Способ получения метилового эфира @ -l-аспартил-l- фенилаланина или его гидрохлорида

 

Изобретение относится к химии пептидов, в частности к получению метилового эфира α-L-аспартил-L-фенилаланина или его гидрохлорида, используемого в качестве диетического подслащивающего средства. Цель - упрощение процесса и повышение содержания α-изомера в целевом продукте. Получение ведут конденсацией ангидрида N-формиласпарагиновой кислоты и L-фенилаланина при PH 8 - 12 в присутствии или в отсутствии метанола 4 - 6 моль на 1 моль L-фенилаланина в водной среде. Воду берут в 3 - 10-кратном количестве по отношению к L-фенилаланину. Процесс ведут с последующими деформилированием и этерификацией образовавшегося N-формил-α-L-аспартил-L-фенилаланина обработкой хлористоводородной кислотой (15 - 25 мас.%) в присутствии метанола - 4 - 6 моль на 1 моль L-фенилаланина. Полученный метиловый эфир α-L-аспартил-L-фенилаланина гидрохлорид выпадает в осадок, его отделяют и при необходимости нейтрализуют.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК.Я0„„ 556542 (51)5 С 0 К 06

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4027212/23-04 (22) 25.03.86 (31) 59557/1985; 66095/1985 (32) 26.03.85 (33) 1Р (46) 07.04.90. Бюл. 13 (71) Мицуи Тоацу Кемикалз Инкорпорейтед (ЛР) (72) Рюити Мита, Тосио Катох, Тодзиро

Хигути, Такеси Оура, Акихиро Ямагути (я) (53) 547. 466. 07 (088. 8) (56) Акцептованная заявка Японии 26133/1980, сер. 3(2)-31/31, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕТИЛОВОГО ЗфИРА а-1.-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА ИЛИ

ЕГО ГИДРОХЛОРИДА (57) Изобретение относится к химии пептидов, в частности к получению метилового эфира e(-L-аспартил-L-фенилаланина или его гидрохлорида, испольИзобретение относится к усовершенствованному способу получения метилового эфира Ы-Ь-аспартил-L-фенилаланина (М-АРМ, аспартам) или его гидрохлорида, используемого в качестве диетического подслащивающего средства.

Целью изобретения является упрощение процесса и повышение содержания

М"изомера в целевом продукте.

Пример 1. В 66 г воды растворяют 5,0 г твердого гидрата окиси натрия, затем 19,8 г (О, 12 моль) L-фенилаланина и полученный раствор охлаждают до 0 С. К раствору постепенно добавляют 18,8 г (0,13 моль) ан"

2 зуемого в качестве диетического подслащивающего средства. Цель - упрощение процесса и повышение содержания

А-изомера в целевом продукте. Получение ведут конденсацией ангидрида Nформиласпарагиновой кислоты и L-фенил аланина при рН 8-12 в присутствии или в отсутствии метанола 4-6 моль на моль Ь вЂ” фенилаланина в водной среде.

Воду берут в 3-10-кратном количестве по отношению к L-фенилаланину. Процесс ведут с последующими деформилированием и этерифика цией образовавшегося N-формил- -L-аспартил-L-фенилаланина обработкой хлористоводородной кислотой (15-25 мас.g) в присутствии метанола — 4-6 моль на 1 моль

L-фенилаланина. Полученный метиловый эфир Ю -L-аспартил-L-фенилаланина гидрохлорид выпадает в осадок, его отделяют и при необходимости нейтрализуют. гидрида N-формил-L-аспарагиновой кис лоты при 0-5 С в течение 30 мин. Во время добавления к реакционной жид" кости прибавляют каплями 4Я-ный водный раствор гидроокиси натрия с таким расчетом, чтобы выдерживать при рН

9-11. Далее проводят реакцию при этой температуре 1 ч.

Часть реакционной жидкости анализируют методом высокоскоростной жидкостной хроматографии. Результатом служит отношение образования N-фор= мил-М-L-аспартил-1.-фенилаланина к

N-формил Р-Ь-аспартил-N-фенилаланину

75,4:24,6, причем общий выход двух з 155654 соединений составляет 96,81, считая на L-фенилаланин.

