Способ получения конъюгата гидразона

 

Изобретение касается коньюгированных производных винбластиновых алкалоидов, в частности получения коньюгата гидразона общей формулы @ , где R=OCH<SB POS="POST">3</SB> или NH-N=HC-

R<SB POS="POST">1</SB>=H или C[O]-[CH<SB POS="POST">2</SB>]<SB POS="POST">2</SB>-C[O]-NH-N=CH-

M= 1-10, причем R≠NH-N=CH-, когда R<SB POS="POST">1</SB>=C[O]-[CH<SB POS="POST">2</SB>]<SB POS="POST">2</SB>-C/O/NH-N=CH-, а R<SB POS="POST">1</SB>≠C[O]-[CH<SB POS="POST">2</SB>]<SB POS="POST">2</SB>-C/O/NH-N=CH- когда R=NH-N=CH

GP - остаток иммуноглобулина или его фрагмента, обладающих противоопухолевым действием, что может быть использовано в медицине. Цель - создание новых более активных веществ указанного класса. Синтез ведут взаимодействием соответствующего винка-гидразина, где R=HN-NH<SB POS="POST">2</SB> или OCH<SB POS="POST">3</SB>

R<SB POS="POST">1</SB>=H или C[O][CH<SB POS="POST">2</SB>]<SB POS="POST">2</SB>C[O]NH-NH<SB POS="POST">2</SB>, причем R≠NH-NH<SB POS="POST">2</SB>, когда R<SB POS="POST">1</SB>=C[O][CH<SB POS="POST">2</SB>]<SB POS="POST">2</SB>-C[O]NH-NH<SB POS="POST">2</SB>, и R≠C[O]-[CH<SB POS="POST">2</SB>]<SB POS="POST">2</SB>-C[O]-NH-NH<SB POS="POST">2</SB>, когда R=NH-NH<SB POS="POST">2</SB>, с альдегидной группой окисленного иммуноглобулина или его фрагмента. В этом случае гидразидный коньюгат при дозах 3 - 0,375 мг/кг обеспечивает подавление роста опухоли, в то время как с известным гемисукцинатным коньюгатом не происходит полного подавления роста при дозах до 10 мг/кг винка-эквивалента. 6 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (53)5 С 07 D 519/04. (01 N 33 53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ .

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР. ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА ГЩ РА30НА (57) Изобретение касается конъюгированных производных винбластиновых алкалоидов, в частности получения уоньюгата гидразона общей ф-лы он

""cHз-снз г "H, с-осн, H 1 н ! г ""сн,-сн, ср снза ан, I снз

Изобретение относится к способу а именно конъюгата гзщразона общей получения новых коньюгированных про- формулы изводных винбластиновых алкалоидов, " CHI СНЗ

""н, с-осН, 1 н

I Н

"-сн,-снз ср, ан снз

117

1 (21) 4202656/23-04 (22) 22.05.87 (31) 867/183 (32) 27.05.86 (33) US (46) 30.04.90. Бюл. V"- 16 (71) Эли Лилли энд Компани (US) (72) Беннет Коулмэн Лагузза,и Синтиа

Линн Николс (US) (53) 547.945.1.07(088.8) (56) Заявка КР Р 0088695, кл. G 01 N 33/54, 1982.

Патент Великобритании Р 2090837, кл. С 07 G 7/00, 1982..Я0„„1561825 А 5

2 где R — ОСН или NH N=HG —;. RI-Н или

С (О) - (СНД -С P() J-NH-N=GH-; m=1 — 10, причем КфИН-N=CH-, когца 1С вЂ” С(О)— CH l С(О)ИН-И=(:Н-, а R, ф С(О)— (СНДз -С (01ИН-И= H-, когда R — ИН-N=

=СН> GP — остаток иммуноглобулина или его фрагмента, обладающих противоопухолевым действием, что может быть использовано в медицине. Цель изобретения — создание новых более активных веществ указанного класса.

