Способ получения человеческого инсулина формулы i @ -т @ - он или его производных
Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта за счет избежания предварительного отщепления аминокислоты В-30 в свином инсулине. Способ предусматривает введение свиного инсулина в реакцию ферментативного замещения с водным раствором или дисперсией, содержащей амид треопина или сложный эфир треопина формулы H-TR-OR<SP POS="POST">3</SP>, где R<SP POS="POST">3</SP> является C<SB POS="POST">1</SB>-C<SB POS="POST">6</SB>-алкилом, при PH 7,0 - 9,5 при исходных концентрациях свиного инсулина и амида треопина или от 0,05 до 3 М соответственно. В качестве фермента используют сериновую карбоксипептидазу микробного происхождения специфическую для субстратов, имеющих C-концевую Z-аминокислоту. В результате образуется одно из производных инсулина. Для получения человеческого инсулина отщепляют одну из групп -NH<SB POS="POST">2</SB>, - THR-NH<SB POS="POST">2</SB> и OR<SP POS="POST">3</SP> путем взаимодествия той же самой или иной 4 - специфической карбоксипептидазы в водном растворе или дисперсии при PH от 9 до 10,5. Выход инсулина повышается до 75%. 3 табл. 3 ил.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ОПИСАНИЕ ЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 3414346/28-13 (86) РСТ/DK 81/00074 (23.07.81.) (22) 23.03.82 (31) 3197/80 (32) 24.07.80 (33) DK (46) 30.03.90. Бюл. В 12 (71) Карлсберг Биотекнолоджи, Лтд, А/C (DK) (72) Клаус Бреддам, Джек Таанинг
Ехансен (DK) и Фред Видмер (СН) (53) 663 ° 15 (088.8) (56) Видмер Ф., Йохансен И.Т. Энзиматический пептидный синтез: катализируемое карбоксипептидазой-У образование пептидных связей. — Carlsberg Res Commun. т.44, 1979, У 4, с. 37-46.
Морихара В. Способ полусинтеэа инсулина человека в результате каталиэируемой трипсином замены АЛА-В-30 на TPE свином инсулине. — Nature, т. 280, 1979, Ф 572 1, с. 4 12-413.
Морихара В. и др. Превращение свиного инсулина в инсулин человека, катализируемое Ахром-бактерпротеаэой-1. — Biochem. arid Bioph, Res.
Comm. т. 92, 1980, В 2, с. 396-402.
Изобретение относится к биотехнологии и касается получения человеческого инсулина или его производных.
Цель изобретения — повышение выВ хода целевого продукта за счет иэбе„SUÄÄ 1554766 A5 (Я)5 С 12 P 21 04 // А 61 К 37/26
2 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО
ИНСУЛИНА ФОРМУЛЫ Ins — Thr — ОН ИЛИ
ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ (57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения — повьппение выхода целевого продукта эа счет избежания предварительного отщепления аминокислоты В-30 в свином инсулине.
Способ предусматривает введение свиного инсулина в реакцию ферментативного замещения с водным раствором или дисперсией, содержащей амид треопина или сложный эфир треопина формулы Н-Тг-ОК, где R — С -Cs-алкил, при рН 7,0-9,5 при исходных концентрациях свиного инсулина и амида треопина или от 0 05 до 3 М соответственно. В качестве фермента используют сериновую карбоксипептидазу микробного происхождения, спе- С,. цифическую или субстратов, имеющих
С-концевую 1.-аминокислоту. В результате образуется одно из производных инсулина. Для получения человеческого инсулина отщепляют одну иэ групп — NH, - Ihr - NH<и ORq путем взаимо- ф действия той же самой или иной 4ь
4 — специфической карбоксипептидазы в водном растворе или дисперсии при рН от 9 до 10,5. Выход инсулина повьппается до 75Х. 3 табл.3 ил. жания предварительного отщепления
В-30 Ala.
Изобретение заключается в том, что осуществляют процесс ферментативного замещения В-30 аминокислоты в
1554766 свином инсулине формулы Ins — Ala — ОН с помощью сериновой карбоксипептидазы микробного происхождения, специфической для субстратов, имеющих
С-концевую L-аминокислоту, водном растворе или дисперсии, содержащей амид треопина или сложный эфир треопина формулы Н вЂ” Thr — OR>, где
R — С< -- С -алкил, и представляет собой, например, метильный, этильный, пропильный, иэопропильный, бутильный, изобутильный, трет-бутильный, амильный, гексильный и им подобные радикалы, в которых для получения человеческого инсулина в качестве целевого продукта отщепляют одну из групп производных инсулина -NH<, -Thr — NH и OR, используя ту же самую или иную L — специфическую сериновую карбоксипептидазу.
Указанные группы могут быть замещены заместителями, которые являются инертными по отношению к энэиму, например атомами галогена (фтора, хлора, брома, иода), нитрогруппой, алкоксильной группой (метоксильной, этоксильной и т.д.) или алкильной группой (метильной, этильной и т.д.).
Так, в случае типов сложных эфиров группа OR предпочтительно принадлежит к ряду, состоящему из алкоксильных групп, например метоксильной, этоксильной или трет-бутоксильной, фенилоксильной группы к бензилоксильной группы. Указанные группы могут быть замещены инертными раство. рителями, например нитрогруппами (n-нитробензилоксигруппа).
Первоначально свиной инсулин вводят в реакционный водный раствор или дисперсии, содержащей амид треопина или сложный эфир треопина укаэанной формулы, после чего добавляют энзим сериновой карбоксипептидазы.
