Способ определения протеолитической активности ферментов в международных единицах
Изобретение относится к биохимии, а именно к способам определения активности ферментов, и может быть использовано в отраслях промышленности, изготовляющих или применяющих протеолитические ферменты, а также в научно-исследовательских учреждениях, в медицинской диагностике. С целью расширения технологических возможностей способа и повышения его воспроизводимости в качестве субстрата сравнения используют 98а<SB POS="POST">S</SB>-казеин с блокированными алкилированием или ацилированием аминогруппами (N<SB POS="POST">1</SB>N-дикарбамидоэтил-α<SB POS="POST">S</SB>-ованием аминогруппами (N<SB POS="POST">1</SB>N-дикарбамидоэтил-α<SB POS="POST">S</SB>- казеин, N<SB POS="POST">1</SB>N-диметил-α<SB POS="POST">S</SB>-казеин, N-сукцинил-α<SB POS="POST">S</SB>-казеин), а в качестве "рабочего" белкового субстрата - модифицированные белки (окрашенный казеин ОКиА-АС, азоказеин, модифицированный казеин МКА-1, окрашенный гольевой порошок).
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК
А1 (19> SU (и) 1
51)5 С 12 ч 1/37
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4477201/30-13 (22) 29.06.88 (46) 07.10.90. Бюл. Р 37 (71) Научно-производственное объединение нФермент (72) М.В. Данилявичюте, Г.И. Денис, Ю,Ю. Степонавичюс, З.Ю. Йонушене, В.В. Карпавичюс, Л,В. Удовенко, H.À. Гуленко.и P.Е. Зингер (53) 577.156(088.8) (56) Hennrich N. and Brummer M..
Bericht А11gemeines zur Standardisierung und die Aktivitatsbestimmung
von Proteinasen. — Pharm. I nd., 1973, v. 35, К- 4, р. 194-204.
Карпавичюс В..В., Степановичюс Ю.Ю., Глемжа А.А., Денис Г.И. Экспресс-метод определения протеолитической активности ферментных препаратов, — В сб.: Производство и применение микробных ферментных препаратов. — Вильнюс, 1985, с. 57-63.
Изобретение относится к биохимии, а именно к способам определения активности ферментов, и может быть использовано в областях промьппленности, изготавливающих или применяющих протеолитические ферменты, а также в научно-исследовательских учреждениях, в медицинской диагностике.
Цель изобретения — расширение технологических возможностей способа и новышение его воспроизводимости.
В качестве субстрата сравнения используют электрофоретически чистый бе2 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМ. НТОВ В ИЕЖДУНАРОД
НЫХ ЕДИНИЦАХ (57) Изобретение относится к биохимии, < а именно к способам определения ак- тивности ферментов, и может быть использовано в отраслях промышленности, изготовляющих или применяющих протеолитические ферменты,.а также в научноисследовательских учреждениях, в медицинской диагностике. С целью расширения технологических возможностей способа и повышения его воспроизводимости в качестве субстрата сравнения используют з-казеин с блокированными алкилированием или ацилированием а аминогруппами (N ОКА-АС, азоказеин, модифицированный казеин 11КА-1, окрашенный гольевой по, рошок). 2 з.п. ф-лы, 5 табл. лок — af -казеин с блокированными амиS ногруппами, который расщепляется всеми известными протеазами, а различия скоростей протеолиза отдельных партий этого белка варьируют в интервале 4-6Х что значительно повышает воспроизводимость способа. Значения активности ферментов, определенные предлагаемым способом, показывают количество гидролизованных пелтидных связей в используемом субстрате сравнения. Такие данные показы1597405 4 где ПА - активность протеазы в междунаррдных единицах; D — - оптическая плотность; 5 14 — разведение ферментного раствора в ходе определения; ГЭ вЂ” глициновый эквивалент, определяемый по калибровочному графику; 0 t — время гидролиэа субстрата, мин, m — - количество фермента, взятое на протеолиз, мг; 1000 — переводной коэффициент полу15 ченных единиц на 1 г ферментного препарата. 