Синтез ведут взаимодействием соответствующего винка-гидразина, где

R — HN-NH или UGH;; R< — Н или

С(О) (СНД, С(0)ИН-ИН, причем к г ИН-ИН, когда К, — G P()) (СНД -С (0)NH-ИН, и R ф С(О) — (СН 1 - $0)-NH-NH когда R — NH-NH<, с альдегидной группой окисленного иммуноглобулина или его фрагмента. В этом случае гндразидный.конъюгат при дозах 3

0,375 мг/мг обеспечивает подавление роста опухоли, в то время как с известным гемисукцинатным конъюгатом не происходит полного подавления роста при дозах до 10 мг/кг винка-эквивалента. 6 табл.

1561825

ЗО где R — ОСН или - NHN--СН-группа;

Э

RA — Н< — СОСИ СН@-СОИНИ=СН-группа;

m = 1-10, причем R не может быть - ИНИ =:СН-, когда RyCO(СН ) CONHN-СН-, а R йе может быть СО(СЬ ) СОИНИ-СН-, когда R — NHN-СН-, СР— остаток иммуноглобулина или ега фрагмента, 10 обладающих противоопухолевым действием,.

Цель изобретения — получение новых канъюгатов гидралона, обладающих фармакологическими преимуществами перед конъюгираванными аналогами.

Пример 1. Получение 4 -деокси-4-дезацетиллейрозидин-3-карбаксигидразид-И-"-сукцинимида.

Раствор готовят из 1320 мк 4 -де- 2О окси-4-дезацетиллейрозидин-3-карбоксигидразида в 25 мл пиридина. 175 мг ангидрида янтарной кислоты прибавляют к раствору и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 25 в атмосфере азата примерно в течение

24 ч. Затем из реакционной смеси н вакууме удаляют летучие компоненты, а образующийся осадок поглощает метилендихлорид .в комбинации с достаточным количеством метанола для полного растворения полученного осадка. 0praнический слой дважды промывают- равным по объему количеством воды, а затем высушивают. При упаривании летучих компонентов в накууМе получают

i осадок, содержащий 1Р-сукцинаил 4— деокси-4-дезацетиллейрозидин-3-карбоксигидразин, который растворяют в

25 мл пиридина, к которому прибавлено 40

350 мг ангидрида уксусной кислоты.

В результате образуется cMPIHBBIbIH ангидрид янтарной и уксусной кислот, который одновременно циклизуется, да-! вая 4 -деокси-4-дез аце тиллейрозидинЗ-карбоксигидразид-.N2-сукцинимид.

Реакционную смесь упаринают досуха в вакууме, а полученный осадок. растворяют в метилендихлориде, Экстракт метилендихлорида промывают дважды .5у равным по объему количеством воды, а затем высушивают. При упаривании двуххлористого метилена получают 4 -деокси-4-дезацетиллейроэидин-3-карбакси ., гидраэид-И2 -сукцинимида, который хро- 55 матографируют на колонке из силикагеля этилацетатом, содержащим в качест ве элюента возрастающие количества метанола (0-50%) . Фракции, которые (как установлено тонкослойнай хроматографией) содержат требуемое сукцинимидное производное, соединяют и выпаривают в вакууме твердое вещество.

Получено 190 мг 4 -деакси-4-дезацетиллейрозидин-3-карhаксигидразид-N-сукцинимида со следующими физическими характеристиками:

ИК-спектр.(в хлороформе): 3470;

1736; 1615 и 1572 см .