Предпочтительным энзимом является
CPD-Y из пекарских дрожжей, но может также использоваться пенициллокарбоксипептидаза или сериновая карбоксипептидаза из Aspergillus sp., прорастающего ячменя или других источников, Предлагаемый способ осуществляют при значениях рН 7,0-10,5, предпочтительно 7,5-10,5. Предпочтительное значение рН, которое часто лежит в очень узком диапазоне значений, зависит от оптимального и минимального значений рН соответственно для раз5
55 личных видов энзиматической активности используемого энзима. Значение рН следует выбирать таким образом, чтобы активности были уравновешены, В том случае, когда в качестве энзима используют карбоксипептидаэу
У, предпочтительные значения рН
7,5-10,5, более предпочтительные
9,0-10 5. Наиболее предпочтительным является нижнее значение рН из укаэанного предпочтительного диапазона в тех случаях, когда требуется проводить выделение промежуточных инсулинамидов °
Выбранное предпочтительное значение рН следует поддерживать в ходе реакции сочетания, затем его можно изменить при осаждении продукта реакции, отщеплении защитных групп и т.д. Значение рН может быть выбрано таким образом, чтобы энзим проявлял амидаэную активность, в результате чего предотвращается осаждение образующегося инсулинамида и создается возможность для образования желаемого инсулина в одну стадию. Можно также выбрать значение рН, при котором энзим проявляет преимущественно пептидазную активность, в результате чего осуществляется режим, способствующий образованию стабильных промежуточных продуктов — инсулинамидов.
Контроль над рН осуществляют введением стабильного буферного раствора для соответствующего диапазона рН в реакционную среду (например для этой цели можно испольэовать бикарбонатный буфер).
Значение рН поддерживают добавлением кислоты, например соляной, или основания, например гидрата окиси натрия, в процессе реакции. Это может быть осуществлено с использованием рН-стата.
Реакцию проводят в водной среде, которая может содержать до 50 об.X органического растворителя, алканолы, например метанол и этанол, гликоли, например этиленгликоль или пропиленгликоль, диметилформамид, диметилсульфоксид, тетрагидрофуран, диоксан и диметоксиэтан.
Выбор состава реакционной среды зависит, в частности, от растворимости, температуры и значения рН для компонентов реакционной среды и
5 15 получающегося инсулина, а также от стабильности энзима.
Реакционная среда может также включать компоненты, которые делают энэим нерастворимым, но сохраняют при этом значительную долю его энзиматической активности, например ионообменные смолы.
В альтернативном варианте энзим может быть иммобилизован, например, в результате связывания в матрице, например в сшитом декстране или агароэе, или в двуокиси кремния, полиамиде или целлюлозе, или же путем капсулирования в полиакриламиде, альгинатах или волокнистых материалах. Кроме того, возможна модификация энэима химическими методами, предпочтительно солями ртути, с целью увеличения его стабильности или улучшения его энзиматических свойств.
В том случае, когда желательно подавить какое-либо осаждение промежуточно образующихся инсулиамидов, реакционная среда содержит мочевину или хлоргидрат гуацидина в концентрации до 3 моль/л, Это может быть также предпочтительным при рН в среде, в который используемый в качестве субстрата инсулин имеет ограниченную растворимость.
Предпочтительная исходная концентрация для используемого в качестве субстрата инсулина лежит в пределах
0,002-0,5 моль/л, а аминного компонента- в пределах 0,05-3 ммоль/л.
Энзиматическая активность может меняться сама по себе, но концентрация энзима предпочтительно должна
-6 -4 составлять величину 10 — 10 моль/л, наиболее предпочтительно — 10 моль/л
-5
Наиболее пригодное значение активности зависит от концентрации субстрата, от концентрации амина и времени проведения реакции.
Согласно изобретению температура, при которой проводится реакция, предпочтительно лежит в пределах 2040 С. Наиболее удобная температура в условиях данного синтеза может быть определена экспериментально, В частности, она зависит от используемого в качестве аминного компонента вещества и от концентрации энзима.
Пригодные температуры лежат обычно о, в пределах 20-30 С, предпочтительно
25 С. При температурах ниже 20 С время проведения реакции обычно слишком
54766 велико, а использование температур выше 40 С часто вызывает проблемы, о связанные со стабильностью энэимов и/или реагентов или продуктов реакции.
Аналогичные варианты возможны и для времени проведения реакции, которое очень сильно зависит от прочих параметров реакции, в особенности от концентрации энзима. Стандартное время проведения реакции согласно изобретению составляет примерно
2-6 ч.
При использовании в качестве аминного компонента амида или замещенного амина желательно специальное разложение амидной группы в получаемом инсулинамиде. В этом отношении карбоксипептидаэы, в особенности
20 карбоксипептидаэа Y являются весьма пригодными, пбскольку укаэанная карбоксипептидаза Y проявляет амидаэную активность при рН вьппе 9, в то время как ее карбоксипептидазная активность становится незначительной, Указанная карбоксипептидаза может быть вообще использована для разложения сложноэфирных групп
0R» в промежуточно образующихся сложных эфирах инсулина с получением готового инсулина, не содержащего С-конечной защищенной группы.
Исходные материалы.
Свиной инсулин был представлен лабораторией инсулина "Нордиск
Копенгаген, Карбоксипептидазу Y из пекарских дрожжей (промьппленного производства Карлсбергских пекарен)
40 выделяли модифицированным методом афинной хроматографии, получая в результате лиофилизированный порошок, содержащий 107 энзима в цитрате натрия. Перед употреблением энзим
45 подвергают обессоливанию на колонке
1,5 25 см с Сефадексом Г-25, применяя в качестве растворителя и элюента воду. Концентрацию энзима определяют спектрофотометрически, исполь Ф/ зуя E геон„(= 14,8. Используемый энзим не содерплт протеазу А.
