Способ количественного определения 5-гидроксиизофлавонов
Изобретение касается аналитической химии, в частности количественного определения 5-гидроксиизофлавонов, может быть использовано в анализе лекарственных и кормовых трав. Цель - повышение точности и чувствительности анализа при сокращении его длительности. Анализ пробы ведут экстракцией и очисткой фенольных соединений, их хроматографическим разделением на закрепленном слое силикагеля и проявлением 5-гидроксиизофлавонов с помощью 40%-ного раствора эфирата BF 3. Затем проводят элюирование продукта концентрированной CH 3C(O)OH, содержащей 0,06 - 0,38 мл 40%-ного раствора BF 3 в диэтиловом эфире на 10 мл CH 3C(O)OH, и полученный элюат подвергают флуориметрированию. Эти условия повышают точность анализа в 4 - 6 раз, чувствительность в 2 - 3,5 раза при меньшем в 2,3 - 3,4 раза времени определения, чем в известном случае. 10 табл.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН ц9) (и) 1 57 щ) g G 01 N 30/94
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К A ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМ
ПРИ П(НТ СССР (21) 4412380/23-04 (22) 1 8.04.88 (46) 07.07.90. Бюл. У 25 (71) Украинский научно-исследовательский институт птицеводства (72) А,Д.Рошаль, В.И.Циновый и В.Д.Орлов (53) 543.54.42.07 (088.8) (56) Вгаззеиг Т., Angenote L. An aminoethanol. diphenylborate — PEG 400 .
mixture: An interesting reagent for
ЫачопоЫ determination. — J. Chromatogr. 1986, v. 351, У 2, р. 251.
Deddio W., Clark К.W. Biochanin
А and formononetin content in red
clover varieties at several maturity
stages. — Can. J. Plant Sci, 1968, ч. 48, В 2, р. 175.
Curnow D.Í,, 0estrogenic activity
of subterranean clover The isolation of genistein from subterranåàn
clover and methods of quantitative
estimation. — Biochem. J. 1954, v. 58, Р 2, р. 283.
Агаев Ф.Н ° и др. Динамика и рас .1 пределение фитоэстрогенов в наземных органах клевера лугового в онтогенезе. — Физиология и биохимия культурных растений, 1984, т. 16, Р 1, с. 46.
Изобретение относится к способу количественного определения 5-гидроксиизофпавонов, который может найти применение в анализе лекарственных и кормовых трав, галеновых препаратов, 2 (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 5-ГИДРОКСИИЗОФЛАВОНОВ (57) Изобретение касается аналитической химии, в частности количественного определения 5-гидроксиизофлавонов, может быть использовано в анализе лекарственных и кормовых трав. Цель повышение точности и чувствительности анализа при сокращении его длительг ности. Анализ пробы ведут экстракцией и очисткой фенольных соединений, их хроматографическим разделением на закрепленном слое силикагеля и проявлением 5-гидроксиизофлавонов с помощью 407-ного раствора эфирата ВР
Затем проводят элюирование продукта концентрированной СН С(О)ОН,содержащей 0,06 — 0,38 мл 407-ного раствора ВР. в диэтиловом эфире на 10 мл
СН С (О) ОН, и полученный элюат подвергают флуориметрированию. Эти условия повы- шают точность анализа в 4-6 раз,чувствительность в 2 — 3,5 раза при меньшем в 2,3 — 3,4 раза времени определения, чем в известном случае. 10 табл.
Цель изобретения — повышение точности и чувствительности определения и его ускорение.
Пример 1. Определение содержания биоханина А в клевере ладино.
1576859
Фиксированное растительное сырье высушивают, измельчают, отбирают на вески 10 г. Экстрагируют растительный материал 40-50 мл 90 -ного этанола на глицериновой или водяной бане, (t = 60-70 С) в колбе с обратным холодильником в течение 20-30 мин. Экстракт отделяют, а растительный материал снова заливают этанолом. Извлечение повторяют 4-5 раз, полученные экстракты объединяют, отфильтро .вывают и упаринают до водного остатка. Последний очищают в делительной воронке 5-6 порциями (по 50 мл) петролейного эфира до тех пор, пока ор ганическая фаза не станет бесцветной или слабо-желтой. Очищенный водный ,остаток упаривают на роторном вакуум ном исутарителе почти досуха, затем о гидролизуют его при нагревании (100 C) ! ! a течение 3 ч с 5-10 мл 10 -ной серной кислоты.
