Ингибитор фермента моноаминооксидазы

 

Изобретение относится к биологическим активным соединениям, а именно к бензилиденаминоэтанолам общей формулы (X) C 6H 4CH=NCH 2CH 2OH, где X - M - NO 2 (I), P - NO 2(II), P - N(CH 3) 2(III), в качестве ингибиторов фермента моноаминооксидазы. Цель изобретения - выявление соединения ряда оснований шиффа, имеющего N - β - оксиэтильную группу и обладающего повышенной ингибирующей активностью по отношению к моноаминооксидазе и низкой токсичностью. На разных видах животных (белые мыши, крысы, бык, глухарь) показано, что соединение I-III являются эффективными ингибиторами дезаминирования серотонина и бензиламина в печени и мозге в опытах IN VIVO и IN VITRO. Эффективность ингибирования достигает 85% при концентрации 13 мкМ. На примере препарата I показано, что ЛД 50 составляет 1563 мг/кг, т.е.препарат является малотоксичным. Соединения могут найти применение в медицине в качестве антидепрессантов. 5 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

125 А1 (19) (1!) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

CH=NCH ÑH 0Н

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21 ) 4415213/31-13 (22 ) 11.02. 88 (46) 15.07.90. Бкл. № 26 (71) Тюменский государственный университет (72) З.П.Гуреева и М. К.Беляцкий (53) 577.15 (088.8) (56) Гилев А.П., Терехина А.И., Тарасова Э.И., Гуреева 3.П. Фармакологические исследования ниаламида. — Фармакология и токсикология, 1967, ¹ 3, с, 328-331.

Гуреева З,П. Специфические свойства ниаламида как ингибитора моноаминооксидаэы, — Фармакслогия и токсикслогия, 1981, ¹ 5, с. 639-640. (54 ) ИНГИБИТОР ФЕРМЕНТА МОНОАМИНООКСИДАЗЫ (57) Изобретение относится к биологически активным соединениям, а именно к бенэилиденаминоэтанслам общей формулы (Х) С<Н СН = 11СН.,СН. ОН. гпе

Изобретение относится к биологически активным соединениям, а именно к бензилиденаминоэ танолам общей формулы где Х вЂ” М вЂ” ИО, {i); и ИО, (II);

° — N{CH ), (III), Цель изобр е тения — выявл ение с оединения ряда оснований Шиффа, имеющего N — р -оксиэтильную группу и обладающего повышеннои ингибирующей активностью по отношении к моноаминоок(51)5 С 07 С 251/02, С 12 N 9/04

Х вЂ” m — NO < (I), p — NO > (II ), р1(СНэ) (Ш), в качестве ингибиторов фермента моноаминооксидазы. Цель изобретения — выявление соединения ряда оснований Шиффа, имеющего N—

8-оксиэтильную группу и обладающего повышенной ингибирующей активностью по отношению к моноаминооксидазе и низкой токсичностью. На разных видах животных (белые мыши, крысы, бык,глухарь ) показано, что соединения (I ) (III) являются эффективными ингибиторами деэаминирования серотонина и бензиламина в печени и мозге в опытах

in vivo u in vitro. Эффективность ингибирования достигает 85K при концентрации 13 мкМ. На примере препарата {Х) показано, что ЛД составляет

Ео

1563 мг/кг, т. е. препарат является мало токсичным. Соединения могут найти применение в медицине в качестве антидепр ес сантов ..6 табл. сидаэе. и низкой токсичностью. В качестве ингибитора моноаминоокеидазы испсльзуют эамещенные N-.áåíçèëèäåíàìèíîэтанолы, синтез которых осуществляется в одной стадии с использованием коммерчески доступных исходных соеди нений.

Изобретение иллюстрируется пример ами, Пример 1. 2-(уа-Нитробензилиден ) аминоэтанол (I ) .