К реакционной смеси добавляют

14,4 г метанола и после этого вводят

26,8 г хлористого водорода при тем5 пературе ниже 55 >С °

Получаемую реакционную смесь подвергают реакции при 50-55 С 1 ч. Далее реакционную смесь охлаждают до

25 >С и подвергают дальнейшей реакции при 20-25 С 4 дня.

Вслед за этим реакционную смесь охлаждают ниже 5 С и перемешивают при

0-5 С 3 ч, < -APM-гидрохлорид, осажденный при этих условиях, отфильтровывают и промывают холодной водой, что дает отжатую на фильтре плотную влажную массу белого М -АРМ"гидрохлорида. Влажную массу анализируют вь>сокоскоростной жидкостной хроматографией. Результат анализа: содержание АРМ 19,3 r при выходе 54,7б, считая на исходный 1.-фенилаланин.

Пример 2. Отжатый на фильтре плотный влажный Ф-АРМ-гидрохлорид, полученный по примеру 1, суспендируют в

200 мл воды"и нейтрализуют при 20-25 С

204-ным водным раствором карбоната натрия (рН 5,0). Полученную суспензию охлаждают до 5 С и перемешивают при той же самой температуре 1 ч, ВыпавШие при этом в осадок кристаллы отфильтровывают, промывают холодной водой и высушивают в вакууме, что дает

17,4 г свободного ы=APM. Его анализ„ проведенный высокоскоростной жидкостной хроматографией, показал отсутствие загрязнений в >--АРМ. Удельное вращение 4 -АРМ было следующим jd)

Х>

16,07 (с = 4, 15 н. муравьиная кислота).

Пример 3. В 100., г воды растворяют 7,0 г хлопьевидной гидроокиси калия, затем 19,8 г (0,12 моль) L ôåíèëаланина и полученный раствор охлаждают до О С. К полученному водному раствору при 0-5 С постепенно добавляют

18,9 r (0,13 моль) ангидрида N-формил-аспарагиновой кислоты в течение

30 мин. Во время добавления 16,0

501"ного водного раствора гидроокиси калия одновременно прибавляют каплями к реакционной жидкости, поддерживая при рН 8-11. Затем р акционную жидкость перемешивают 1 ч при той же температуре.

Часть реакционной жидкости анализируют высокоскоростной жидкостной хроматографией. Результат показал, что от ношение обра зова ния N-формил-Ы-L-аспартил-L-фенилаланина к N-формил-Р-I. — àñïàðòèë-L-фенилаланину составляет 77:23, в то время как общий выход двух соединений составляет 98,9;;.

К реакционной смеси добавляют

19,2 г метанола, затем вводят 40,2 г хлористого водорода при температуре ниже 55 С. Полученную реакционную смесь затем подвергают реакции при

50-55 С 30 мин .Далее реакционную смесь охлаждают до комнатной темпера" туры и дополнительно подвергают реакции при комнатной температуре 5 дней. (1осле реакции реакционную смесь охлаждают ниже 5 C и перемешивают при

0-5 >C g ч. с .-АРМ-гидрохлорид выпавший при этих условиях в осадок отфильтровывают и промывают холодной водой для получения белого с -APM-гидрохлорида. Его анализ высокоскоростной жид" костной хроматографией показал содержание 17,4 r <-АРМ при выходе 49,3>;, считая на исходный L-фенилаланин.

Пример 4. В 66 r воды растворяют 5,0 г гидроокиси натрия, затем

19,8 r (0,12 моль) L-фенилаланина и полученный водный раствор охлаждают до минус 5 >С. Далее к водному раствору добавляют 18,8 г (0,13 моль) ангид рида N-формил-L-аспарагиновой кислоты при температуре ниже 10 С примерно за 1 ч.

В это же время к реакционной жидкости прибавляют каплями 19,0 г 30:;— ного водного раствора гидроокиси натрия, выдерживая рН среды 8-11. Затем реакцию проводят 1 ч при той же тем" пературе.