ЯМР (СРС1 ): 10,90; 7,88; 7,49;

7,12; 6,48; 6,05; 5,80; 4,10;, 3,76;

Сульфатную соль получают путем растворения свободного основания в безводном этаноле при рН 8,0„ Затем рН устанавливают 3,9, используя свежеприготовленный раствор 2%-ной серной кислоты в этаноле, При упаривании реакционной смеси досуха получают

4 -деокси-4-дезацетиллейразицин-3карбоксигидразид-N2-сукцинимидный сульфат, Следуя указанной методике, 4-дезацетилвинбластиноный гидразид (2,4 r) растворяют н 125 мл пиридина, к которому прибавлено .385 мг ангидрида глу-.àðîâîé кислоты, Полученный таким образом N -глутароиланый 4-дезацетилVLB-3-карбоксигидразид выделяют по указанной методике и очищают хроматографией на силикагеле с использованием аналогичной системы растворителя, как описано выше. Полученное глутароильнае соединение взаимодействует с ангидридом уксусной кислоты, образуя смешанный ангидрид, который одновременно циклизуется с выходом 4-дезацетил-VLB-3-.карбоксигидразид-N — глутаримида. Указанное соединение очищают хроматографией на силикагеле с использованием указанной системы растворителя. Получают 460 мг N2-глутаримиднога производного, которое имеет следующие физические характеристики:

Масс-спектр, н!е = 864 (С зН6<> И60з) .

ИК-спектр (СНС1 ): 3475; i 714 и 1616 см-", рКа (66%-ный водный раствор ДМФ

DNF): 5; 1,7; 12,9, ЯМР (СОС1 ): 9,96; 8,91; 8,04;

7,52; 7,14; 6,58; 6,08; 5,83; 4,15;

Сульфатную соль получают па указанному методу. Из 290 мг исходного материала получают 210 мг соли.

15618!

С но

СнО

1 . «

Следуя указанному методу, но .опять заменяя 4-дезацетил-ULB-3-карбоксигидразид на 4 -деокси-4-дезацетиллейроэидин-3-карбоксигидразид, используя вместо ангидрида уксус- . ной кислоты хлористый ацетил, получают N -сукциноил-4-дезацетилULB-3-карбаксигидраэид. При хроматографии сукцинимицного продукта выходит две фракции, одна из которых представляет. ожидаемый 4-дезацетил-VLВ-3-карбоксигидразид-N — сукцинимид, а другая — ега 4-ацетилпроизводное, образуемое в качестве побочного продукта во время процесса циклизации. 4-дезацетил-VI.В-З-карбоксигидразид-1И -сукцинимид имеет следующие физические характеристики:

Масс-спектр, ш/е=850 (С „Н,Д Оз) ° 20

ИК-.спектр (KHr): 3480;.1734 и 1616 см .

ЯМР (С1)С1 ): 9. 69: 9. 47; 8, 22;

7,49; 7,12; 6»53; 6,07; 5,82; 5,71; и 0,89.

Сульфатную соль получают по указанному способу. Выход 250 мг из

350 мг исходного материала.

Пример 2. Готовят раствор путем растворения 2,5 r 4-дезацетил4-гемисукциката (4-сукциноил-ЧВ) в 50 мл хлороформа, Добавляют 870 мг

N-метилморфолина, По завершении растворения реакционную смесь охлаждают в ледяной бане и подают ток азота.

Добавляют 985 мг изобутилхлорформата и реакционную смесь перемешивают при

0 С в течение 45 мин. Добавляют 1 мл о безводного гидразина и реакционную дд смесь перемешивают около 10 мин.

Затем реакционную смесь экстрагируют водой, водный спой отделяют и отбрасывают и органический слой сушат.

Выпаривание растворителя дает остаток, содержащии 4-дезацетил- Л.В-4гемисукцинат гидразид. Раствор остатка B метиленхлориде хроматографкруют на силикагеле, используя в качестве элюента смесь этилацетата и метанола 5О

100:Π— 50:50). Сааответствующие фракции дают 950 мг очищенного гидразида

4-дезацетил-У? В-4-гемисукцината; ш/е=882.

Сульфатную соль получают путем

55 растворения основания в безводном этанале (25 мл), доведения рН примерно до 4 с помощью 2Х-ного раствора серной кислоты в этаноле (24,5 г без25 6 водного этанола, 0,5 r 18 М Н ЬО+) и удаления растворителей в вакууме.