Получен кипячением 30,5 г (0,5 моль) моноэтаноламина, 75,5 r (0,5 моль ),р --нитробензальдегида, 1 г п-толуолсульфокислоты (каталиэаСерия 1, Берут свежий или свежезамороженный кусочек ткани печени быка, промывают ее холодной дистиллированной водой от крови, просушивают между листами фильтровальной бумаги, отвянивают на технических весах навеску, например 5 r которую затем помещают в чашку Петри, стоящую .на льду, измельчают навеску ножницами и кусочки ткани печени помещают в охлаждаемый льдом гомогенизатор типа

МР-302, в который, кроме того, доливают двойное количество 0,2 М фосфатного буфера рН 7,4, т.е. 10 мл. Гомогенизируют печень в фосфатном буфере 1,5 мин на холоду. Полученный гомогенат разливают в 3 круглодонные склянки на 50 мл. Одна склянка служит в качестве холостой, вторая - контрольной, третья — опытной, В каждую склянку приливают по 1 мл фосфатно-. го буфера и по l мп гомогената.Кроме того, в контрольную и опытную склян4J ки добавляют субстрат — серотонин в виде креатинин сульфата 3,2 мг или бензиламин гидрохпорид 5,7 мг. В опытную склянку в отличие от конт- .. ральной добавляют ингибитор, раствор которого готовят следующим образом:

2,5 мг препарата — ингибитор а (Х ), (II) или (III) растворяют в 1 мл фосфатного буфера, берут 0,1 wt этого раствора и помещают в пробы,названные выше опытными. Для получения концентрации ингибитора в 10 раз меньшей навеску ингибитора на аналитических весах 2,5 мг растворяют в

10 мп фосфатного буфера, В холостую и контрольную пробы добавляют фосфатвый буфер в количестве 0,1 мл для выравнивания объемов так, что конечный объем в пробах составляет 2,1 мп.

Все склянки помещают в аппарат

Варбурга, где они BcTpRZBBBIQTcH npu

38 С в течение 50 мин. Затем белки в пробах осаждают 2 мп 24%.-ной хлорной кислоты, центрифугируют и 0,2 мл надосадочной яядкости используют для анализа аммиака по методу Конвея.Из каждой пробы переносят по 0Ä2 мл супернатанта во внешнюю часть трех чашек Конвея, Серия 2. После приливания 0,2 мл супернатанта во внешнюю часть. чашек

Конвея в противоположный конец наливают 10 -ный раствор едкого натрия, В центральной части чашек Конвея заранее наливают 0,001 н. раствор

3 ) 5781 25 тор) в 200 мл толуола с азеотропной отгонкой воды. Кристаллическую массу, образующуюся по охлаждении реакционной смеси, перекристаллизовывают из толуола. Получают 80,0 г (82,0 ) соединения (Х).

Желтоватые кристаллы с т.пл. 69

71 С.

Найдено,7: С .55,30; 55,41; Н 5,01; 10

5,23; N 14,22 14,38.

С,Н „Ы,о,.

Вычислено, С 55,67; Н 5,19; N 14,42.

ИК-спектр, 11,см - : 34 (-ОН связ. )g5

1660 (С = 11), 1360 (снм. NO ).

Пример 2. 2-(и-Нитробензилиден ) аминоэтанол (ХХ ) .

Получен аналогично примеру 1 из

11,0 г (0,18 моль) моноэтаноламина, 20

27,2 r (0,18 моль) и-нитробензапьдегида, 0,5 г и-толуолсульфокислоты в

100 мл толуола. Выход 18,0 г (51,5 ).

Желтоватые- игольчатые кристаллы с т.пл. 80 — 82 С. 25

Найдено, : С 55,55; 55,07; Н 5,12;

508; N1430; 1435.

СзН goNgO3

Вычислено, С 55,67; H 5,19;

N 14 42. 30

ПМР-спектр, с, м.д.: 2,60 (1 Н, ОН); 3,86 т (2 Н, СН Ы); 3,98 т (2 Н, СН О), 7 88 8 32 к (4 Н, п-С Н ), 8,45 с (1 Н, CH=N).

