Штамм бактерий вrаdyrнizовiuм lupini для получения бактериального препарата под люпин

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый штамм, предназначенный для изготовления бактериального удобрения нитрагина под люпин. Целью изобретения является получение штамма клубеньковых бактерий, обладающего более высокой азотфиксирующей активностью и позволяющего получить более высокий по сравнению с известным урожай зеленой массы, зерна люпина и увеличить содержание белка в фитомассе люпина. Штамм BRADYRHIZOBIUM LUPINI 1622 выделен из клубеньков люпина желтого и депонирован во Всесоюзной коллекции клубеньковых бактерий ВНИИСХМ N 1622. Штамм BRADYRHIZOBIUM LUPINI 1622 при инокуляции семян люпина обеспечивает прибавку урожая зерна (по сравнению с известным штаммом) на 5 - 37%, зеленой массы - на 7 - 26%, содержание протеина в зерне - на 2,1 - 3,3%, в зеленой массе - на 1,1 - 1,4%. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СО!.1ИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (!9) (! 1!

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4357183/31 — 13 (22) 04.01.86 (46) 23.05.90. Бюл. М 19 (71) Институт микробиологии АН БССР и Белорусский научно-исследовательский институт земледелия (72) Н. И. Мильто, М. Е. Кобзырева, Н. В. Шнейдер (Могилевец), Л. И. Стефанович и И. P. Ходорцев (53) 631 ° 461(088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

1 - 640988, кл. С 05 Р 11 /08, 1979.

Авторское свидетельство СССР

Р 647297, кл. С 05 F \1 /08, 1979.

Кожемяков А. А., Афанасьева Л. М., Новикова А. Г. Оценка эффективности новых штаммов клубеньковых бактерий в Географической сети опытов с нитрагином (1977-1982 r.r.) . Бюллетень

ВНИИСХМ. Л., 1985, Р 40, с. 25-30. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BRADYRHIZOBI(Ef

LIJPINI ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО

ПРЕПАРАТА ПОД Л10ПИН

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и предотавляет собой новый штамм, предназначенный для изготовления бактериального удобрения нитрагина под люпин.

Целью изобретения является получение штамма клубеньковых бактерий, обладающего более высокой азотфиксирующей ак тивностью, позволяющего получить по сравнению с известным более высокий урожай зеленой массы, зерна люпина и (51) 5 С 05 F 11/08, С 12 И 1/20

//(С 12 N 1/20, С 12 R 1:01) 2 (57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый штамм, предназначенный для изготовления бактериального удобрения нитрагина под люпин. Целью изобретения является получение штамма клубеньковых бактерий, обладающего более высокой азотфиксирующей активностью и позволяющего получить более высокий по сравнению с известным урожай зеленой массы, зерна люпина и увеличить содержание белка в фитомассе люпина. Штамм Bradyrhizobium

lupini !"- 1622 выделен из клубеньков люпина желтого и депонирован во Всесоюзной коллекции клубеньковых бактерий

ВНИИСХМ Р 1622. Штамм Bradyrhizobium

lupini Р 1622 при инокуляции семян люпина обеспечивает прибавку урожая зерна (по сравнению с известным штаммом) на 5-37%, зеленой массы на 7

26%, содержание протеина в зерне на

2,1-3,3%, в зеленой массе на 1,1-1,4%.

3 табл. увеличить содержание белка в фитомассе люпина.

Штамм Bradyrhizobium lupini Р 1622 выделен из клубеньков люпина желтого

Lupinis luteus L.

При выделении штамма поступают следующим образом.

Отделенный от корней растений люпина клубенек отмывают водой, затем помещают на 1 мин в 95% †н этиловый спирт, дезинфицируют в течение Змии

1565831 в 0,1% — ном растворе сулемы, отмывают от сулемы спиртом и затем стерильной водой. После промывки клубенек обожженнь|м пинцетом переносят в стериль- 5 ную пробирку, содержащую 3-5 капель воды, и раздавливают стерильной палочкой. Полученную бактериальную суспенэию берут стерильной пипеткой и одну каплю наносят на разлитую в чаш- 10 ки Петри агаризованную тпапиновую среду и тщательно растирают шпателем по всей поверхности. Эатем этим же шпателем последовательно обрабатываtîò поверхность агаризованной среды в двух других чашках.