ИК-спектр: 3400; 3009; 1738; 1680 и 1616 см .

ЯМР (Cl)01>): 9»9; 8»35; 8»05; 7»55;

7»10; 6»85; 6»10; 5,85; 5»45; 5»30»

Предлагаемые конъюгаты включают окисленкые гликапратеины» предпочтительно иммуноглабулины, и из этого класса предпочтительно моноклональнае антитела (МоАЬ)» представляющее, собой гамма-глобулин, такой как IgC или 18М. Фрагменты иммуноглобулина (Ig), содержащие углевод, так же как исходный иммунаглобулин, из которога получают эти фрагменты, могут быть ! использованы для образования новых какъюгатов така: î же типа.

Предпочтительный класЦ гликопротеиков (иммунаглобуликы) представляет собой соединения, которые реагируют или па крайней мере распознают антигены ка клетке-мишени, т.е. они имеют свойства распознавания антигенов.

В особенности предпочтительными являются те гликопратеины, которые распознают актиггкы на поверхности клетки-мишени.

Предпочтительным видом антитела дпя использования в изобретении явля; ется иммукоглобулин, представляющий собой гамма-гпабулин, В особенности предпочтительными являются виды Х8С»

IgA, lgE u IgN.

Предпочтительными канъюгатами являются те, которые приготовлены из моноклональных антител, в особенности "е, чта распознают клетки рака человека» такого как аденакарцинома. чешуйчатая клеточная карцикома, переходная клеточная карцинома, мелакома, нейробластама, мелкаклеточная карцинома, лейкемия, лимфома и саркома.

Гликапратеин (ГП) указанного типа может быть акислек периодатам или другим подходящим акисляющим агентом так, что связь между соседними диалами в поверхностном углеводе разрывается и образуются альдегидные группы по обе сторакы исходной связи

1561825

Часть структуры углевода - диальдегидный продукт °

Число полученных диальдегидных е единиц является результатом следующих факторов; количества используемого периодата, общих условий реакций окисления (например, времени, температуры, растворителя, концентрации и т.д.)., числа соседних диодов углеводных единиц, присутствующих в протеине, и их доступности для периодатного реагента.

Альтернативно или в сочетании с периодатом можно использовать фермен- 15 тативное окисление, например, оксидазой галактозы. Это более селективный и ограничивающий реагент, катализирующий превращение 6-0Н группы остатФ ков галактозы в углеводных цепях гли- 20 копротеина в альдегидные группы. Эта

6-СН ОН-группа должна быть незамещенной, чтобы обеспечить успешное окисление. Демаскирование блокирующей группы, такой как группа, в которой имеется остаток сиалиновой кислоты, может быть обеспечено с помощью Àåðмента нейроминидазы. Число получаемых альдегидных остатков является функцией многих параметров. 30

Альдегидсодержащие гликопротеины (ОСН) -< Р затем конъюгируют с винкагидразидом.

Число m является функцией числа альдегидных групп, возникающих IIpH 35 описанном окислении. Обнаружены коньюгаты, содержащие 25 винкаостатКоВ на антитело. Среднее значение (винкаостатков на антитело) примерно

1 - 10 (т,е. m=1 — 10), предпочтитель-40 ное значение примерно 4 - 10.

Конъюгирование винкагидразидов с окисленными гликопротеинами провоФ дится по стандартным методикам. Раствор винкасоединения в растворителе, 45 смешиваемом с водой, таком как диметилформамид, добавляют к охлажденному буферному водному раствору окисленного гликопротеина. Предпочтительная температурами 0 — 8 С, обычно исполь- 50 зуют буфер 0,1 н. ацетата натрия.

Реакцию лучше проводить в темноте и в инертной атмосфере. Реакция обычно заканчивается за 10 — 24 ч, образующийся конъюгат может быть очищен стандартными методами, таком как хроматограАия на сеАадексе.

Далее следует описание окисления и конъюгирования сиецифических MoAb.