L — Треонинамид поставляла фирма
"Вега-Фокс",Аризона, США, метиловый эфир L-треонина — фирма "Фулка", Швейцария, а L-треонин, дансилхлорид, карбоксипептидаэу А и трипсин — фирма "Сигма", США. Хроматографические материалы поставлялись фирмой
"Фармация", Швеция. Все прочие реа1554766 генты и растворители марки "Аналитически чистый" поставлялись фирмой
"Мерк", ФРГ.
Анализ аминокислот.
Образцы для анализа аминокислот получали в результате гидролиза 6 М
НС1 при 110 С в вакууме в течение
24 ч. Анализ проводился на анализаторе аминокислот "Дюррум Д-500" °
Состав аминокислот определяпся иэ расчета на известное количество аспарагиновой кислоты и глицина, Единственными аминокислотами, на которые оказывают влияние проводимые реакции, являются треонин, лизин и алании. Соответствующие значения для указанных аминокислот, содержащихся в свином инсулине (инсулине человека), составляют: треонин 1,93 (2,87), лизин 0,97 (0,98) и аланин 2,00 (1,05). Количество непревращенного свиного инсулина в реакционной смеси определялось анализом аланина в инсулине хроматографическим методом на Сефадексе Г-50. Выход реакции сочетания определялся как количество пойучаемого продукта, поделенное на все количество инсулина, израсходованного в ходе реакции, Приготовление карбоксипептидазы А (пример 2 и 3) .
К 100 мкл раствора инсулина или производных инсулина (0,7 мг/мл) в 0,1 М трис-НС1 (рН 7,5) добавляют
10 мкг карбоксипептидазы А, После выдерживания при комнатной температуре в течение 6 ч реакцию останавливают добавлением эквивалентного объ ема 0,5 M НС1, и количество освобожденных аминокислот определяют в результате проведения анализа аминокислот °
Знзиматическая обработка производных инсулина (пример 4).
Обработка различных производных инсулина карбоксипептидазами А и
Y проводилась в 0,05 М трнс-буфере (pH 7,5) при комнатной температуре с использованием инсулина в количестве, составляющем примерно
1,5 мМ, и карбоксипептидазы — 5 мкМ.
Время реакции 3 ч в случае карбоксипептидазы А и 1,5 часа в случае карбоксипептидазы Y. При указанных условиях достигалось наибольшее количество освобожденных С-конечных аминокислот. После подкисления НС1 аликвоты брались непосредственно
5 !
О !
40 ,45
55 для проведения анализа аминокислот на анализаторе.
Последовательность С-конечной части в различных производных инсулина определялась после обработки трипсином и реакции продукта этой обработки с дансилхлоридом с последующей идентификацией дансилпептидов. Обработка производных инсулина трипсином производилась в 0,1 M кислого карбоната натрия при рН 8,2 с использованием 1 мМ инсулина, 40 мкМ ДРСС-трипсина и при времени инкубирования 1 ч. Предварительные эксперименты со свиным инсулином показали, что эти условия пригодны для полного освобождения С-конечного аланильного остатка иэ
В-цепи, Освобождаемые аминокислоты или дипептиды подвергались дансилированию согласно следующему способу. Образец в 100 мкл продукта обработки трипсином гасят добавлением 100 мкл 0,5 М соляной кислоты, апиквоты разгоняют досуха и снова растворяют в 100 мкл 0 1 M кислого карбоната натрия (рН 8,2), после чего добавляют 10 мкл дансилхлори-! да (5 мг/мл) в ацетоне и инкубируют реакционную смесь в течение 2 ч при
37 С. Затем реакционную смесь анас лизируют методом жидкостной хроматографии под высоким давлением, используя систему для жидкостной хроматографии фирмы Уотерс", состоящую из инжектора (Иод.6К), двух насосов (Мод.6000А), программного устройства для раствора (Мод.660), детектора-УФ (Мод. 450), устройства для обработки данных "Уотерс ) и устройства радиального сжатия (" Уотерс", РСМ-100), оборудованного колонкой радиального наполнения
"Уотерс"-А (обратная фаза С- !8) .
Были синтезированы следующие стандартные соединения: Днс-Ала-ОН, Днс-тре-ОН, Днс-Ала-Тре-ОН, Днс-ТреТре-ОН, Днс-Тре-%Iq, Днс-Тре-Тре-NH и Днс-Ала-Тре-МН . Все 7 дансильных производных могут быть легко разделены методом жидкостной хроматографии под высоким давлением с использованием двух различных программ.
На фиг.1 изображено протекание реакции между свиным инсулином и L-треонинамидом с использованием в качестве катализатора карбоксипептидазы г (результаты анализа
1554766 аминокислот приведены в зависимости от времени проведения реакции), на фиг.2 — протекание аналогичной реакции, в которой в качестве аминного компонента используется метиловь и эфир 1.-треонина! на фиг.3 — профиль элюиронания для ионообменной хроматографии продукта реакции между свиным инсулином и треонинамидом.
П р и и е р 1. (исследования проводили согласно имеющемуся уровню техники).
