носителя применять гемоцианин, то уровень антител к гексапептиду ниже, хотя и эта сыворотка в довольно высоком титре (6,4-7,5) способна взаимодействовать с гемагглютинином и вирусом гриппа (табл. 3).

Пример 4. Определение специфичности антител, индуцируемьгх предлагаемым конъюгатом гексапептида.

Проведено сравнительное исследование взаимодействия мышиной анти ГП иммунной сыворотки с гомологичным антигеном (ГП), гемагглютинином вируса гриппа HzN, вирусом гриппа П Е и вирусом гриппа свиней HI в реакции твердофазного иммуноферментного метода (ELT.SA) .

Полученные данные представлены в табл. 4.

Из данных табл. 4 следует, что антитела, индуцированные ГП, обладали достаточно высокой специфичностью, поскольку перекрестно не реагировали с вирусом гриппа свиней HI.

1,0

Q

1 8 Y $6 7 8 9 10 11

Из графика видно, что введение полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) контрольным животным (мыши СВА) практически не приводило к образованию ан7

1518340 8 тител, перекрестно реагирующих с ГП, иммобилизованным на полистироле в реакции ELISA.

Титр антител в 1ог. <

° — взаимодействие иммунной сыво5 ротки, полученной от мышей, иммунизированных ГП-тиреоглобулином с ГП;

Π— взаимодействие сыворотки крови 10 жппей, получивших ПАФ, С ГП, Ь вЂ” взаимодействие сыворотки крови интактных мышей с ГП.

Изучена возможность перекрестного н аимодействия антител против тиреоглобулина быка (ТГ) и гемоцианина улитки (ГЦ) с ГП, гемагглютинином вируса гриппа и вирусными частицами

Н.,1 (табл. 5).

Как следует из данных табл. 5, 20 антисыворотки против ТГ и 14 практически не реагировали с ГП, гемагглютинином и вирусом гриппа, иммобилизованными на полистирольных платах.

Отсутствие выраженного перекрестного 25 взаимодействия анти-ГП антител с тиреоглобулином и гемоцианином было доказано в реакции конкурентного ингибирр.вя.:ия табл.6) .

Для этО, О в дPд Г систсмур сОстОЯ 30 щую из антигена (i 1i), иммобилизован- Гексапептид формулы ного на полистироле, и антител (иммунная сыворотка, содержащую антитела против ГЦ}, вводили препараты тиреоглобулина (Т1) и гемоцианина (ГЦ), а также в качестве контроля столбнячный анатокси . Ингибиронание нзаимодействия анти-ГП антител с ГП при этом не превышала 10-157. В этом случае, когда в систему вводят адекватное количество ГП, происходило практически полное ингибирование реак1 ции — антиген-антитело.

Таким образом, показано, что антитела против конъюгата гексапептида специфичны и индуцированы ГП (детерминантой), а не носителем.

Проведенные испытания показали, что предлагаемый гексапептид в составе конъюгата с тироглобулином или с гемоцианином способен индуцировать образование антител, которые в высоком титре взаимодействуют с гемагглютинином и интактным вирусом гриппа

Н>Н . Специфичность антител доказана отсутствием перекрестной реакции с вирусом гриппа свиней, ПАФ и белками-носителями. От известных пептидов, обладающих аналогичным биологическим действием, предлагаемый гексапептид отличается более простой структурой и, следовательно, большей экономичностью в производстве.

Формула изобретения

Н-Lys-Gly-Pro-Asp-Ser-Gly-ОН, обладающий способностью в составе конъюгата с тироглобулином или гемоцианином индуцировать антитела, взаимодействующие с вирусом гриппа Н4,Й

Таблица 1

2 4 () град (в этаноле) Т. пл., С

Соединение

Г (Выход, Ж

А Б В Г

Аморфный + 14 (C= 1) 1

3

5

7

9

0,81

0,41

0,74

0,43

0,61

0,69

0,1

0,78

0,37

0,76

0 63

0,85

0,88

0,80

0,39

0,70

0,85

0,72

0,10

0,80

0,69

0,87

0,87

0,87

0,63

0 75

0,93

0,73

0,37

91,6, 88,8

81,6

68,0

62,5

82,0

82,0

61,0

76,9

90,0

+13(С=0,46) 77-78

Аморфный

84-85

Аморфный

0,64

0,76

0,54

0,84

0,81

0,24

-13(С=0,30) 10,5(С=0,38)