Пример 3. Конъюгирование с

Х-63AG8-S1 MoAb.

Готовят раствор путем растворения

200 мг Х-63AGB-S1 (1 мл=приблизительно 150000, 1,34х10 моль; клеточная линия депонирована как АТСС 11В9> кол лекция культур американского типа, 12301 Parklawn Drive, Rockville MD

20852) в 20 мл буАера 0,1 М ацетата натрия, рН 5,6 (29,3 r ацетата натрия, 2,44 мл уксусной кислоты плюс достаточное количество стерилизованной воды для изготовления 4 л буфера).

Раствор хранят при 0 С в течение ночи (около 10% протеина не растворяется}.

Добавляют 685 мг метапериодата натрия за один .прием при энергичном перемешивании, Смесь перемешивают 2 1 мин при о

-О С в темноте и затем гасят реакцию путем добавления 5-кратного избытка (на полное количество периодата)этиленгликоля (1,28 мл 12,5 М раствора этиленгликоля в стерильной воде). Новую смесь перемешивают при 0 С в течение 5 мин в темноте и затем центрифугируют, получая прозрачную надосадочную жидкость и белый осадок. Надосадочную жидкость загружают в колонну с гелем сефадекс G25 (средняя зернистость) и продукт элюируют тем же буфером ацетата натрия. Элюат проверяют

УФ-облучения при 280 мм. Периодат смывают с колонны и отбрасывают, Концентрацию окисленного продукта оценивают в каждой фракции элюата при 279 нм.

Выход 96%. Проведенный так же второй опыт дает 96,5%-ный выход.

Растворы элюата, содержащие 4,72 и 4,02 мг/мл окисленного продукта, смешивают и добавляют буфер 0,.1 н. ацетата натрия для получения конечной концентрации протеина 2,77 мг/мл (полный объем 69 мл). Раствор охлаждают примерно до 0 С.

Раствор 4-дезацетил-VI.Â-3-карбоксигидразида в ДМФ (5,6 мл и

53,7 мг/мл раствора) добавляют по каплям к охлажденному буАерному раствору NoAb. Реакционный сосуд промывают азотом и закрывают. Реакционную смесь перемешивают при охлаждении и в темноте магнитной мешалкой в течение 24 ч. Затем реакционный сосуд открывают и центриАугируют прозрачную бледно-желтую реакционную смесь.

Надосадочную жидкость хроматографируют на геле сефадекс G25, предвари

1561825 тельно уравновешенном до рН 7,4, фосфатно-соленым буфером (0,0i М

Н РО, 0,15 М Na01)> который используют также в качестве элюента.

Конъюгат (образованный гидразонной связью между 3-карбоксигидразидной группой и альдегидной группой в

МоАЬ) элюируют сначала с последующим злюированием непрореагировавшего 4де-зацетил-VL8-3-карбоксигидразида, Выход полученного конъюгата (из 4 колонн) составляет 173 мг в 224 мл (907-ный выход), Конъюгат содержит около 6 моль 4-дезацетил VLB-3-кар- . 15 боксигидразона на моль Х-63А(:8 — $1

МОЛЬ.

Второй опыт проводят, используя

200 мг KS 1/4 МоАЪ, способный к распознаванию поверхностных антигенов 20 клеток (аденокарциномы человека), в 20,0 мл ацетатного буфера и то же количество периодата и этиленгликоля, как в примере 3. Опыт дает 176 мг окисленного ИоАЬ в 39,9 мл буфера после хроматографии (88%-ный выход), Конъюгирование с 274 мг 4-дезацетилVLB-3-карбоксигидразидом в ацетатном буфере, рН 5,6, дает 146 мг (83X-ный выход) конъюгата, содержаще- 30

ro около 7,5 моль 4-дезацетил"- Л.В-Зкарбоксигидразона на моль KS 1/4.