Свиной инсулин инокулируют о, с карбоксипептидаэой Ъ при 25 С и рН 5-7 (в диапазоне рН, в котором указанный знзим проявляет максимальную пептидазнук активность), В результате обработки из С-конца
В-цепи освобождаются следующие аминокислоты: аланин 1,0, лизин 1,0; пролин 1,0, треонин 1,О тироэин 1,0 и фенилаланин 2,0. В положении В-23 (глицин) карбоксипептидаза У прекращает свое воздействие, следовательно, можно освободить первые 7 аминокислот в В-цели инсулина, Неожиданным является тот факт, что
С-конечный аспарагин (А-21) цепи А вообще не освобождается. При рН 9,5
С-конечный алании в цепи В освобождается значительно быстрее последующих аминокислот. Важ««ым является тот факт, что связь лейцин — тираэин (В-15-16) не подвергалась гидI ролизу вообще, когда использовалась очищенная карбоксипептидаза У, не содержащая протеазы А (эндопептидазы), в противоположность препаратам, поставляемым промышленностью из других источников, Пример 2, Превращение свиного инсулина в инсулин человека с использованием треонинамида в качестве аминного компонента без выделения промежуточного инсулинамида.
К 2 мИ раствору свиного инсулина, не содержащему цинк, в 10 мГ1 ЭДТА добавляют раствор 0,1 l1 КС1, содержащий 0,5 M L-треонинамида, а при о . рН 9,5 и температуре 25 С вводят
50 мк11 карбоксипептидаэы Y. рН реакционной смеси поддерживают на постоянном уровне в результате введения 0,5 M раствора гидрата окиси натрия, используя для этой цели рН-стат. От реакционной смеси в разное время отбирают аликвоты, а в конце реакцию останавливают в результате введения 6 И раствора соляной кислоты, в результате чего рН
5 доходит до 1-2. Образцы подвергают хроматографированию на колонне
1с30 см, наполненной Сефадексом Г-50 с использованием в качестве растворителя 1 М уксусной кислоты для отделения инсулина от энзима и свободных аминокислот. Фракции, содержащие инсулин, лиофилизируют и определяют состав аминокислот соглас«!о описанному способу, Протекание реакции показано на фиг.1. Из анализа аминокислот рассчитано, что содержание треонина увеличивается до 0,7 моль на моль инсулина, в то время как 0,8 моль аланина и 0,2 моль лизина исчезают (фиг,1). Эти результаты подтверждают тот факт, что спустя 6,5 ч проведения реакции 20Х свиного инсулина остается в непрореагировавшем
25 состоянии, в то время как 207 инсулина наряду с аланином теряет также аминокислоту лизин, Потери
0,8 моль аланина сопровождаются введением 0,7 моль треонина.
Продукты реакции подвергают дальне«йшему анализу при обработке карбоксипептидазой А, которая освобождает только аминокислоты, содержащие свободн !e L-карбоксильные груп35 пы, и не освобождает лизин. В результате обработки карбоксипептидазой А свиного инсулина освобождаются только аланин и аспарагин из
С-концов цепей В и А соответственно.
40 В результате инкубирования образцов инсулина, полученных после проведения реакции в течение 6,5 ч (фиг.1), следует ожидать освобождения наряду с аспарагином erne только аналина в количестве, соответствующем доле непрореагировавшегося свиного инсулина. Однако неожиданно помимо аланина освобождается также треонин в количествах, эквивалентных количеству треонинамида, вошедшего с обра50 эованием промежуточного инсулинамида человека. Это должно быть обусловлено тем, что в дополнение к пептидаэной и экстераэной активности карбоксипептидаза Y обладает также гидролаэной активностью по отношению к пептидамидам. Очевидно в процессе реакции свиного инсулина в присутствии карбоксипептидазы Y С-конечный ала1554766
35 нин первоначально обменивается с треонинамидом в реакции транспептидирования с образованием инсулинамида человека который затем гидролиэуетЭ
5 ся карбоксипептидаэой Y с получением инсулина человека с общим выходом около 60Х.,а 20Х непрореагировавшего свиного инсулина и 20Х других продуктов составляют остальное. Другие опы- 10 ты подтверждают указанную последовательность реакций. Используя меньшие количества энзима или более короткое время реакции, после обработки карбоксипептидаэой А продуктов реакции можно наблюдать, что количество освободившегося треонина меньше количества вошедшего треонина, т.е. в основном образуется инсулинамид человека.
Для отделения продуктов реакции образец, полученный после проведения реакции в течение 6 5 ч (фиг.1), подвергают жидкостной хроматографии с использованием колонки с обратной фазой "Ликросорб PP-18" (5 мкм, 25
О, 4 «30 см), насоса "Уотерс" (мод.
6000А) и детектора (Мод. 750-УФ), функционирующего при 220 нм. В качестве элюента используют смесь, содержащую 28,75X CHNC и 5 мМ тартратного буфера (рН 3), содержащего
5 мМ н-бут SO Na и 50 мМ сульфата натрия, Скорость потока 1,0 мл/мин.
С использованием этой системы нельзя разделить инсулин человека и свиной инсулин, однако все остальные побочные продукты удаляются. Результаты анализа аминокислот материала, полученного после хроматографирования, приведены в табл.1. Результаты анали40 за хорошо согласуются с теоретическими предпосыпками. Наличие 2,6 моль треонина и 1,3 моль аланина предполагает наличие в образце примерно
70Х инсулина человека и 30Х свиного инсулина.
Пример 3. Превращение свиного инсулина в инсулин человека с использованием в качестве аминного компонента метилового эфира треонина беэ выделения промежуточных продуктов.
К раствору не содержащего цинк свиного инсулина (8 мМ) в 10 мл ЭДТА.