Часть реакционной жидкости анализируют высокоскоростной жидкостной хроматографией. Результат показал, что отношение образования N-формил- (-Ь-аспартил-L-фенилаланина к N-формил-(-L"àñïàðòèë-фенилаланину составило 76,1:24,9 при общем выходе соединений 97,4/, считая на исходный

L-фенилаланин.

К реакционной смеси добавляют

8,3 r метанола и после этого вводят

35,9 г хлористого водорода при температуре менее 55 С. Полученную реакционную смесь подвергают реакции при

50-55 С 1 ч и охлаждают до 30 >С. Реакцию продолжают далее 7 дней при той же температуре.

5 15565

После реакции реакционную смесь обрабатывают таким же образом, как описано в примере 1, что дает 4-АРМ-гидрохлорид, содержащий 20,5 г Ы-АРМ, с выходом 58,1l, считая на исходный - 5 фенилаланин.

Пример 5. В 66 r воды растворяют 14,4 г метанола; 5,1 г твердой гидроокиси натрия и еще 19,8 г (0,12 моль) — фенилаланина, затем полученный раствор охлаждают до 0 С. К раствору постепенно добавляют 19,8 г (0,13 моль) ангидрида N-формил-L-аспарагиновой кислоты при 0-5 С за 30 мин.15

К реакционной жидкости прибавляют каплями 45 g ный водный раствор гидроокиси натрия так, чтобы рН был в пределах 9-12. Далее реакцию проводят 1 ч при той же температуре. 20

Часть реакционной жидкости анализируют высокоскоростной жидкостной хроматографией. Результат показал, что отношение образования N ôîðhlèë-l>(-L

-аспартил-1.-фенилаланина к N-формил- 25

- Ь-1.-аспартил-1.-фенилаланину составляет 74,3: 25, /, причем общий выход двух соединений 98,41 считая на исходный L-фенилаланин.

29,5 г хлористого водорода вводят в реакционную смесь при температуре менее 60оС и полученную реакционную смесь подвергают реакции при 50-60 С

1 ч, Образованную реакционную смесь охлаждают до 25 L и подвергают дополнительной реакции при. 20-25 С 4 дня. о 35

Затем реакционную смесь охлаждают ниже 5 С и перемешивают при 0-5 С 3 ч.

M-АРМ гидрохлорид, выпавший при этих условиях в осадок, отфильтровы- 40 вают и промывают холодной водой, что дает влажную плотную массу отжатого на фильтре белого -APM-гидро" хлорида. Анализ влажного, обжатого на фильтре осадка высокоскоростной жидкостной хроматографией показал содержание 19,8 r M-АРМ. Выход 56,1ь, считая на исходный L-фенилаланин.

Пример 6. Влажный, отжатый на фильтре осадок, полученный по примеру

5, суспендируют в 200 мл воды и нейт" рализуют при 20-25 С 20:;-ным водным раствором гидроокиси натрия (рН 5,0).

Далее суспензию охлаждают до 50С и перемешивают 1 ч при той же температу55 ре. Выпавшие при этом кристаллы отфильтровывают, промывают холодной водой и высушивают в вакууме, что дает

17,5 г свободного -АРМ.

42 6

Анализ высокоскоростной жидкостной хроматографией показал, что в > -APM никаких загрязнений не обнаружено.

Удельное вращение 0 --АРМ: t> )>- 16,0 (с=4, 15 н. муравьиная кислота).

Пример 7. В смешанном растворителе, состоящем из 115 г воды и

18,2 г метанола растворяют 7,0 г хлопьевидного гидрата окиси калия и

19,8 г (0,12 моль) L-фенилаланина, после чего полученный водный раствор охлаждают до 0 С. К водному раствору постепенно добавляют 18,8 г (0,13 моль ангидрида N-формил-1.-аспарагиновой кислоты при температуре 0-5 С в течео ние 30 мин. Во время добавления одновременно к реакционной жидкости прибавляют каплями 15,5 г 504-ного водного раствора гидроокиси калия, выдерживая рН среды 8-11. Далее реакционную жидкость перемешивают 1 ч при той же температуре.