По указанной методике получают конъюгат путем взаимодействия 4-дезацетил-ULH-3-карбоксигидразида с 35 альдегидными группами, образованными окислением поверхностных углеводов

9.2.27 гликопротеина МоАЪ, способного z распознаванию антигенных свойств, на поверхности клеток меланомы чело- 40 века. Опыт при использовании 200 мг

ИоАЪ, окисленного 685 мг метапериодата натрия в ацетатном буфере при рН

5,6 (0,1 М), дает альдегидсодержащий окисленный 9. ?.27 МоАЬ с 92%-ным вы- 45 ходом (184 мг). Этот-продукт конъюгируют с 4-дезацетил-1Л.В-З-карбоксигидразидом (279 мг). Конечный выход поли-4-дезацетил- Л.В-гидразона .окислен ного альдегидсодержащего 9.2.27-конь- 50 югата в виде раствора в фосфатно-соленом буфере составляет 91Х.

Продукт содержит около 4,9 моль исходного винка на моль 9.2.27.

По методике, описанной в примере 3, 55 как представлено в табл. i получают несколько других конъюгатов антител, используя 4-дезацетил-1Л.В-З карбоксигидразид в качестве остатка винка.

Таблица 1

Антитело е число молей на моль антиконечном ированном проП р и м е ч а н и е. Число в скобках указывает количество опытов, использованных при вычислении среднего.

В этой группе обнаружен один конъюгат, содержащий около 27 викка-групп на антитело °

Конъюгаты также могут быть получены с фрагментами иммуноглобулина Ig, мономером IgM или другими мономерами Ig содержащими углевод, полученными из исходного антитела путем, например, расщепления протеолитическим ферментом или восстановительного алкилирования, Предпочтительными протеолитическими ферментами для получения этих фрагментов являются пепсин и папани.

Исследование конъюгатов по изобретению может быть проведено, используя известную технику, такую как афин ная хроматография. Действие конъюгата может быть оценено путем подсчета числа жизнеспособных клеток после обработки конъюгатом суспензии опухолевых клеток или путем измерения погло щения тритированного уридина. Концентрации протеина и лекарственного препарата определяют путем измерения оптической плотности растворов конъю

1 гата при двух длинах волн, например

270 и 279 нм, и сопоставления полученных значений со значениями для

11,,285.14

11А8

11В2

i3Hi

14.95.55

17К12

2Ai 1

324.9.4.10

4D 2

4E8,i1

6П2

Г9

L1KS

L2KS

L,4KS

L6KS

ZCE-025

4,2 (3)

5,7 (4)

5 5 (б)

4,1 (1)

6,2 (4)

4,2 (1)

6,0 (1)

3,9 (2)

4,3 (6)

4 4 (3)

5,i (4) б,б (2)

5,8 (7)

6,4 (2)

4,5 (4)

4, 25 (2)

11,9 (11) 1561 825

Таблица3

VI l ".Ý.ß.* мг/кг содержание винка

Клеточная линия аденокарциномы

И14-меланома

FTN-меланома

$С1-меланома

SKMKL28-меланома

А375 (0,0625 (0,375 (0,375 с0,375

«0,185

Таблица

L1-KS 11

0,05

0,0625

0,5

0.,3

О, 125

О, 125

1,2

0,6 ,5 (0,5

РЗИ GLA

HY-29

РА»»И

1,$1 74

РЗИ CLA

РЗИ С»А

РЗИ CI.А

РЗИ CI.A

I.$1 74

I,$174

? 2-KS

<1

L4-KS

<»

11. 285. 14

14.95.55

VX007B свободного лекарственного препарата и неконъюгированного иммуноглобулина при тех же длинах волн, Конъюгат мож но также подвергнуть оценке in vivo против ксенотрансплантантов опухолей человека в атипических мышах.

Новые конъюгаты эффективны в широком интервале доэировок. Например, для лечения взрослых людей, больных раком, дозы обычно находятся в интервале 0,01 - 10 мг/кг (остаток винка), чаще всего в интервале 0,03 - 9 мг/кг.