0 ° 1 М КС1, содержащему 0,5 М метилового эфира L-треонина, при рН 9,5 55 и при 25 С, добавляют 60 мкМ карбоксипептидазы Y. Значения рН в ходе реакции поддерживают в результате введения 0,5 M раствора гидрата окиси натрия с использованием рН-стата °
В различное время отбирают аликвоты реакционной смеси, а саму реакцию останавливают в результате введения
6 M раствора соляной кислоты, в результате чего рН становится равным
1-2. Затем образец хроматографируют на колонке 1а30 см, заполненной
Сефадексом Г-50, с использованием в качестве растворителя 1 М раствор уксусной кислоты для отделения инсулина от инзима и свободных аминокислот. Фракции, содержащие инсулин, лиофилиэируют и определяют состав аминокислот согласно описанному способу.
Ход реакции показан на фиг.2.
Результаты, полученные при проведении этой реакции, аналогичны описанным при использовании треонинамида: треонин вводится одновременно с освобождением аланина и небольшого количества лизина. В результате обработки карбоксипептидазой А образца, полученного после проведения реакции в течение 17 ч, освобождаются как аланин, так и треонин, что приводит к предположению, что С-конечный алания цепи В первоначально обменивается с метиловым эфиром треонина с образованием монометилового эфира инсулина человека, который затем гидролизуется карбоксипептидазой У с получением инсулина человека. Хотя количественные соотношения в реакции те же, что и в реакции с участием треонинамида, конечная реакционная смесь содержит только 40Х инсулина человека, 40Х свиного инсулина, не подвергшегося превращению, и 20Х других продуктов гидролиза.
II p и м е р 4. Превращение свиного инсулина в инсулин человека с использованием в качестве аминного компонента треонинамина и с изоляцией промежуточных инсулинамидов.
К раствору не содержащего цинк свиного инсулина (2 мМ) в 2 мМ ЭДТА, 0,1 M КС1 и 1,5 M хлоргидрата гуанидина, содержащего 0,5 М треонинамида (L-тре-NH<) при рН 7,5 и температуре
25 С добавляют карбоксипептидазу У (15 мкМ). Значение рН в ходе реакции поддерживают в результате добавления
0,5 M гидрата окиси натрия с использованием рН-стата. В ходе реакции отбирают аликвоты реакционной смеси в
1 55>4 746
14 зируют их.
11рофиль элюирования изображен на фиг ° 3, ня котором няблн>дян>тся три пика. Кроме того, определяются составы аминокислот и состав веществ пиков в результате обраб<тки карбоксипептидазами Y II h c<>rJ В-цепи инсулина, в качестве модели свиного инсулина исэ<ользуетсн последовательность -IIPO-НИЗ-Л. IА-ОН. Аналогичным образом сокращения для других производных инсулина будут представлять собой: -III>0-;IÈÇ-ТРЕ-ОН для инсулина человека, -IIPO-НИЗ-ТРЕ50 -NH — для инсулинамида человека и т.д. При рН 7,5, используемом в ходе реакции, при котс>ром амндязная активность карбоксипептидязы У обычно ниже ее пептидазной активности, образующейся пептидамид в значительной мере стабилен, поскольку пик I соответствует примерно 20ь всего коли40 45 рязн<н время, я саму реякцинэ останяг< 1>!гэян>т II p< эу JI I тяте Гаше<<ия спустя 2 ч донедг ><ис и pll до 1,0-2,0 добавле— и><ем 1 Г! рястноря соляной кислоты. Фракцин, сод«ржящу н> инсулин, отделяют от знзимя и низком«le> l0 зованием в кя Ic c7»e p7r7 l>op« I eJI>< 1 раствора уксусной кисл< ты, и лнгфили31<руют г e, Ilроведг-.Ill Для даг<ьнг >««< I o анализа реагel тоз, содержаэцихся в ннсулиноной г<р< бс пронодят хроматог.р<эф«р<>вание ня ионообменном ССАядексе- К -ДЕЛЕ Л-25 согласно способу, описанному Г!орихг<ра и др. Образец гээ<офилэ<зг<ровя>э><ого инсулина (75 мг) растворяют к 0,01 Г! ТРИС, 2,5 Гl моченине 0 05 I NaC1 25 при pll 7,5 и хроматографируют Ila колонке, заполненной (;ефадексом К -ДЕЛЕ Л-25 (2,5х25 см) с использованием в качестве ряст><ор <теля того же самого буферног <> ряс I II<>p;I. 1!нсулин OJII<>Hp>> ют ряс тно!эами хлоpHcTol натрия с градиентом кон>(ентряций от 0,05 до 0,30 Г! ээ том же буфере, собиран>т фракции по S мл на колонке, заполненной Се<>>ядексом 1 -25 и лнофиличества инсулиновой пробы. В процессе реакции превращается примерно 75Х исходного свиного инсулина. Однако хотя содержание треонина в пике I (3,(>5) больше 3,0 (соответствует инсулину человека), очевидно, что первонячальнь<й продукт транспептидирова>эия (-ПРО-JIIH3 ТРЕ-Г!Н-, ) не является достаточно стябильньэм для того, чтобы не происходила олигомеризация с образованием -ПРО- IИЗ-ТРЕ-NII, На иергэый< взгляд образование смеси пр<межуточных амидов говорит о тг>ч, что в результате описанной стадии дезямидир< вяния посредством карбокснпептидязы г не образуется «Iera, поскольку в рс ультяте дезямидирования очевидно следуе7 ожидять получение смеси -1П О-.!1113-ТРЕ-() II и -ПРО-.1П1Х-ТРЕ-TPE-ОН Однако прн обработке вещества пика I с целью дезямидирования 10 мкГ1 кярбоксипептэгдя.