Агликоны фенольных соединений извлекают из гидролизата 5-6 порция 25 (, ми этилацетата. Этилацетатные экст,ракты объединяют, упаривают досуха, (:растворяют сумму фенольных соедине. ний в 5 мл метанола. Апиквоту 0,05 мл метанольного раствора наносят в ви де полосы на хроматоГрафическую плас,тину "Силуфол", предварительно очи щенную метаНолом и активированную при о
:нагревании в течение 30 мин при 120 С. Справа и слева от полосы фенольных соединений Наносят пятна меток-свидетелей (биоханина А) . Разделение проводят в камЕрах с насыщенной атмосферой в системе растворителей хлороформ + метанол + *вода(95-5-0,5), 40
По окончании разделения пластинку, сушат на воздухе 5-10 мин, затем опрыскивают 40 -ным раствором эфирата трифторида бора в диэтиловом эфире, Полоса, содержащая биоханин А, приобретает"в УФ-свете желто-зеленую флуоресценцию, в видимом свете, если изофлавона много, — светло-желтую окраску ° .
Флуоресцирующую в УФ-свете полосу очерчивают, соскребают силикагель с анализируемым веществом с хроматографической пластинки и заливают его
0,1 мм раствора эфирата BF> и 8 мл концентрированной уксусной кислоты.
Смесь периодически встряхивают в те- 55 чение 25 мин, отфильтровывают от адсорбента и флуориметрируют «Я 0, =
Г
254 нм, „ 0„ = 580 нм}.
Параллельно проводят аналогичные процедуры для получения стандартного и фонового растворов. Содержание 5гидроксиизофлавона опредепяют го формуле
У 11хСо Ф )(— Фср
Х = -------- x ---------, g Ф вЂ” Ф1, где Y — объем метанола для растворения суммы фенольных соедине.ний, мм;
М вЂ” молекулярная масса изофлавонов, г/моль;
С . — концентрация стандартного ра0 створа, моль/л;
g — навеска растительного материала, г;
Ф вЂ” флуоресценция исследуемого раствора;
Ф вЂ” флуоресценция стандартного раствора;
Ф вЂ” флуоресценция фонового раствора;
Х вЂ” содержание 5-гидрооксиизофлавона в растительном материале, мг/г.
Содержание биоханина А в клевере ладино составляет, мг/г: по известному способу — в листьях 1,360, в стеблях 1,331; по предлагаемому способу— в листьях 0,310, в стеблях 0,970.
Пример 2. Определение генистеина и софорикозида в сумме фенольных соединений из Софоры японской.
Сравнение точности предлагаемого способа и известного.
1О навесок, содержащих 0,7-0,9 r суммы фенольных соединений, и 10 таких же навесок с добавлением гени-. стеина в количестве 0,5 кг/г и софорикозида 1 мг/г растворяют в 10.мл метанола. 0,1 мл раствора наносят на хроматографическую пластинку вместе с метчиками 5-гидроксиизофлавонов.
Разделение проводят в системе растворителей хлороформ + метанол 75-25,.R генистеина 0,694+0,02., софорикозида
0,32t0,03. По окончании разделения опрыскивают пластинку раствором эфирата ВР, под УФ-светом очерчивают флуоресцирующие зоны и соскребают их с подложки. Элюирование проводят как в примере 1. Флуориметрируют с использованием стандартно"0 и фонового растворов (табл. 1 и 3).Параллельно проводят определение по известному способу с использованием спектрофотометрии (табл, 2 и 4).
1576859
При определении генистеина на хроматографической пластинке в зоне
К = 0,60-0,75 мало мешающих феноль1 ных соединений. Однако, вследствие невозможности полного удаления 5-гидроксиизофлавона, выход его в известном способе на 15,97 ниже, чем в предлагаемом, точность предлагаемого способа в 4,3 раза вышее.
При анализе софорико зида наблюдается большое количество мешающих фенольных соединений, что приводит в случае известного способа к завышению результатов (10,3 ). Точность предлагаемого способа в 6,4 раза выше, чем известного. Низкий выход внутреннего стандарта в известном способе объясняется одновременным влиянием двух факторов — большим количеством примесей и неполным удалением с пластинки анализируемого компонента.