1Io данным параллельного гидролиза модифицированного казеина MKA-1 и N,N-дикарбамидоэтил- (-казеина мето20 дом наименьших квадратов находят коэф.— фициенты пересчета (табл. 1) по формуле вают практическую ценность протеолити ческих ферментов. Пример 1. Определение протеолитической активности химотрипсина при помощи модифицированного каэеина MKA-1 . В О, 1 М фосфатном буфере (рН 7,6) готовят 2%-ный раствор модифицированного казеина МКА-1, 2%-ный раствор N,N-дикарбамидоэтил-o(>-казеина и раст вор кристаллического химотрипсина (концентрация 1 мг/см ). Делают пять разведений 0,1 M фосфатным буфером (рН 7,6+0,1) кристаллического химотрипсина А (концентрация О, 2 — — 1 мг/смЗ) и проводят по пять параллельных опытов гидролиэа модифицированного казеина МКА-1 с каждой концентрацией химотрипсина. В пробирки вместимостью 20-25 смэ наливают по 1 см 2%-ного раствора модифицированного казеина МКА-1 и термостатируют в ультратермостате при 30 С 5 мин. Наряду.с ними термоста- 25 тируют и ферментный раствор, В каждую пробирку с термостатированным ра . створом модифицированного казеина МКА-1 добавляют по 1 см термостатиз рованного раствора фермента, содержи- 30 мое перемешивают и выдерживают при. 30 С 10 мин, Через 10 мин пробирки переносят в кипящую водяную баню и выдерживают в ней 2 мин. Затем в пробирки с инкубационной смесью добавляют по 10 см з О, 1М боратного буферного раствора (рН. 9,3) и по 1 смз 0,7%-ного раствора 2,4,6-тринитробен,золсульфокислоты, реакционную смесь энергично взбалтывают и выдерживают при 30 С в течение 30 мин, после чео ro добавляют по 1 см 6М раствора з формалина, перемешивают и определяют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 3 = 420 нм про-45 тив контрольной пробы. Контрольную пробу готовят аналогично опытному гидролизату, добавляя ,вместо 1 см раствора исследуемого фермента 1 см раствора инактивированного (кипячением в водяной бане 3 мин) фермента, Параллельно там же способом проводят гидролиз Я„,Н-дикарбамидоэтил- в(з-казеина одним из растворов кристаллического а -химотрипсина и определяют его активность по формуле ПА =- (К.В+ К) m 2 (2) ПА = — — — — 1000 (E/г), (1) D ° 14 ГЭ - t-m где ПА — активность протеазы в международных единицах; D — средняя оптическая плотность параллельных опытов гидролиэа модифицированного белкового субстрата; m — количество ферментного препарата, мг, взятое на анализ при помощи модифицированного белкового субстрата; К и К вЂ” коэффициенты пересчета данной партии модифицированного белкового субстрата. Данные по определению коэффициента пересчета для модифицированного ка-— зеина MKA-1 приведены в табл. 1 ° В 0,1 M фосфатном буфере (рН»6) готовят 2%-ный раствор модифицированного казеина MKA-1 и раствор o(-химотрипсина (концентрация 3 мг/см ) . Проз водят определение активности по описанной методике,,получая D = 0,41, Используя значения коэффициентов К и К по формуле (2) вычисляют активность ПА = 168,01 ME/г. Пример 2. Определение протеолитической активности протосубтилина ГЗх при помощи окрашенного каэеина ОКА-АС. В 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) готовят 0,8%-ный раствор окрашенного казеина ОКА-АС, 2% — ный раствор N,N-дикарбамидоэтил-gz-каэеина и раствор 5 ! О 2О 5 159 очищенной нейтральной протеазы из В. Subtilis шт. б5 (О, 15 мг/см ). Делают пять разведений раствора очищенной нейтральной протеаэы (концентрация 0,05 — О, 15 мг/см ) и проводят по пять параллельных опытов протеолиэа с каждой концентрацией фермента следующим образом. К 5 см 0,8%-ного раствора окрашенного казеина ОКА-АС, термостатированного при 30,0+0, 1 С, добавляют 1 см раствора ферментного препарата, перемешивают и инкубируют при 30, О+О, 1 С . Через 10 мин добавляют 5 смз 0,5 M раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и выдерживают в термостате еще 10 мин. Полученную смесь фильтруют через плотный бумажный фильтр (синяя лента) и определяют оптическую плотность фильтрата при 8= 400+0,5 нм против контрольной пробы. Контрольную пробу готовят аналогично опытному гидролизату, добавляя 1 см инактивированного (кипячением на водяной бане 2-3 мин) ферментного раствора. 