Пример 3, 2-(и-Диметиламинобензилиден)аминоэтанол (III).

Получен аналогично примеру 1 из

30,5 r (0,5 моль) моноэтаноламина, 44,6 г (0,5 моль ) n-диметиламинобензальдегида, 1 г и-толуолсульфокисло- 40

m в 150 мл толуола, Выход 78,8 r (82,0 .).

Темно-кремовые кристаплы с т.пл, 105 — 106 С.

Найдено,%: С 68,42; 68,66; H 8,31;g5

8э11; 1Ч 14,29; 14,57 °

С,1 Н 1 1 0

Вычислено, . С 68,72; Н 8,39;

М 14,57, ПМР-спектр, о", м.д,, 2,92 с (6 Н,>0 (СН з) j, 3,64 т (2 Н, СН И),3,84 т (2 Н, СН О), 4,38 с (1 Н, ОН), 6,59 — 7,61 к (4 Н, п-С К ), 8,10 с (1 Н, СН вЂ” И).

Пример 4. Исследование прейа-g5 ратов (I) (II) (III) на окислительное дезаминирование серотонина и бензиламина в гомогенатах печени крупного рогатого скота в опытах.

5 15 соляной кислоты. Чашки закрывают герметически стеклом, перемешивают содержимое из внешней части и оставляют до утра следующего дня: на 18- ч, при комнатной температуре. Потом открывают чашки и титруют остаток соляной кислоты, не связавшийся с аммиаком, 0,001 н. раствором едкого натрия в присутствии смешанного ин", дикатора: на 2 части 0,17-ного раствора метиленового красного 1 часть

0,1Е-ного раствора метиленового синего. Расчет производят по формуле: (а — в) ° 10, где а — количество едкого натрия, пошедшего на титрование холостой пробы, мп; в — количество едкого натрия, пошедшего на титрование контрольной или опытной проб,мп.

Разницу умножают на 10 чтобы учесть разведение и пересчитывают на 100 мг сухого гомогената ткани печени.

Чтобы получить сухой гомогенат ткани органа, в предварительно взвешенный бюкс помещают 1 мп гомогената, приготовленного так, как описано вьппе. Незакрытый бюкс ставят в сушильный шкаф и высушивают гомогенат при 80 С до постоянного веса. Сухой ткани в бюксе оказывается 50

80 мг, но результат, полученный после титрования в мкмаль аммиака рассчитывают на 100 мг веса сухого гомог ената.

В контрольной пробе с субстратом серотонином аммиака выделилось

9,8 мкмапь на 100 мг сухого гомогената ткани печени быка, а в опытной пробе (с ингибитором) в присутст-. вии препарата (I) значительно меньше: 4,9 мкмоль аммиака на 100 мг сухого гомогената ткани, Процент ингибирования, следовательно, составляет 502 (см. табл.1).

Аналогично проведены опыты с препаратами Б-2 и Б-3. Судя по снижению количества выделившегося аммиака в опытных пробах по сравнению с контрольными ингибирование дезаминирования серотонина высокое 43,9

92,97..

Если вместо серотонина в аналогичных опытах берется субстрат бензиламин, то при добавлении препаратов (I), (II) и (III) в опытные пробы также наблюдается- уменьшение дезаминирования бензиламина, и процент ингибирования с дозой 1,3 10 М находится в пределах 55,5 — 76,3Ж, 1О

Пример 5. Исследование влияния диализа на торможение дезаминирования серотонина в гомогенатах печени быка в присутствии ингибиторов (I), (II) и (III).

Берут гомогенат, приготовленный, как описано в примере 4, серия 1, наливают 1 мп его в пеницилиновую склянку, куда также добавляют по

О,! мл ингибитора (концентрация 1,3 х х 10 M) . Отверстие в склянке завязывают целлофаном. Склянку укрепляют вверх дном в сосуде, заполненном

0,2 M раствором фосфатного буфера, и помещают этот сосуд в холодипьник.