Пример 3. Приготовление стандартного и внутреннего растворов сравнения.
0,1 0,2 мл раствора известной концентрации наносят на пластинку и подвергают хроматографическому разделе-, нию как в примерах I и 2. Элюирование и флуориметрию проводят так же, как для анализируемых растворов . Фоновый раствор приготавливают по указанной методике из чистого силикагеля, удаляемого с пластинки, с площади, примерно равной площади полос анализируемых на хроматограммах 5-гидроксиизофлавонов ..Использование фоновых растворов необходимо на однолучевых флуориметрах. В двулучевых приборах фоновые растворы использовать не нужно: флуоресценция фона учитывается автоматически.
Пример 4. Выбор реактива для идентификации 5 †гидроксиизофлавонов на хроматографических пластинках
"Силуфол".
Дня определения предела обнаружения проявляю цих реактивов растворы генистеина, наиболее часто встречающегося представителя 5-гидроксиизофлавонов, наносят на хроматографические пластинки в виде полос, содержащих 195, 100, 50, 40, 20, 10, 8, 5, 3 мкг.
Результаты определений представле; ны в табл. 5.
Из табл ° 5 видно, что эфират BF является наиболее чувствительным реактивом для идентификации 5-оксииэо20
55 фланонов, в частности его открынаеfl мый минимум" в 4 раза ниже, чем у резактива, используемого в известном способе. В случае идентификации гликозидов, например софорикозида, наблюдается дополнительное увеличение флуоресценции, вероятно, за счет реакции между эфиратом BF> и гликозидной частью молекул определяемых веществ.
Пример 5. Использование эфирата БР для количественного анализа
5-гидроксиизофлавонов.
5.1. Зависимость интенсивности флуоресценции от количества добавленного 407.-ного раствора эфирата три.фторида бора в диэтиловом эфире.
0,2 мп раствора генистеина (1 г/л) в метаноле приливают к 8 мл концентрированной уксусной кислоты (концентрация генистеина в полученной пробе
24,4 мкг/мл) . Затем к полученным таким образом пробам, добавляют различные объемы раствора эфирата ВР . Такие же количества реагента приливают к 8 мл уксусной кислоты, несодержащей изофлавона. Этот раствор используют в качестве фонового.- На основе проведенных исследований установлено, что оптимальное количество эфирата
BF> 0,05 — 0,3 мл на 8 мл уксусной кислоты (0,0б — 0,38 мл на 10 мл кислоты).
Данные приведены в табл . 6.
5.2. Устойчивость флуоресцирующего комплекса во временй.
Готовят флуоресцирующий раствор, состоящий иэ 8 мл концентрированной уксусной кислоты, 0,1 мл раствора эфирата BF и 0,2 мп раствора генистеина в уксусной кислоте, несодержа— щий эфирата BF . Стрелку флуориметра устанавливают на значение I00X и измеряют зависимость флуоресценции от времени.
Из табл . 7 следует, что в течение
30 — 35 мин флуоресценция раствора не изменяется. За это время в процессе анализа 5-гидроксиизофлавоны элюируют с адсорбента, фильтруют элюат и измеряют его флуоресценпию.
5.3. Зависимость интенсивности фпуоресценции от концентрации генистеина.
В раствор, содержащий 8 мп уксусной кислоты и 0,1 мл эфирата ВР, добавляют 0,2; 0,1; 0,05; 0,02; 0,005 мп раствора генистеина в метаноле
1576859 шийся тем, что, с целью повыше-.. ния точности и чувствительности определения и его ускорения, проявление проводят 40Х-ным раствором эфирата трифторида бора в диэтиловом эфире, в качестве элюента используют концентрированную уксусную кислоту, содержащую 0,06-0,38 мп 40Х-ного раствора эфирата трифторида бора в диэтиловом эфире на 10 мл кислоты, и полученный элюат подвергают флуориметрированию. пользованием экстракции в 2,3-3,4 ра— за) меньше, чем в известном.
Формула изобретения.
