Способ трансформации возбудителя чумы

 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к генетике возбудителя чумы. Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в том, что содержащими плазмиду PCAD трансформантами штамма, несущего хромосомальные признаки PGM + и PST<SP POS="POST">S</SP> (пигментсорбция и чувствительность к пестициду соответственно), заражают биопробное животное с последующим отбором клонов по признаку вирулентности.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИ Х

РЕСПУБЛИН (19) S (ill

А1 (51)5 С 12 N 15/63

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET

ПО И306РЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

1 (21) 4692040/30-13 (22) 18.05.89 (46) 07.10.90. Бюл. № 37 (71) Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" (72) В.В.Кутырев, А.А.Филиппов и О.А.Проценко (53) 577.2(048)(088.8) (56) Portnoy D.À. et al. Genetic analysis of essential plasmid determinants of pat1>ogeniticy in Yersinia

pestis. — J. Infect. Disease. 1983, v. 148, ¹ 2, р. 297-304.

Можаров О.Т. и др. Котрансформация как метод, облегчающий идентификацию собственных плазмид чумного микроба. — Природная очаговость и эпидемиология особо опасных инфекций, Саратов, 1983, с. 92-94 °

Изобретение относится к микробиологии, в частности к генетике возбудителя чумы, и может быть использовано для моделирования вирулентности чумного микроба с целью исследования роли плазмидных и хромосомных факторов в развитии инфекционного процесса при чуме и, следовательно, для выяснения генетических основ патогенности и иммуногенности возбудителя чумы.

Цель изобретения — упрощение способа.

В качестве генетического маркера, по выражению которого ведется отбор трансформантов,получивших плазмиду

2 (54) СПОСОБ ТРАНСФОРМАЩП! ВОЗБУДИТЕЛЯ УИЫ (5?) Изобретение относится к микробиологии, в частности к генетике возбудителя чумы. Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в том, что содержащими плазмиду pCad трансформантами штамма, несущего хромосомальные признаки Pgm и PstS (пигментсорбция и чувствительность к пестицину соответственно), заражают биопробное животное с последующим отбором клонов по признаку вирулентности.

РСад,используют вирулентность возбу-дителя чумы. Плазмида рСай не обладает удобным селектируемым маркером, но детерминирует синтез ряда факторов вирулентности (признак кальцийзависимости, синтез v — антигена и термоиндуцибельных белков внешней мембраны), которые в сочетании с хромосомт S

HblNH признаками Рят и Рз придают клеткам способность вызывать летальный инфекционный процесс. Поэтому совмещение этих признаков в одной клетке придает ей вирулентные свойства и, следовательно, позволяет отбирать трансформанты, получившие pCad, в организме чувствительного биопроб1597393

НОГО ЖИВОТНОГО Т+Е. В У"СЛОВИЯХ 1П

U 1UO °

I !

Составитель С.Бандрин

Техред М.Дидык - Корректор C.låêìàp

Редактор И.Дербак

Заказ 3032 Тираж 493 Подписное

ВН(ИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иасква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул . Гагарина, 101

Пример. ДНК нативной плазмиды

pCad (47 Nd) выделяют из моноплазмидного штамма ультрацептрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. Лвируле»тный бесплазмидный штамм 1О возбудителя чумы, несущий хромосомные маркеры PgTA u Pst „ выращивают на агаре Хоттингера (рН,2) в течение

18-24 ч при 28 С. Клетки дважды отмывают холодной дистиллированной водой и ресуспендируют в 0,1 -ной пептонной воде. Взвесь клеток смешивают с препаратом ДНК так,: что 1 мкг плазмидной ДНК приходится на 1 10 клеток рец шиента, и подвергают процедуре криотра»сформации путем заморажива»ия при — 195 С в течение 5 мин и оттаивания при 42 С в течение 2

10 мин. Смесь разбавляют равным объемом бульона Хотти»гера или LH (рН

7,2) и инкубируют В течение 1 ч при

28 С. Затем трансформационную смесь в объеме 0,2-0,5 мп вводят подкожно или внутрибрюшинно белым мышам или морским свинкам. После гибели биопробного животного, которая обычно наступает на 3-5 сут после заражения, производят вскрытие и прямой посев оргаНоВ методом отпечатков на агар Хоттингера (pH 7 2), содержащий генцианвио35 лет в конеч»ом разведении 1:200000 . в качестве и»гибитора посторонней микрофлоры.

Культура возбудителя чумы, выде- 40 ленная из органов павшей биопробы, в

100 . случаев представляет собой культуру трансформантов, получивших плазмиду pCad;

Таким образом, преимуществом предлагаемого способа трансформации возбудителя чумы плазмид»ой pCad является повышение эффективности получения трансформантов, несущих плазмиду

pCad, с 1,2-3,0 до 100 . Кроме того, предлагаемый способ проще известного за счет исключения ряда этапов, связанных с выделением и использова»ием

ДНК вспомогательной плазмиды, приготовлением селективных искусственных питательных сред, содержащих антибиотики, повторным отбором тра»сформантов, определением у них наследования неселектируемых фенотипических признаков плазмиды рСас! и:излечиванием от вспомогательной плазмиды. Следовательно, предлагаемый способ позволяет экономить питательные среды, химреактивы и антибиотики. Кроме того, снижается биологическая опасность для окружающей среды трансформантов возбудителя чумы, не обладающих устойчивостью к антибиотикам.

Формула и з обретения

Способ трансформации возбудителя чумы, Включающий выделение плазмид»ой

ДНК кальцийзависимости„ введение плазмидной ДНК в клетки реципиентного штамма в условиях замораживания-оттаивания, культивирование и отбор трансформантoв> О т л и ч B ю щ и ис я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве реципиентного штамма используют авирулентный штамм Yersinia pestis, несущий признак пигментсорбции Pgm+» чувствительность к пестицину psts, в качестве плазмидной

ДНК вЂ” плазмиду pCad, культивирование осуществляют в организме биопробного жиВОтнОГО B oTt2op трансфО12мантОВ IIpo водят по признаку вирулентности ° .

Способ трансформации возбудителя чумы Способ трансформации возбудителя чумы 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к генной инженерии, а именно к технологии получения высокопродуктивных штаммов Eserichia coli - продуцентов рекомбинантных белков человека, используемых в современной медицине в качестве тромболитических агентов

Изобретение относится к полипептидэкспрессирующим системам, требующим расщепления продукта-предшественника, к новому полипептиду, способному к восстановлению дихлориндофенола и окисленного глутатиона, к ДНК, кодирующей этот полипетид, фармкомпозициям, включающим данный полипептид, моноклональным антителам против указанного полипептида
Наверх