Буферный раствор в склянке время от времени меняют свежими порциями охлажденного фосфатного буфера. Через

2 сут вынимают склянки и их содержимое центрифугируют на холоду (не выше 4 С). К осадку гомогената добаво ляют 1 мл фосфатного буфера, субстрат серотонин и пробы инкубируют как описано в примере 4, серия 1. В аналогичных условиях 2 сут в процессе диализа находится гомогенат, который затем идет на холостые и контрольные опыты. В итоге сравнивают, сколько аммиака выделяется в диализируемых пробах с ингибиторами и без ингибиторов и пересчитывают на 100 мг веса.

Найдено: в контроле 4,7+0,1 мкмоль аммиака на 100 мг веса ткани, в опыте с ингибиторами; (I) — 0,2+

+ 0,03 мкмоль, (II) — 2,5+0,2 мкмопь, (III) — 1,6 + 0,2 на 100 мг веса сухой ткани гомогената. Процент ингибирования после диализа составляет соответственно 47, 3; 46,8; 66,0 7. (табл.2) . Следовательно, икгибирование дезаминирования серотонина в гомогенатах печени быка сохраняется и после диализа, так как восстановление активности дезаминирующего фермента не происходит (табл. 2 ) .

Пример 6. Исследование влияния препаратов (I) (II) (III) и ниаламида на окислительное дезаминирование серотонина и бензиламина в гомогенатах печени глухаря, 78) 25 6 но в концентрации 1,3 10-<М препараты I u III не эффективны как ингибиторы деэаминирования бенэиламина, и .процент ингибирования — от .0 до б,бЕ. Тогда как препарат II — структурный изомер (I) — и в меньшей концентр ации активно тормозит дезаминирование бензиламина: на 58,47.

1578125

В аналогичных условиях, которые описаны в примере 4, исследовано деэаминиров ание 6ензиламина (табл. 3 ) и серотонина (табл.4) в гомогенатах печени глухаря в присутствии препаратов (I), (II), (Ш) и ниаламида.

Последний взят для сравнения как изв е с тный и нгиби тор м оно ам и но оксид азы, дезаминирующей серотонин и бензиламин. Опыты проведены in у го также, как с гомогенатами печени быка (приер 4). Ниаламид вносится в пробы едующим образом: 3,9 мг растворяЦт в 1 мп фосфатного буфера или в

10 мп в.зависимости от применяемой концентрации и помещают в склянки по 0,1 мл, Результаты приведены в табл. 3 и

4. Все три препарата (I) (II) (III) 20

В каждой из исследованных концентраций у гнет ают дез аминир он ание с ер от онина и бензиламина. Эффект ингибирования не является зависимым пропорционально концентрации препаратов. 25

Яаиболее активно соединение (Ш), которое угнетает дезаминирование серототина на 65 %, а бензиламина— на 85 %. Практически такими же по эффективности являются соединения

Б-1 и Б-2. Они угнетают цезаминироВание бензиламина на 64 — 83%. Все три препарата (Х), (II) и (Ш)

Проявляют большой ингибирующий эффект в отношении дезаминирования бен- 35 зиламина в печени птиц по сравнению с серотонином. Особенно это характерно для препарата (ТХХ), который в обеих иаследованных концентрациях тормозит дезаминирование сер отонина на

83 — 85%.

Пример 7. Исследование влияния препарата и-нитробензилиденамино— этанала (Б-2) на дезамивирование серотонина в гомогенатах печени и мозга мышей.

Серия 1. Препарат п-нитробензилиденаминоэтанол (II) вводится в дозе

200 мг/кг, составляющей 7,8 от суточП 50 дпя негО ° NbHIIH вз яты MsccoH 50 тела 19 — 23 г. Поэтому, например, мьппи с массой тела 19 r получали

3,8 мг, а с массой тела 23 г — 4,6 мг пр епар ата в нутрибрюшинно, р ас творенного В 1 мп дистиллированной Воде, Контрольным машам одновременно вводят дистиллированную воду также в количестве 1 мл. Через 18 ч после введения препаратов и воды мьппей забивают декапитированием. Немедленно на холоду извлекают мозг и печень.