Способ количественного определения
5-гидроксиизофлавонов, включающий экстракцию и очистку фенольных соединений, их хроматографическое разделе - 1О ние на закрепленном слое силикагеля, проявление 5-гидроксиизофлавонов, элюирование их.из силикагеля органическим растворителем, о .т л и ч а юI
Таблица I
> !
Ф -Фе — - — тФе Фу д (>
Фх-Фе
Фс Фу
Внутренний станВыход внутреннего х, х< дарт> мг/г стандарта> Х
0,778 0>225
0,830 0,238
0,844 0,248
0,840 0,244
0,872 0,254
0 855 0 247
0,84! 0,254
0,852 0 262
0,831 0,241
О, 859 0>256
0,5
П р и м е ч а н и е. Дисперсия 0,069, коэффициент вариации 4,40Х.
Таблица 2
Внутренний стандарт,мг/г х, Выход внутренх, А< него стандарта, Х
4,24 ф 0,80 0,5
П р н м е ч а н и е. Дисперсия 0,758> коэффициент вариации 18,0Х.
0,756
0,934
0,773
0,906
0,821
0,917
0,764
0,847
0,853
0,853
О, 934.
0,917
0,773
0,82!
° 0,906
0,764
0,847
0>853
0,756
0>853
О, 1 99
О, 245
О, 242
О, 237
0,220
0,220
О, !99 О, 232
О, 225
О, 232
О, 364
0,313
О, 214
О, 255
0,303
О, 275
О, 198
О> 195
О, 105
О, 220
4,94
4,94
5,90
4,91
5,04 5,04 3 0,15
4,5!
4,89
5,16
4,97
5 13
4,64
4,67
3>30
3,70
3,98
4,29
2,78
2,72
1,65
2,79
0>830
0,844
0,840
0,872
0,855
0,841
0,852
0,831
О, 859.
0> 778
0,296
0,270
О, 281
0,272
0,281
0>252
0,280
0,271
0,212
0,215
5,45
5,40
5,53
5,46
5,47 5,53+0,09 98
5,42
5,67
5,79
5>45
5,62.
5,31
4,76
4,98
4,64
4,89 4,66 1 0,33 84
4,46
4,89
4,86
3,67
4,11
1576859
Таблица3!
Е фс фу
ll a Ф1>-Ф Р фс фт хэ хь
Внутрен2 ни!! стандарт, мг/г
Вмкод внутреннего стандар-. та, 2
0,934 3, 750
О, 764 3,017
0,906 3,600
0,773 3,016
0,847 3,450
0,756 3,!00
0 853 3,550
0,917 3,767
0,821 3,300
0,853 3,483
О, 830
0,844
0,840
0,874
78,72+1,10 1,0 0,855
0>778
0,841
0>852
0,831
0,859
Il р и м е ч а и и е. Дисперсия 2,058, коэффициент вариации 1,8Х.
Та блица 4 хе х, к х
В61код внутреннего стандарта> 7.
Внутренний
А„ стандарт, мг/г
78,43
97, 22
94, 29
89, 39
72,58 86,8616> 43
83,57
87,51
81,56
102,32
81,74
1,0
87 261 5 69 40
П р и м е ч а н н е. Дисперсия 74,21, коэффициент вариации 11,5Х. Оптическую плотность определяют раэбавлением фотометрируемого раствора в
l0 раэ. Таблица 5
Способ идентификации Условия наблюдения и наблю даемый признак
ОткрываеMblH MHHH
Стандартный о ткр ыв а емый минимум, мкг/cM
M3>ì В по лосе,мкг
Визуальная идентификация . Го же
В УФ-свете (253 нм) темная не флуоресцирующая полоса
В УФ-свете (253 нм) в присутствии фенольных соединений клевера ладино
В видимом свете светло- ко— ричневая окраска
0,9
20-40
1,8-3>6
Самопроявление под действием УФ-света в теиение 1 ч
Опрыскивание 0,1%ным FHC 1 5 H .1 !,>1 но!!>
Б видимом свете светло-коричневая окраска
0,917
0,773
0,934
0,821
0,906
0,764
0,847
0,853
0,756
0,853
4,90
5,12
6,00
5,00
4,48
4,35
5>05
4,74
5,27
4,78
78, 36
77>06
77,55
76,17
78,49
80,03
81>22
80,17
78,45
79, 69
0,830
0,844
0,840
0,872
0,855
0,778
0,841
0,852
0,831
0,859
3,400
3,500
3,383
3,567
3,533
3,183
3,450
3,400
3,350
3,533
4,12
5>29
5,35
4,48
4,99
4,31
5,68
5,41
4,8!