После посева чашки ставят в термос"ат при 28 С и через 7 дней на --ашке с минимальнь:м количеством колони- : выбирают обособленную типичну1о,, хоро- 20 шо развитую колонию, Из колонии от, бирают петлей культуру и.производят посев штрихом на скошенную агариэованную люпиновую среду, разлитую в пробирки. Одновременно одну петлю с 25 культурой н ано ся т в к аплю с те ригг. но и воды на предметном стекле для микро— скопирования.

Пробирки с отвитой культурой помещают в термостат при 28 С„ инкубиру|от 30 в течение 10 дней и пссле хорошего развития бактерий хранят их в холо-. дилънике при 4-5 C.

0 чистоте изолята судят пс резуль3 татам микроскопирования препаратов:,. изготовленных из исходных колоний и отвитых на косяки в пробирки культур.

Штамм выращивают на люпиновом ага— ре. следующего состава: отвар люлина

1 ч, К НРО, 0,5 г, И@80, ° УН О 0„2 г„Я1а01

0,2 г, CaS0q О,-1 г, молибденовокисльп аммоний — следы, маннит (вносят после расплавления агapa) 10%, агар-агар

20 r, рН 6,8-7, О, Отвар люпина готовят следующим образом. 50 r пророщенных высушенных семян желтого люпина заливают 1 л водопроводной воды,, кипятят 30 мин, охлаждают, отфильтровывают через ватноЯ1 марлевый фильтр и доводят до первоначальноо го о бъема °

Штамм Bradyrhizob Lum lupini идентифицирован по 8-у изданию Определи.теля микроорганизмов Берги. Депони55 рован во Всесоюзной коллекции клубеньковых бактерий ВНИИСХМ под Р 1622.

Штамм имеет следующие культурально-морфологические признаки.

Клетки одиночные, слегка изогнутые палочки. Цепочки, споры отсутствуют. Размеры 7-суто;ной культуры клеток 0,8-1,0х1,4-1,9 мкм. Грамотрицательные. Культура. медленно растушая.

Рост на плотных средах. Люпиновый агар, 28 С, 7 сут, Штрих обильный, растекающийся, беловатый, слизистый.

Колонии крупные 1,2-2 мм, бечоватые, слегка выпуклые с блестящей слизистой поверхностью и ровными краями.

Маннитно-дрожжевая агаризованная среда, 28 С., 7 сут. Штрих идентичный, Колонии идентичные.

Среда Норриса агаризованная, 28 С, 7 сут. Штрих идентичный. Колонии идентичные.

Рост на жидких срецах. 11(идкая среда Норриса, 7 сут, 28 С, качалка

220 об/мин.

Характер роста, Равномерное помутнение среды с выпадением незначительного серовато-белого осадка в последние дни культивирования. рН в начале культивирова ния б, 3, после 7 сут выращивания 6,6.

Жидкая люпиновая среда, 28 С, 7 сут качалка 220 об/мин, Характер роста идентичный. рН в начале культивирования 6,3, после

7 сут выращивания 6,5,, физиолого †биохимическ свойства приз яаки.

На мясо-пептонном агаре штамм не растет. Молоко с лакмусо.л подщелачивает, слизистое кольцо на поверхности молока не образует, Желатину не разжюкает. Аэроб. Растет при 20-30 С, о

Оп тимум температуры +28 С. Оптимальное значение рН 6,2-6,5.

Растет на средах с углеводами. Хорошо использует сахарозу, глокоэу, лак тозу, мальтозу„ наилучший рост имеет на среде с маннитом, минимальный — c глицерином. Способен ассимилировать цитрат натрия.

Выход клеток на единицу использованного источника углеродного питания на 80% выше, чем у известного штамма — Rhizobium lupini 1."- 363а. Это свидетельствует об экономном расходовании штаммогл источников углеродного питания.

Отношение к источникам азота.

Хорошо использует азот глутамата натрия, слабее — азот аммониинь.х со лей нитратов, моче вины, пеп тона и

5 5658 слабо усваивает;kaîò аспарлгина. Восстанавливает нитрлты в нитриты.