Затем из тканей этих органов получают гомогенаты, которые проводят через все процедуры, предусмотренные методикой и описанные в примере 4.

Результаты приведены в табл.5.

В пробах с гомогенатами печени опытных мышей выделяется аммиака

0,34 мкмоль, а в контрольных "

5,5 мкмоль аммиака на 100 мг веса сухой ткани гомогената. В пробах с гомогенатами мозга с препаратом Б-2 найдено 1,7 MKMQJIh а в контрольных—

16,2 мкмопь, что составляет 907торможения дезаминирования серототина.

Серия 2. Исследование влияния препарата Б-2 на 5-окситриптофановый (5-ОТФ ) гиперкинеэе. Берут контрольных и опытных мышей массой тела 6—

25 r и всем вводят 5-ОТФ 50 мг/кг внутрибрюшинно, Опытные отличаются от контрольных тем, что за 2 ч до

5-ОТФ получали препарат Б-2 в дозе

200 мг/кг массы тела, Через 15 м н после введения 5-ОТФ подсчитывают количество в стряхивающих движений головой у мышей в опыте и контроле.

Количество в стряхивающих движений головой у мышей в контроле в среднем на 1 мышь (из 50) составляет

0,6, т. е. не все мьппи в ответ на введение 5-ОТФ производят движение головой, У опытных мышей эффект 5-ОТФ значительно потенциирует и составляет в среднем 11,6 движений на 1 мышь из трех. Следовательно, препарат

Б-2 предотвращает разрушение серотонина в мозге, который образуется от

5-ОТФ in vivo.

Пример 8. Определение токсичности препарата на примере препарата (I). Препарат суспензируют в крахмальном клейстере и вводят мьппам рег os шприцем с инъекционной иглой с булавовидным утолщением на конце, Варьируют дозы 1000 — 2500 мг/кг в сериях из 8 мьппей.

Результат: ЛД п препарата (I) составляет 1563 мг/кг, т.е. препарат является нетоксичным.

Формула из обр ет ения

Применение замещенных бензилиденаминоэтанолов общей формулы

9 (Х) С,Н.CF = ИСН,СН,ОН где X — m-ИО, Р-N0z и р-11(СН з) г

1578125 10 в качестве ингибиторов Фермента моноаминооксидазы. л

Таблица1

Влияние препарата на окислительное дезаминирование серотонина и бензиламина в гомогенатах печени крупного рогатого скота

7 ннгибирования

Ж ингиби- Субстрат бенрования зиламин, мкмапь аммиака

Субстрат серотонин,мкмопь аммиака

Пр епа- Концентрация р ат пр.епар ата,М

3 05++ —.2

55,5

6,85+ 0,8

49+1 2 х = л, 50,0

9,8 +0,3

1,3 х 10 5

6 4t.0 3

А Л. 6,6

6,85 + 0,8

5 1+Π28 — — 48,0

9,8-+ 0,30

1,3 х 10

1,3 х 10

1 60+1 1 — А — —;-а — -- 76, 3

6,85+ 0,8

3 О+О 15

А: А 69,4

9,8 +0,30

5 5 0 19 а 43,9

9,8+ 0,30

2 85+1 4

«2. = 2. 58,4

6,85 + 0,8

1,3 х 10 6

2 60 + 1 05 х = ь 62,0

6,85 + 0,8

III 1 3 х10

-5 07203

92 9

9,8+0,3

1,3 х10

8 50+1 8

-ь- = я

0,0

6,85 0,8

1 4+00 т =«т

85,5

9,8 +0,3 х 10 М. Над чертой— чертой — контроль значения М > щ i

П р и м е ч а н и е. Концентрация субстратов — 4 опыты с ингибитором, а под (без ингибитора) . Приведены

n = 3 — 5 опытов™ и = 2, Таблица 2

Влияние диализа на окислительное дезаминирование серотонина гомогенатами печени быка в присутствии ингибиторов

ИнгибиДезаминирование серотина,мкмоль 7 торы

1,3х10 М с препаратами контроль

П р и м е ч а н и е. Приведены средние величины

M+m; количество опытов равно 3.