-26(С=0,30) 130-132

Аморфный

180-182

1518340

Таблица 2

Концентрация, 10 М

Название Оптическая плотность

ТГ ГЦ

ТГ ГЦ

Белок +

+ Пептид

Белок

Пептид

0,39

О, 18

0,21

0,31

0,18

0,13

0,077

1,15

О,G25

0,42 цептид 0,42 10 1т

ТГ 0,025.10 М

Соотношение пептид 1,15 !0 М

ГЦ О 077 ° 10- М

Соотношение

Таблица 3

Титр взаимодействия (1од2) иммунных сывороток различного происхождения с соответствующими антигенами в реакции твердофаэного иммуноферментного анализа (ELISA) Антитела против

Антигены иммобилизованные на полистироловых платах

Гексапептид Гемагглютинин Вирус гриппа вируса гриппа

Гексапептид -тиЯ роглобулин

Гексапептид -re15 моцианин

ВНрус гриппа НЗИ2

Бычий сывороточный альбумин

Залииа4

Читр антител, индуцированных коньюгатом i!1Ä -тиреоглобулин, !

Антигеиы, иммобилизован!

11, l 2

2 з 4 ные на полнстирольных платах

1,45

0,03 0,0 о,;г

0,41 0,2 О, 1.

Гексапептид

Гена гглкл инин

1,39

1,3

1,О о,ьз

n,îç

0,23 О,1 0,05

0,54 0,27 И 09

0,01 0,0 о,5

0,92

1,52 1,5

0,Ь4

1,41

0,04 О,О 0,0

1,5

1,48

1,35

1,12

0,08 о,о

0,0 o,î

0,ог о,о о,о о,о о,о

o,о о,о

0i0

V показатели оптической плотности в лунках плат определяли на автоматическом спектрсфотометре при 405 нм. вирус гриппа

Н,Кq

Вирус гриппа

"1 3

Вирус свиной .az

11,1 (10, -11, 2)

4 (3,8-4,2)

10,3 (10,5-12,0) (6,2-7,5) 8,5 (8,0-9,0) 9,7 (8,6-10,5) 7,5 (7,0-8,0) 8,6 (8,0-9,0) 1518340

Таслица

Антигеиы, им мооипивов. на полнстнроле

1 2

1,5 1,49

О,!7 G,G

1,45 0,95 0,7 U,49 0,3

0,0 G,G 0,G

О, 15 0,07

00 00 00

0,05

0,0

0i0

0,35 0,04

0,32 0,07

0,4 0,12

log

О, 1 0,05

1,52 1,5

0,1 0,0

0,01 0,0 G,G

0,0 О, 0,0 О, 0,0 О, 0,33 0,04

0,25 0,05

0,22 0,02

Покаэаталн оптической плотности при 405 нм, ТГ н ГЦ - вводилн с ПАФ по той не схеме, что и конъогатм с П!.

Таблица 6

Конкурентная ингибиция (в Х) взаимодействия мышиных антител против гексапептида, индуцированных конъюгатом ГП, -тиреоглобулин, различными антигенами в реакции ELISA

Антиген, имиобилизованный на полнстироле

ГИ

ГП

Столбнячный анатоксин

95

10

Гексапептид

Составитель В.Волкова

Редактор Н.Киштулинец Техред Л.Сердюкова Корректор В.Кабаций

Заказ 6563/29 Тираж 338 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, iK-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент", r.ужгород, ул. Гагарина,101

ТГ

ГЦ

Гемагглютинин вирус гриппа

Вирус гриппа

ГП

ГЦ

ТГ

Гемагглвтиннн вирус гриппа

Вирус гриппа

ГП

Титр антител, индуцированных ТГ, log 9

) 1".. I

О, О, о, Титр

1,32 О, 0,0 О, О 0,0 0,0

0 0,0 0,0

О О,О 0,0 антител, нндуцированных ill, 80640502

Антигены, использованные для ингибирования (конечная концентрация 250 мкг/мл) Гемагглю- Вирус ТГ тинин вирус гриппа гриппа