В стимуляторах роста не нуждается.

Признаки штамма устойчивы. Итамм . не патогенен. Пересевается один раз в 6 мес и хранится при 4 — 5О С.

Используют штамм для получения бактерилльного удобрения следующим образом. 10

Жидкую ляпиновуя питательную среду приведенного состава разливают по

200 мл в конические стеклянные колбы емкостью 500 мл, закрывают ватными пробками и стерилизуят в автоклаве при 1 лтм (120 С) в течение 30 мин.

После стерилизации в асептических условиях определяют рН среды и при отклонении рН от 6,2 — 6.3 приводят рН к указанному значению с помощью 107.- 20 ных стерильных растворов НС1 или

Na0H ° Определяют сохранение стерильности средь!. Для чего 1 мл среды с установленным рН в пределах 6,2-6,3 высевают глубинно нл две параллельные 25 стерильные чашки Петри и заливают мясо-пептонным агаром с 0,57. глюкозы и

0,57,.сахарозы. Чл!1!ки выдерживают в

О термостате при 28 С в течение 3-4 сут

Отсутствие колоний микроорганизмов на 30

ИПА в чагпсах свидетельствует о стерильности среды. Питательную среду после проверки на стерильность засевают культурой штамма, который для этой цели выращивают до 10-15-дневно35 го возраста на скошенной агаризованной люпиновой среде в пробирках.

Бактериальной суспензией из одной пробирки засевают одну колбу с 200 мл среды. Для этого в пробирку с культу- 40 рой стерильной пипеткой добавляют

5 мл стерильной среды, осторожно снимают бактериальный слой, затем бактериальную суспензия пипеткой переносят в колбу с питательной средой. После 45 этого культуру выращивают в колбах при 28 C на качалке с 210 об/мин.в течение 5 сут. Полученный в результате культивирования продукт — суспензия клубеньковых бактерий люпина штам- 50 ма 1i 1622 содержит 1,5-3,0 млрд жизне— способных клеток в 1 мл, ее используют в качестве инокулянта семян.

Пример 1. Использование бактериального препарата под липин. 55

Иикрополевые опыты по изучению эффективности штамма Bradyrhizobium lupini 1!- 1622 проводят на почвах — дерново-подзолистой, супесчаной, площадь

31 6 делянок 50 м, повторность 3-4-крлтная. Посев проводят широкорядным cnciсобом. Применение уд! брений, пестицидов: Р6 К о, обработка посевл симазибо ном до появления всходов 1 кг/га и после появления всходов 1,0 кг/-,а.

Семена ляпина нлклнуне посева блктеризуют суспензней штамма следующю! образом.

Для обр ботки семян берут такой . объем суспензии культуры, который после рлзблв".ения водой до 1,5 л к-!еет общин титр 400 млрд жизнеспособных клеток (266 млн/мл). Тако!! титр иuокуляма соответствует титру клубеньковых бактерий в промьш!ленных преплр !тах (ризоторфин) для обработки ОднОЙ ? ектлрной нормы высеваемых семян. Норма высевл семян люпинл в проведенных опытах 1,0 — 1,25 млн/га, количество наносимых нл семя ляпина клеток штамма 320-400 тыс.

Аналогичным образом культивируют и применяют в опытах известные культуры Rhizobium. lupini 1."- 363а и 373а, Учет урожая зеленой массы люпина про— водят в фазу массового цветения сплошным методом. Качество урожая определяют по процентному содержанию протеина в зеленой массе растений.

Результаты определения симбиотической эффективности штамма Bradyrhizobium lupini 11 1622 в полевь|х опытах приведены в табл. ) .

Как видно из табл, 1, штамм !"- 1622 ха рак те риз уе тся высокой эффек тив нов стью в проведенных 3-летних опытах.

1Цта!!ь! Р 1622 повьш!ает урожай зерна в среднем на 147. по сравнению с контролем (без бактеризации) и на ) 07. по с.равнения с Rh. lupini - 363а (26,1 ц/га при урожае 22,8 ц/га в контроле и 23,7 ц/гл — штамм Л 363л); содержание протеина в зерне увеличивает на 2,87 по сравнению с известным штаммом 363а.