Долю реакционной жидкости анализи" руют высокоскоростной жидкостной хроматографией. Результат: отношение образования N-формил-Ы-1.-аспартил-L-фенилаланина к N-формил-Р-1.-аспартил-1.-фенилаланину составило 75,7:24,3 при общем выходе двух соединений

98,6" °

45,0 г хлористого водорода вводят в реакционную смесь при температуре ниже 55 С, после чего реакционную смесь подвергают реакции при 50-55 С.

1 ч. После этого реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и подвергают дополнительной реакции при комнатной температуре 6 дней.

После реакции реакционную смесь охлаждают ниже 5оС и перемешивают при

0-5 С 2 ч. k-APM-гидрохлорид при этом выпавший в осадок отфильтровывают и промывают холодной водой, что дает белый М-APM-гидрохлорид. Анализ

<-АРМ-гидрохлорида высокоскоростной жидкостной хроматографией показал, что он содержит 17,6 г М-АРМ при выходе 49,94, считая на исходный 1.-фенилаланин.

Пример 8. В смеси растворителей, состоящей из 66 г воды и 7,7 r метанола, растворяют 5>0 г гидроокиси натрия и 19,8 (0,12 моль) Ь-фенилаланина и полученный раствор охлаждают до 5 С,К раствору постепенно добавляют 18,8 г (0,13 моль) ангидрида-N-формил-L-аспарагиновой кислоты при а температуре ниже 10 С примерно 1 ч.

1556542

К реакционной жидкости прибавляют каплями 304-ный водный раствор гидроокиси натрия (19,0 г), выдерживая рН среды при 8-12. Реакцию продолжают

1 ч при той же температуре.

Часть реакционной жидкости анализируют BblcoKOGKopocTHOH жидкостной ,хроматографией. Результат показал: отношение образования N-формил-о -L-аспартил-1.-фенилаланина к N-Формил- 1.-аспартил-L -фенилаланину составило 74,8:25,2 при общем выходе двух соединений 97,8i.

5

В реакционную смесь вводят 31,0 г хлористого водорода при температуре о ниже 60 С и полученную реакционную смесь подвергают реакции при 50-60 С

1 ч. Выпавший в осадок хлорид натрия отфильтровывают и промывают небольшим количеством 20/-ной хлористоводородной кислоты. Фильтрат и промывные жидкости объединяют и подвергают реакции при 30 С 7 дней.

После реакции реакционную смесь обрабатывают, как указано в примере 1.

Таким путем получают М-!,PM гидрохлорид, содержащий 19,4 г -АРМ при выходе 55,0i, считая на исходный 30

L-фенилаланин.

Пример 9. В 33 г воды добавляют 330 г (0,2 моль L-фенилаланина, а затем каплями добавляют 21,3 г 50 ь ного водного раствора КОН. В раствор медленно загружают 34,3 г (0,,24 моль) ангидрида N-формил-Ь-аспарагиновой ,кислоты в течение 1 ч при 0-5 С и рекцию проводят при той же температу" е в течение 2 ч. На протяжении этой 40 процедуры рН реакционного раствора выдерживают в диапазоне 8-12 добавлением 501-ного водного раствора КОН каплями в раствор, (Общая масса раствора КОН составляет 32,6 г).

Порцию реакционной жидкости анализируют с помощью высокоскоростной жидкостной хроматографии, в результате чего соотношение между образующимся

N-Формил-М-1.-аспартил-L-фенилаланином

50 и N-формил- p-L-аспартил-L-фенилала нином составляет 73,5:26,5, а общий выход двух соединений составляет 97,8"ь в пересчете на L-фенилаланин.

К этой реакционной смеси добавляют

30,5 г метанола. Смесь нагревают при

50 С и к этой смеси медленно каплями добавляют 173,3 г 35/-ной хлористоводородной кислоты при 50-60 С, после чего смесь перемешивают в течение 1 ч при той же температуре.