<ы У при рН 10,0 н 0,1 Г! НС1, 2 мГ! 371ТА в течение 20 мин получают неожиданно практически чистый инсулин человека ° Этот опыт протекал следующим образом. После отделения прореагировавшего инсулина от знзима I низкомолекулярных продуктов хроматографированием ня Сефядексе Г-50 полученнь<й продукт хроматографируют на ДЕАЕ-Сефадексе Л-25 с использованием способа, аналогичного описанному на фиг.3. Продукт реакции элюируется в пике II («то ожидалось), тогда как непрореагировавший продукт (менее 107) элюируется н пике 1. Пик III вообще отсутствует, т.е. производные инсулина, не содержа<цие:<изин не образуются в ходе реакции. Как следует из результатов, приведенных в табл.2, полученных при обработке карбоксипептидазами А и У и трипсином, укаэанная реакция влияет только на содержание треонина в сколько-нибудь значительной степени, что находится в соответствии с ожидаемь<м отсутствием пептидазной активности карбоксипептидаэы У при данном значении рН ° Состав аминокислот для пика II полученного при реакции дезамидирования, близок к составу инсулина человека: TPE 2,87 ЛЛА 1,05, ЛИЗ 0,98. Обработка продукта деэамидирования кярбоксипептидазами Y и А трипсином показывает, что образец содержнт 90-95Х чистого инсулина человека.Это! 6 ! 1554 766 40 утверждение сделано в предположении, что производное инсулина -IIPO-ЛИЗ-ТРЕ-TPE-NH реагирует практически только при наличии гидролаэной активности и пептидиламида аминокислоты, а -ПРО-ЛИЗ-ТРЕ-NH реагирует главным образом при наличии амидазной активности. Общий выход для превращения свиного инсулина в инсулин человека составляет примерно 30% из расчета на превращенный инсулин, Пример 5. К раствору свиного Zn-инсулина (7 мг/мп) в О,! М растворе треонинамида при рН 6,9 добавля-!5 ют карбоксипептидазу P из Penicillum jauthene11um (СРД-P) до тех пор, пока концентрация не станет равной 0,42 мг/мп. После этого реакция идет в течение 2,5 ч при 25 С. 50% свиного инсулина превращается в человеческий инсулин, что определяется при помощи тонкослойной хроматографии. Пример ы 6 — 14. Получение человеческого инсулина с помощью модифи- 25 цированной СРД-Y. Методы. Аминокислотный анализ. Образцы для аминокислотного анализа гидролизуют в 5,7 M НС1 при 30 110 С в вакууме в течение 24 ч и анализируют на аминокислотном анализаторе "Дуррум-Д-500". Анализ высокоэффективной жидкостной хроматографией. Превращение свиного инсулина в амид человеческого инсулина может быть прослежено с помощью жидкостной хроматографии при высоком давлении (HPLC) на обратимой фазе ° Используют радиально заполненную С колонку от Вотерс Асс,, элюирование достигается с помощью 0,1 М раствора сульфата аммония, содержащего 30% ацетонитрила. Образцы (30 мкл) 45 из реакционной смеси разбавляют 1 М уксусной кислоты перед инжектированием в "Дюррум Д-500". Диск-ПЭГ электрофорез. Превращение свиного инсулина в 50 амид человеческого инсулина также может быть прослежено с помощью Диск-ПЭГ электрофореэа на 12,57.-ном полиакриламидном геле в буфере, состоящем иэ 0,005 М Трис — 0,04 М глицина при рН 8,3. Амид человеческого инсулина мигрирует медленнее свиного инсулина, соответствуя потере одного отрицательного заряда. С-Концевой анализ. СР 1-v гидролиз используют для опрея лоция С-концевой последовательности В-цапни инсупина. 500 мкг инсулина в 0,05 M FS буфере при рН 6,75 переваривают 30 мкг СРД-У при 37 С в течение 1 ч. Высвободившиеся аминокислоты определяют u
ДЕЛЕ-Сефарозе. Амид человеческого инсулина отделяют от непрореагировавшего свиного инсулина ионообменной хроматографией на ДЕЛЕ-Сефароэе. Лиофилизированный образец инсулина растворяют в 0,01 М Трис — 0,05 М NaC1 — 2,5 M мочевине при рН 7,5 и наносят на колонку, уравновешенную тем же самым буфером. Инсулины элюируют с градиентом NaC1 от 0,05 до 0,30 М в том же самом буфере. Получение модифицированной карбоксипептидазы У (СРД-УМ). К 1 мл водного раствора СРД-У (9,9 мг/мл, 150 мкмоль) прибавляют 100 мкл 0,5 М НЕРЕ S (рН 7,5) и последовательно 25 мкл водного раствора 10 N HgC1, . Смесь оставляют при комнатной температуре на 10 мин, после чего она готова для использования. Обычно используют стехиометрические количества фермента и ртути, но избыток ртути может быть легко удален гель-фильтрацией или диалиэом, Может быть