П р и и е р 2. Влияние предпосевнvA бактеризлции семян люпина штаммом !622 на урожай и его качество изучают в производственных опытах на почвах — зерново-подзолистых, супесчаных. Вносят удобрения из расчета выноса урожаем PK. Блктеризацию семян проводят методом, Описанным в примере 1, Результаты применения Hradyrhozobium lupini - 1622 представлены в табл, 2 и 3.

1565831

Таблица 1

Опыт

Вариант опыта

Урожай зерна, ц/га рибавка1Содержа

Прибавка протеина, % рожая, ерна, % ние протеина в зерне, %

l8 0

38,3

689

38,8

40,9

718

798

11СР о,9<, P %

2,3

1,4

33,4

905

32,8

36,6

922

1146

НСРа,,5, ц/ra

Р, %

1,2

1„3

33,1

774

32,3

794!

34,7

951

НСРр,q>, ц/ra

p %

1,5

2,6

34,6

789 данные

Rh. lupini. Р 363а

34,2

23,7

811

26,1

37,0

965 всем опыTBM

Приведенные данные показывант, что прибавка урожая зеленой массы составляет в среднем 18% (562 ц/га при урожае от использования известного нтамма 482 ц/гa j и урожая семян — на 20%, Бактеризация семян липина штаммом р 1622 увеличивает содержание протеина в зеленой массе и зерне на 31% по

Контроль — без бактериз ации

Rh. 1upini Ф 363а 18, 5

5radyrhizobium 1пр3 — 19,5

ni - 1622

Контроль — без бакте- 27, 1 ризации

Rh. lupini 1- 363а 28,1

Bradyrhizobium 1цр1- 31,3

ni - 1622

Контроль — без бак те- 23,4 ризации )

Средние

Rhg lupini Ф 363а 24, 6

Bradyrhizobium lupini Р 162-? 27,4

Контроль — без б ак те- 22, 8 ризации

Вгайугп zobium lupini Р 1622 сравнению с нэвестньпм ютаммсм Внттсbium lupini !"- 363а.

Рмулаиз обретения

Штамм бактерий Bradyrhizobium lu

pini ВНИИСХМ !!р 1622 для получения бактериального препарата под гпопин.

Накопление про теина в зерне, кг/ra

1565831

Таблица 2

Урожай, ц/га Прибавка урожая, Ж

Опыт

Вариант опыта зеленой массы зерна зеленой зерна массы

Контроль - без бактеризации 439

Rh. lupini Р 363а 443

Bradyrhizobium lupini Р 1622 475

32

Контроль — без бактеризации 500

Rh. lupini Р 363а 52I

Bradyrhizobium lupini Р )622 650

28

Средние Контроль - без бак теризации 470 данные по Rh. 1 up i ni Р 363 а 482 всем Bradyrhizobium lupini Р 1622 562 опытам

102

120

Таблица 3 рибавка ротеина, й

Опыт

Накопление

Содержание протеина, 7

Вариант опыта протеина, кг/ra в зеленой масв зерн зеле- зерно и ном зеленой зермассой ном асой се

)0,8

37,3 474 354

10,6

11,7

10,0

10,2

37,7 489 256

10,4

10,4

Rh. lupini h» 363а

Bradyrhizobium hupi, ni Р 1622

ll,6

Средние данные по всем опытам

Контроль — без бактеризации

Rh. lupini ¹ 363a

Bradyrhizobium lupini Р 1622

Контроль — без бактериз ации

Rh. lupini Р 363а

Bradyrhizobium lupiп1 Р 1622

Контроль — без бактеризации

Rh. lupini № 3á3a

Bradyrhizobuim lupiп1 Р 1622

Контроль — без бактеризации

Rh. lupini Р 363а

Bradyrhizobium lupini Р 1622

Контроль — без бактеризации

9,5

l0,2

12,5

3,9

4,2

5,2

7,0

9,0

9,9

6.8

7,8

9,2

37,9 470 386 ) 9

40,4 556 505 17 43

36,9 — 144

36 8 - )54 — 7

39, 6 — 206 — 43

39 0 500 273

41,4 531 373 б 37

38, 7 501 502 2 18

4 l, 6 652 383 33 ° 49