Результирующую смесь охлаждают до

30 С и проводят реакцию дальше при той же температуре в течение 4 ч.

После охлаждения до 5 С или ниже и перемешивания в течение 3 ч при 0-5 С осажденный таким путем х-АРМ гидрохлорид отфильтровывают и промывают холодной водой с получением влажного осадка на фильтре Ж-АРМ гидрохлорида белого цвета. Влажный осадок на фильтре анализируют высокоскоростной жидкостной хроматографией, что указывает на содержание 27,8 г <-АРМ.

Пример 10. Процедуру примера 9, повторяют, но с тем исключением, f что 38,4 (1,2 моль) метанола используют вместо 30,5 г метанола для проведения реакции. Влажный остаток на

Фильтре представляет собой гидрохлорид

4-АРМ, содержащий 18,4 г О -АРМ.

Пример 11. В 190 r воды раст-, воряют 5,0 г твердого гидроксида натрия, а затем 19,8 г (О, I2 моль) L-фенилаланина и полученный раствор охлаждают до 0 С. К раствору медленно добавляют 1F,,8 г (0,13 моль) ангидрида N-формил-L-асларагиновой кислоты при 0-5 Г. После этого реакцию проводят при той же температуре s течение 1 ч. К реакционной жидкости прикалывают 45l-ный водный раст вор гидроксида натрия для сохранения его рН на уровне 9-11.

После завершения реакции к реакционной смеси добавляют 19,2 г метано- . ла. К этой смеси добавляют 58,8 г хлористого водорода после нагрева смеси до 50ОС и реакцию проводят при той же температуре в течение 1 ч. После этого смесь охлаждают до 30 С и дальнейшую реакцию ведут при 30 С в течение 5 сут.

Затем реакционную смесь охлаждают ниже 5 С и перемешивают при 0-5 С в течение 3 ч. Осажденный таким путем -APM-гидрохлорид отфильтровывают и промывают холодной водой с получением влажного остатка на фильтре в виде кристаллического <-АРМ-гидрохлорида белого цвета, который содержит 16,5 r =AP M, Пример 12. Реакцию конденсации L-Фенилаланина с ангидридом N-Фор" мил-1.-аспарагиновой кислоты прОводят по методике примера 9. После этого

1556542

1О к реакционной смеси добавляют 7,0 r метанола и 30,7 г хлористого водорода при 50-60 С и при той же температуре выдерживают.

После этого смесь охлаждают до

30 Г и выдерживают при 30 С в течение

6 сут. Повторяют методику примера 1 для получения влажного остатка на фильтре белых кристаллов о -APM-гид!

О рохлорида, которые содержат 23,3 r

<-АРМ.

Пример 13. В 66 г воды растворяют 14,4 г метанола, 5 1 г твердого гидроксида натрия и 19,8 г (0,12 моль) L-фенилаланина и образующийся раствор охлаждают до 0 С. К раствору при 0-5ОС в течение 30 мин медленно добавляют 18,8 г (0,13 моль) ангидрида N-формил-L-аспаратиновой

20 кислоты. В ходе этого добавления к реакционной жидкости для поддержания ее значения рН в диапазоне 9-l2 по каплям добавляют 12,8 г 45 -ного вод- ного раствора гидроксида натрия. После 25 этого реакцию осуществляют в течение

1 ч при той же температуре.

Часть реакционной жидкости подвергают анализу при помощи скоростной жидкостной хроматографии,по результа- ЗО там которой соотношение между образованием И-формил-Ы.-!.-аспартил-L-фенилаланина и N-формил-P-L-аспартил-L:-фенилаланина составило 74,2:25,8, в то время как суммарный выход двух со- 35 единений составил 98,6r. по отношеwe к исходному L-фенилаланину, 23,7 r хлористого водорода вводят . в реакционную смесь при температуре ниже 60 С и полученную реакционную 40 смесь подвергают взаимодействию при

50-60О0 в течение 1 ч. Образующуюся реакционную смесь охлаждают до 25ОС и подвергают дальнейшему взаимодействию при 20-25 С в течение 6 дней. Реакци- 45 ,онную смесь затем охлаждают до темпе ратуры ниже 5 С и перемешивают при

0-5 Ñ в течение 3 ч.