приготовлена СРД-У, модифицированная метил-НВ или этил-Нв, по аналогичной методике с использованием метил-НрС1 или этил-HgC1 соответственно ° Тест на возможное высвобождение ртути иэ СРД-УМ. Поскольку специфическая экстеразная активность нативной СРД-У по отношению к субстрату В L — Lys — ОМе практически равна нулю, тогда как СРД-УМ имеет очень высокую активность, это различие может быть использовано для определения возможного высвобождения ртути, которое будет приводить к снижению экстеразной активности, Однако ни добавление 10 мМ ЕДТА, ни гель-фильтрация не приводят даже к малейшему снижению активности, показывая, что нет высвобождения ртути. Результаты. Пример Ь. Растворяют 80 мг свободного от цинка инсулина в 6,5 мл 17 18 1554766 Пример 9. Растворяют 100 мг свиного Zn-инсулина в 6,7 . л 1,0 М Thr-NH<, 1 М мочевины, рН 7,75 (pH устанавливают НВг). Добавляют 2,7 мг СРД-YM. Реакцию проводят при ° о 32 С, затем проводят HPLC. После 2 ч 10 мин 73Х свиного инсулина пое55 1, 1 М Thr — NH 0,05 M HEPE S, 1,0 КС1 при рН 7,0 и прибавляют 12,7 мг СРД-УМ в 2,5 0,05 М НЕРЕ Я при рН 7,0. Реакцию ведут при 20 С, затем проводят H L С и гель-электрофорез. Н L С показывает превращение 78Х после 21 ч реакции. Гель-электрофорез показывает подобную глубину конверсии. После 2 1 ч реакции устанавливают рН 2 с помощью 1 M НС1 и обессоливают образец на Сефадексе R -G50 в 1 М уксусной кислоте, а затем лиофилиэируют. Хроматография на ДЕАЕ-Сефарозе показывает профиль элюции с ,двумя пиками. Гель-электрофорез показывает, что два пика являются очевидно чистыми ° Пик I содержит 41,5 мг амида человеческого инсулина. Аминокислотный анализ пика I (табл,3) показывает, что аланин обменивается на треонин. Пик II содержит 40 непрореагировавшего свиного инсулина, который может быть рециклизован, Пример 7. Растворяют 70 мг кристаллизованного цитрата сырого инсулина в 2 мл 1,5 М Thr — NH<, 0,05 M HFРЕ Б, 1,0 М НС1 при рН 7,0. Реакцию проводят при 20ОС в присут- 30 ствии 15 мкМ СРД-УМ. После 72 ч реакции HPLC показывает конверсию 77Х, Гель-электрофореэ показывает подобную глубину конверсии, Реакционную смесь анализируют, как описано в примере А. Хроматография на ДЕАЕ-Сефароэе показывает профиль элюции с двумя пиками в соотношении 2:1 для амида человеческого инсулина и свиного инсулина соответственно. AMHHoKHcJloTHblA n 40 пика I показан в табл.З. Г1ик II содержит 407. непрореагировавшего свиного инсулина. Пример 8. Растворяют 100 мг свиного Zn-инсулина в 6,7 мл 1,0 М Thr — NH<, 1М мочевины прн рН 7,5 (рН устанавливают HBr). Прибавляют 2,3 г СРД-УМ. Реакцио проводят при 32 С, затем проводят HPLC. После 2 ч 10 мин 75/ свиного инсулина превращается в амид человеческого инсулина. 50 вращается в амид человеческого инсулина. Пример 10. Растворяют 100 мг свиного Zn-инсулина в 6,7 мл 1,0 М Thr-NH, 1 M мочевины, рН 8,0 (рН устанавливают HBr). Прибавляют 3,6 мг СРД-YM. Проводят реакцию при 32 С, затем проводят HPZC. После 1 ч 40 мин 757 свиного инсулина превращается в амид человеческого инсулина, Пример 11. Растворяют 100 мг свиного Zn-инсулина в 6,7 мп 1,0 И ТЬг — NH, 1 М мочевины, рН 8,25 (pH устанавливают HBr). Прибавляют 3,6 мг СРД-УМ. Реакцию проводят при о, 32 С, а затем проводят HPLC. После 1 ч 20 мин 68Х свиного инсулина.превращается в амид человеческого инсулина. П р и и е р 12. Растворяют 100 мл свиного Zn-инсулина в 6,7 мл 1,0 M Thr — NII<, 10 МКУ, 1 М мочевины, рН 8,0 (pH устанавливают HN0 ). Прибавляют 3,6 мг СРД-УМ. о Реакцию проводят при 32 С, затем проводят HPLC. После 2 ч 5 мин 73Х свиного инсулина превращается в амид человеческого инсулина. Пример 13. Повторяют проце-, дуру примера С, но используют 3 мг СРД-УМ, иммобилиэованного на силикагеле. После 2 ч получают 75Х конверсии. HPLC, Диск-ПЭГ и аминокислотный анализ продуктов, полученных в примерах, показывает, что они действительно являются амидом человеческого инсулина. Последующее деамидирование человеческого инсулина может быть проведено по примеру 4. Пример 14. Деамидирование амида человеческого инсулина на немодифицированной СРД-У и модифицированной СРД-У. А. Немодифицированная СРД-У. К раствору 15 мг/мп человеческого инсулина в 1 мМ ЕДТА при рН 8,0 и температуре 25 С прибавляют СРД-У до конечной концентрации 7,2 мкМ. После 22 мин реакции 74Х амида превращается, как определено HPLC. После разделения на ДЕАЕ-Сефарозе HPLC анализ и аминокислотный анализ показывают, что человеческий инсулин является чистым. 