II

I II

4,7+ 0,1

4,7+ 0,01

4,7+0,1

2,0 Й 0,03

2,5 10,2

1,6 + 0,02

7 ингибирования после диапиза

47,5

46,8

66,0

15 78125

ТаблицаЗ

Влияние препаратов на разрушение бенэиламина гомогенатами печени глухаря (Tetrao urogallus) Препа- Концентрация,M Угнетение активности моноаминоксират дазы

Ж мкмоль

3 72+0 04 т

1,3 х 10 мид

44,78+ 0,64

6,71+ 0,01

3 62+0 08 т 2.

1,3х10

46,06 0,42

6,71 + 0,01

2 410 03

1,3 х 10

64,24 0,52 т г.

6,7 + 0,04

2 35+0 08

2. т

6,71 + 0,04

) 3x10

1,3 х 10

64,9830,98

2т4 - 0 01

64,24> 0,41

6,71 + 0,04

1 28+0 10

1,3 х 10

80,93+ 0,60

6,71 + 0,04

1х08+ О 09

-6

III 1,3 х 10

83 91+ 0,4Э

6,71 0,04

1 10+0 02

Л. .2.

85,10 < 0,51

III 1,3 х lO

6,71+ 0,04

Влияние препаратов на разрушение серотонина гомогенатами печени глухаря (Tetrao urogallus) Препа Концентрация, Угнетение активности моноаминооксидаэы рат М

1 мк моль !7

4 3+ О 03

1,3 х 1О

21,82 0,67

5,5 0,04

3 0 + 0 009

1,3 х 10 5

45,46 0,91

5,5 0,04

1 6+0 04

1,3х10

60,00+ 0,72

Х

4,0 + 0,07

1 4 0 04

1,3 х 105

65,00 + 0,80

4,0 + 0,07

П р и м е ч а н и е, Приведены средние значения M+m,âûðàæàþ— щие с теп е нь то рможе ния ра э руше ни я с уб с трата под влиянием препарата (над чертой) по сравнению с контролем (под чертой). Количество опытов 3. !

Таблица4!

1578125

Продолжение табл.4

Прела Концентрация, рат М мк моль

1,3 х10

2 4+О 01 л.

4,4+0,01

55,56 > 0,69

1,3 х 10-5

2 2i001

Л. А

5,4 +0,09

59,26+ 0,74

III 1,3 х 10 4тО 0 02

5,6+ 0,03

28,58 . 0,42

III 1,3 х 10, — — +-- ——

3 5+0 01

5,6 +0,03

37,50 + 0,50

Таблица 5

Влияние препарата (II) на дезаминирование серотонина в гомогенатах печени и мозга мышей в опытах in vivo через

18 ч после введения в дозе 200 мг/кг внутрибрюшинно

Разрушение серотонина,мкмоль на 100 мг сухого гомогената, и его угнетение,. Х: М+ш в мозге

Опыт онтроль 7. угнетения Опыт Контроль Х угнетения

0,34+0,2 и = 85,5+ 0,2 и = 3

5-ОТФ (контроль) 5-ОТФ + препарат (II ) 11,6 + 0,7 и = 3

0,6+ 0,06

n50

Составитель А.Семенов

Техред Л.Сердюкова

КоРРектоР Т, Малец

Редак тор Т. Лаз оренко

Заказ 1888 Тираж 336 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101 в печени к

Ъ

Угнетение активности моноамннооксидазы

94 ОЙО 15 1 7+О 7 16 2f 2 6 90 О+7 8

n=13 n=3

Таблиц а6

Влияние препарата (II) на 5-окситрипто рановый гиперкинез

Количество встряхивакхцих движений головой у мышей после введения

5-окситриптофана (50 мг/кг) и совместно с препаратам (200 мг/кг) внутрибрюшинно (М+ш)