4,98
79,94
80,93
78, 61
79,83
80,66 79,69+0>92 97
79,85
80,06
77,88
78,68
80,28
73>40
92,68
94,17
88,86
86,30
80,87
99,86
93,89
85,59
86,63
1576859
I,ðoäoëæåHèå табл. 5
Опрыскивание 0,17.— ным ZrOC1 в метаноле
В УФ-свете желто-зеленая флуоре сценция
40-50
3,6-4,5
4,5
Опрыскивание 0,17ным ZrOC1 в метаноле
В видимом свете светло-желтая окраска
В УФ-свете (253 нм) желтая флуоресценция
4,5-9,0
50-100
Опрыскивание 0,57.-ным
А1С1 в метаноле .
1,8
В видимом свете красно-коричневая окраска
Опрыскивание раствором диазосульфаниловой кислоты в 15%ном Na
В видимом свете желтая ок1,8
Опрыскивание смесью хлорсульфоновая кислота + хлороформ 4+1 раска
1,8-3,6
20-40
0,01 И йода в 0,025 M растворе К3 в воде
В видимом свете коричневая или желтовато-коричневая окраска
Опрыскивание 17-ным В УФ вЂ све (360 нм) желтая дифенилборным эфиром флуоресценция аминоэтанола и 57.-ным
0,9-1,8
10-20 полиэтиленгликолем
400 в метаноле
1,8-3,6
20-40
В видимом свете светло-желтая окраска
0,3-0 5
В УФ-свете (253 нм) яркая . 3-5 желто-зеленая флуоресценция
Таблица 6
Количество, мл, раствора эфирара BF на 8 мл уксусной кислоты
То же, на 10 мл уксусной кислоты
Интенсивность флуоресцен †. ции: в абс. единицах в 7.
Т а блица 7
30 35 40 45
1 5 10 15 20
Время, мин
Интенсивность флуоресценции, %
100,0 100,0 100,0 100,0 100 O 100,0 97,8 94,4 93,3
Опрыскивание 40%-ным раствором зфирата
ВЕэ в диэтиловом эфире
То же
0,00 0,03 0,05 0,20 0,30 0,40 0,50 1,00
0,00 0.,04 0,06 0 25 0,38 0 50 0,63 1,25
3 15 35 35 35 34 34 29
8,6 42,8 100,0 100 0 100,0 97,1 97,1 82,4
1576859
Таблица 8
0103755738291100
0,0 10,0 13,0 20,0 28,0 35,0 35,5
0,0 28,5 37,) 57,1 80,,0 100,0 100,0
Таблица 9
25,7
44,4
Таблица 10!!родолжительность, мин, по способу
Условия проведения операции
Операция известному предлагаемому
Экстракция н очистка экс- Экстракция на водяной трактов, бане, с 70 с
270-450
450
Разбавление сумею фенольнюх соединенЫ1
Хроматографнческое разделение
30
10
Сушка и проявление
Элюирование
720
Фильтр — синяя илн желтая лента 10
Фильтрование
Фотометрирование
Собственно анализ
785
Анализ + экстракция и очистка фенольных соединений 1230
355-535
При определении гликоэидов стадия тидролиэа отсутствует.
Составитель С.Хованская
Редактор И.Горная Техред М.яндык Корректор О. Кравцова
Заказ 1845 Тираж 498. Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101
Соотношение СН СООН:CH OB
Флуоресценция анализируемо"o раствора
Х извлечения вещества
Время элюнрования
Генистеин (агликоя) извлечение, Х
Софорикоэид, (! лнкоэид) извлечение, Й
Удаление адсорбента с хроматографической пластинки и перемешивание с элюентом
10 15 20 25 30
48,5 60,0 82,8 100,0 100,0
61, 1 72 2 83 3 100 О 100 О
Камера для ТСХ, хромато-. графические пластинки
"Силуфолч
В известном способе спект- 5 рофотометр СФ-16, в предлаг гаемом способе флуориметр
ЭФ-ЗМА