Однако следует иметь в виду, что ко личество принимаемого конъюгата определяется врачом в зависимости от условия и курса лечения.

В следующих таблицах указано действие предлагаемых конъюгатов при лечении новообразований. 20

В табл. 2 приведена минимальная . эффективная доза (винка эквивалент) в моделях меланомы конъюгата 9,2.27дезацетил-VLB-гидразида.

Та блица2

Клеточная линия М. Э .Д., мг/кг сомеланомы держание винка

П р и м е ч а н и е. М.Э.Д. -. минимальная эффективная доза, которая демонстрирует )50X подавления роста опухоли в течение 28 дней, конъюгата

9.2.27-дезацетил-VI.Â-гидразида в пе- ц» ресчете на содержание нинка за трехразовое внутривенное введение (2, 5 и 8 дни после имплантации опухоли).

В табл. 3 показана минимальная эффективная доза (винка эквивалент) в моделях ксенотрансплантантов адено-, карциномы конъюгата К$1/4-дезацетилVLB-гидразида.

РЗ-ИСХОД вЂ” карцинома легкого человека (0,0625

НТ-29 - колорек-. тальная карцинома (0,25

НТ-29 -ЧТК** — колоректальная карцинома (0,25

* M.Ý.Ä. — минимальная эффективная доза, которая демонстрирует >50Х подавления роста опухоли, конъюгата

К$1/4-дезацетил VLB-гидразида в пересчете на содержание винка за трехразовое внутривенное введение (2, 5 и 8 дни после имплантации опухоли). * НТ 29VTE представляет собой отобранный in vivo вариант клеточной линии устойчивый к терапии винка алкалоидами.

В табл. 4 показана минимальная эффективная доза конъюгатов моноклонального антитела 4-дезацетил-VI.Âгидразида в моделях человеческих опухолей на мышах.

1561825

Продолжение табл. 4

РЗХ63АС-8/Si/ч

2)

602

4012

11А8

„„47Н12

::. 13Hi

* То же, что в табл. 2 и 3.

** Винка-содержимое конъюгата — 4-дезацетил7ЬВ-гидразид.

*** РЗИ CLA — аденокарцинома легкого; НТ-29 - аденокарцинома толстой кишки; РАВИ - глоточная чешуйчатая клеточная карцинома; ЬS174 — аденокарци- . нома толстой кишки; Т222 — клеточная карцинома.

<) Животным вводили конъюгат три раза в период

2 - 8 дней после имплантации, опухоли. Опухоли измеряли 28 дней после имплантации. Ингибирование определяли по отношению к животным, обработанным РЬЯ в качестве контрольных.

2) Использовался ToT Ee протокол, что B I ), но доз вводили на 3, 6 и 9 дни и опухоли измеряли через 2, 3 или 4 недели.

Т а б л и ц а 5

Лекарство

Процент подавления

ДАИ1Б-гидразид

К$1/4 конъюгат

ДАВЛБ-гидразид

KS1/4 конъюгат

1,0

0;1 .1,0

0,1

100

*мг/кг викка или содержание викка.

РЗИ-СЬА

НТ-29

Т222

Т222

РАВИ .

РЗИ СЬА

РАВИ

Т222

Т?22™

Т222

В опыте голые мыши были заражены клетками РЗИ СЬА аденокарциномы человеческого легкого путем подкожного введения в день О. На 2, 5 и 8 день после этого группы по четыре или пять животных подвергали обработке путем внутривенного введения либо конъюгата либо описанного нинка-- производного. На 28-й день измеряли опухоль

) 1,0

3,0

1-2

1-2

0,5

)2,0

1-2

)2,0

1-2

)2,0

35 и определяли процент подавления путем сравнения массы опухоли обработанных групп животных с необработанными контрольными животными, Доза выражена в мг/кг содержания викка в конъюгате.

40 Результаты эксперимента приведены в табл. 5.