1554766 В. СРД-У, модифицированная метил-Hg. Аналогично примеру Л, но с 4,9 мкИ метил-Hp-СРД-У, рН 8,0. После 39 мин реакции 61/ амида инсулина превращается в человеческий инсулин. С, СРД-У, модифицированная этил-НР. Аналогично примеру Л, но с 7,2 мкМ этил-Hg-СРД-У, рН 8,0. После 36 мин реакции 74Х. конверсии наблюдается по данным HPLC. Д. СРД-У, модифицированная метил-Hg, Аналогично примеру А, но с 19 мкМ метил-Hp-СРД-У, рН 7,5. После 2 ч реакции по данным НР?.С наблюдается 907 конверсии. формула изобретения 1. Способ получения человеческого инсулина формулы Ins — Thr — OH или его производных, имеющих формулы Ins — Thr — NH, I.ns — Thr — NH или Ins — Thr — ОК, где Ins — DeS — Thr (30) человеческого инсулина, R — С -С -алкил 3 (б 1 путем ферментативного замещения В-30 аминокислоты в свином инсулине формулы Ins — Ala — ОН с помощью карбоксипептидазы при оптимальной температуре процесса с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта за счет избежания предварительного отщепления В-30 А1а, свиной инсулин вводят в реакцию с водным раствором или дисперсией, содержащей амид треонина или сложный эфир треонина общей формулы и — тЛг — ОК где R имеет указанные значения, при рН 7-9,5, причем исходные концентрации свиного инсулина и амида треонина или его сложного эфира устанавливают от 0,002 до 0,5 M u от 0,05 до 3 М соответственно, в качестве карбоксипептидазы используют сериновую карбоксипептидаэу микробного происхождения, специфическую для субстратов, имеющих С-концевую 1.-аминокислоту с образованием при этом одного из производных инсулина формул Ins — Thr — NH 21 Ins 1ЬГ П1Г Nil@ èëè Ins — Thr — OR> ь которых для получения человеческого инсулина в качестве целевого продукта отщепляют одну из групп -НН -Thr- H и -OR путем взаимодействия той же самой или иной L-специфичной сериновой карбоксипептидазы в водном растворе или дисперсии при 25 рН 9 — 10,5. 2. Способ по и.1, о т л и ч а юшийся тем, что используют немодифицированную или модифицированную карбоксипептидаэу Y из пекарских дробей или карбоксипептидазу Р из Penicillum jouthenellum. Э. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что используют карбоксипептидазу У, модифицированную солями ртути или иммобилизованную. 4. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что до 50% органического растворителя используют этанол или метанол, или этиленгликоль, или пропиленгликоль, или диметилформамид, или диметилсульфоксид, или тетрагидрофуран, или диоксан, или диметоксиэтан. 5. Способ по и.1, о т л и ч а ю45 щ и A c s тем, что испо."1ьзуют вод ный раствор или дисперсию, содержащую мочевину, или гидрохлорид гуанидина в концентрации до Э М. ! 21 1554766 Таблица 1 Аминокислотный состав инсулина Аминокислота Количестап молей аминокислоты на Инсулин сви- челоной века моль инсулина Аспарагиновая кислота Треонин Серин Глютамино3i 1 2,6 3,1 вая кислота Пролин Глицин Аланин Валин Изолейцин Лейцин Тирозин Фенилаланин Гистидин Лизин Аргинин * Низкие значения ввиду нег олного гидролиза. Таблица 2 Аминокислотный состав пиков I II, III на фиг ° 3 и пика II полученного после дезамидирования фракции соответствующей пику 11ик I Пик II Пик III Пик II, полученный после деэамидирования пика I Аминокислота Аспарагиновая кислота Треонин Серии Глютаминовая 3,01 2,79 2,93 3,01 2,50 2,92 2,99 2,52 2,92 2,99 3,62 2,93 7,01 0,87 4,00 1,09 1,19 2,50 6,10 4,02 2,64 1,89 1,01 0,89 кислота Пролин Глицин Алании Изолейцин Валин Лейцин Тирозин Фенилаланин Гистидин Лизин Аргинин 6,88 1,00 4,00 1,16 0,94 2,42 5,80 3,80 2,74 1,96 0,99 0,96 7,16 0,98 4,00 1,52 1,04 2,82 6,21 3,86 2,82 1,90 0,74 1,00 7," 1,2 4,0 1, 1 3,5* 1,4* 6,1 3,6 3,0 1,9 1,0 1,0 7,17 0,71 4,00 1,03 1,09 2,81 6,18 3,67 2,65 1,93 1,06 0,98 1 2 2 4 2 7 I 1 2 4 2 23 1554 766 Таблица 3 Аминокислотный анализ инсулина Пример 6 Пример 7 Аминокислота Свободный от Zn инсулин Нитрат человеческого инсулина Свиной Амид ченсулин ловеческого инсулина мид человечесого инсулина Аспарагиновая кислота Треонин Серии Глютаминовая 3,04 3,17 2,93 2,96 3,25 2,71 3,00 1,94 2,89 g кислота Пролин Глицин Алании Валин Изолейцин Лейцин Тирозин Фенилаланин Гистадин Лизин Аргинин 7,05 1,17 4,00 2,05 3,42 1,45 6,02 3,76 3,00 1,95 0,99 0,99 7,03 0,77 3,94 1917 3,26 1,43 6,23 3,72 2,85 2,02 1,00 0,98 6,90 1,10 4,05 1,09 3,59 1,48 6,24 3,7" 2,97 2,00 1,00 1,01 1554766 d,1 Составитель И. Привалова Техред Л.Сердюкова Корректор M. Максимишинед Редактор M. Петрова Заказ 467 Тираж 486 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открьггиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101