Выпавший в результате в осадок

М-АРМ-гидрохлорид подвергают фильтро50 ванию и промывают холодной водой с получением мокрого осадка на фильтре

<-АРМ-гидрохлорида белого цвета. Анализ мокрого осадка при помощи скоростной жидкостной хроматографии обнаружил, что в нем содержалось 15>9 г

<-APM с выходом 453 по отношению к исходному L-фенилаланину.

fl р и м е р l4. В 66 r воды растворяют 14,4 г метанола, 5,1 г твердого гидроксида натрия и 19,8 г (0,12 моль)

L-фенилала нина, и обра зующийся раствор охлаждают до О"С, К раствору при 0-5 С в течение 30 мин медленно добавляют

18,8 г (0,12 моль) ангидрида N-формил-L-аспаратиновой кислоты. В ходе этого добавления к реакционной жидкости для поддержания ее значения рН в диапазоне 9-12 по каплям добавляют

12,8 г 45l-ного водного раствора гидроксида натрия. После этого реакцию осуществляют в течение 1 ч при той же самой температуре.

Часть реакционной жидкости подвер, гают анализу при помощи скоростной ,жидкостной хроматографии, по результатам которой соотношение между образованием N-формил-М-L-аспартил-L-фенилаланина и N-формил-)Ъ-Е-аспартил-L- ôåнилаланина составило 74,2:26,8, в то время как суммарный выход двух соединений составил 98,6i по отношению к исходному L-фенилаланину.

34,3 r хлористого водорода вводят в реакционную смесь при температуре ниже 60 Г, и полученную реакционную смесь подвергают взаимодействию при

50-60 Г в течение 1 ч. Образующуюся реакционную смесь охлаждают до 25ОС и подвергают дальнейшему взаимодействию при 20-25 С в течение 6 дней. Ре акционную смесь затем охлаждают до температуры ниже 5ОC и перемешивают при 0-5ОС в течение 3 ч.

Выпавший в результате в осадок -APM-гидрохлорид подвергают фильтрованию и промывают холодной водой с получением мокрого осадка на фильтре

a -APM-гидрохлорида белого цвета. Анализ мокрого осадка при помощи скоростной жидкостной хроматографии обнаружил,что в нем содержалось 17,0 r

М-АРМ с выходом 48,23 по отношению к исходному 1.-фенилаланину.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет избирательно получать метиловый эфир Ж -L-аспартил-L-фенилаланина высокого качества из сложной смеси более простым путем.

Формула изобретения

Способ получения метилового эфира

M-L-аспартил-L-фенилаланина или есо гидрохлорида конденсацией ангидрида

N-формиласпарагиновой кислоты и L-фе12

Составитель Л. Иоффе

Техред М.Ходанич Корректор М. Самборская

Редактор С. Патрушева

Заказ 567 Тираж 309 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35,. Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина,101

ll 155654 (нилаланина в растворителе с образова-, нИем N-формил- -1.-аспартил-L-фенилаланина, который деформилируют и этерифицируют с использованием хлористоводородной кислоты и метанола, о т л и5 ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения содержания Ы-изомера в целевом продукте, в качестве растворителя используют воду, взятую в 3-10-кратном количестве

° по отношению к L-фенилаланину и конденсацию проводят при рН 8-12 в присутствии или отсутствии метанола в количестве 4-6 молей на 1 моль L-фенилаланина, а деформилирование и этерификацию ведут одновременно путем непосредственной обработки реакционной массы хлористоводородной кислотой в присутствии метанола, причем концентрация хлористоводородной кислоты составляет 15-25 мас.3, а метанол используют в количестве 4-6 молей на 1 моль

Ь-фенилаланина, полученный метиловый эфир Ь -1-аспартил-L-фенилаланин гидрохлорид выпадает в осадок, его отделяют и, при необходимости, нейтрализуют.