В табл. 5 показан опыт с аденокар", ционной РЗИ СЬА.

15б1 825 он сн,-сн, "н

С вЂ” OCH

3 н i O сн,-сн, ср ок,, оп

СН3 i

COR сн,о

ДАВЛБгемисукцинат

KS1/4 конъюгат

10,0

18

5,0

2,5

1,25

ДАВЛБгидраэид

100

3,0

1,5

KS1/4 конъюгат

OH сн2 снз

"Н

0,73

0,375

100 с-осн, 1 !j о

I ! !,сн -сн, он

ОН3О

= он

СНЗСОК

В табл. 5 ДАВЛБ-гидразид предстаЫ ляет собой 4-дезацетилвинбластин-3карбоксигидразид, как приведено в британской заявке на патент У OB

2 090 837А, тогда как конъюгат ДАВЛВ5 гидраэида — KS1/4 представляет собой конъюгат, полученный согласно методике, описанной в примере 3.

Как видно из приведенных данных, 10 в основном полное подавление роста опухоли наблюдалось при уровнях дозировок конъюгата 1 0 мг/кг, тогда как при том же уровне свободный ДАВЛБгидразид .проявлял только минимальное действие. Таким образом, эксперимент показшвает, что лекарство - коньюгат иммуноглобулина согласно изобретению имеет очевидные преимущества по сравнению со свободным лекарством в конь- 20 югированной форме.

Аналогичным образом сравнение этого же конъюгата с конъюгатом с тем же антителом, но приготовленным так, как описано н патенте СССР У t362404,, т.е. конъюгат сукцината, известный как коньюгат-4-.дезацетилнинбластин4-гемисукцината с антителом KS1/4, проведено по той же схеме, которая описана н табл. 5, но в человеческой 30 колоректальной аденокарциноме. Измерение опухоли произвели на 35-й день.

Результаты приведены в табл. 6..

В табл.б дана колоректальная аденокарцинома, НТ-29 человека.

) Х

Т а блица 6

««« «««« 4

Лекарство Доза, мг/кг* Процент подавления мг/кг нинка или содержание нинка.

Как видно из полученных данных, гемисукцинатный коньюгат при дозах до 10 мг/кг нинка эквивалента показал в лучшем случае только умеренную активность, которая HP приблизилась к полному подавлению роста опухолй, а предлагаемый гидраэидный конъюгат показал в основном подавление роста опухоли при дозах 3 — 0,375 мг/кг.

Таким образом, эксперимент показывает большую биологическую активность предлагаемых конъюгатон по сравнению с конъюгатами сравниваемого нинка и антитела, коньюгированных другим способом, Конъюгаты проявляют среднюю токсичность, но обладают большим терапевтическим индексом, чем известные лекарства и конъюгаты, применяемые для лечения раковых заболеваний, и могуT 6blTb 3AApктинно применены для лечения раковых больных, ч ормула иэ о бр е те ния

Способ получения коньюгата гидразона общей формулы

ape R — ОСН или -МНЛ=СН-группа;

К, — Н. СОСН СН -СОМНИ=СЯ-группа; !

m = 1-10, причем К не может быть

NHN=CH-, когда R 1 — СО(СН }

C0NHN — OH- а R< не может быть СО(СН .) OONHN — СН-, когда

R — ИН1)СН-, (Р— остаток иммуноглобулина или его фрагмента, отличающийся тем, что нинка-гидразин общей формулы ХХ

Составитель И,Федосеева

Редактор И.Петрова Техред Л,Сердюкова Корректор Л.Патай

Заказ 985 Тираж 334 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д. 4 /5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

17 где R - ИНИН группа или ОСН, R„- H, или СО(СН ) СОЯНИН, причем

К не является NHNH, когда

R, — СО (H ) CONHNH и R, не

sra seTc CO(CH ) CONHNH, 6i825 когда R представляет собой

NHNH подвергают взаимодействию с альдегидной группой окисленного иммчно5 глобулина или его фрагмента..