1 Параллельно проводят гидролиз субстрата сравнения дикарбамидоэтил-g— -казеина при помощи очищенной нейтральной протеазы из В.subtilis шт.65 по методике примера 1 и по формуле (1) вычисляют активность в международных единицах. По данным параллельного гидролиза очищенной нейтральной протеазой окрашенного казеина ОКА-АС и N,N-дикарбамидоэтил-О(-казеина (табл. 2) при помощи уравнения (2) методом наименьших квадратов находят коэффициенты пересчета К „и К для данной партии окрашенного казеина OKA-AC. Данные определения коэффициента пересчета для окрашенного казеина ОКА-АС приведены в табл. 2. В О, 1М фосфатном буфере (рН 7, 2) готовят 0,8%-ный раствор окрашенного казеина ОКА-АС и раствор исследуемого ферментного препарата протосубтнлина . ГЗх (концентрация 8 мг/см ). Далее проводят гидролиз окрашенного казеина ОКА-АС описанным образом, т.е. к 5 смз 0,8%-ного раствора окрашенного казеина ОКА-АС, термостатированного при 30 С, добавляют 1 см феро ментного раствора, перемешивают и инкубируют при 30 С. Через 10 мин добавляют 5 см 0,5М раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и вы7405 6 держивают в термостате еще 10 мин, Полученную смесь фильтруют через плот — ный бумажный фильтр (синяя лента) и определяют оптическую плотность фильтрата при 3= 400+0,5 нм против контрольной пробы. Контрольную пробу приготавливают аналогично опытному гидролизату, добавляя .1 смз инактивированного (кипячением на водяной бане 3 мин) ферментного раствора, Получают D = 0.415. Hr †. пользуя значения К и К этой партии i окрашенного казеина OKA-АС по формуле (2) вычисляют активность ПА=35,1 МЕ/г. Пример 3. Определение протеолитической активности щелочной протеаэы в моющем средстве "Биомаг" при помощи окрашенного каэеина ОАК-AC. В 0,1М карбонатном-бикарбонатном буфере (рН 10,5) готовят 0,4%-ный раствор окрашенного казеина ОКА-АС, 1%-ный раствор N,N-дикарбамидоэтил— o(-Kàçåèíà, раствор очищенной щелочной протеазы из В.Subtilis шт. 72 (концентрация 2, 0-10 мг/сМ ). Делают пять разведений раствора очищенной -3 щелочной протеазы (концентрация О, 5 10— 2 10-тамг/смэ) и проводят по пять параллельных опытов протеолиза. с каждой концентрацией фермента следующим об-. разом. К 5 см 0,4%-ного раствора окз рашенного казеина ОКА-АС, термостатированного при 40 С, добавляют 2 смз ферментного раствора, перемешивают и о инкубируют при 40 С. Через 45 мин добавляют 5 смэ 1,2М раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и выдерживают в термостате еще 10 мин. Полученную смесь фильтруют через плотный бумажный фильтр (синяя лента) и определяют оптическую плотность фильтрата при Д = 400 нм против контрольной пробы. Контрольную пробу готовят аналогично опытному гидролизату, добавляя 2 смЭ инактивированного (кипячением на водяной базе 3 мин) ферментного раствора. Параллельно проводят гидролиэ субстрата сравнения — N,N-дикарбапащоэтил- о(-казеина при помощи очишенной щелочной протеазы из В.Subtilis шт.72 В пробирки вместимостью ?0-25 см на- ливают по 1 смз 1%-ного раствора N,N-дикарбамидоэтил- с(-каэеина H термостатируют в ультратермостате при 40 С 5 мин. Наряду с ними термостатируют и ферментный раствор. В каждую 7 15974 пробирку с термостатированным раствором N,N-дикарбамидоэтил- о(-казеина 5 добавляют по 1 см термостатированного раствора фермента, содержимое перемешивают, выдерживают при 40 С с 5 10 мин. Через 10 мин пробирки переносят в кипяченую водяную банй и выдерживают в ней 2 мин. Затем в пробирки с инкубационной смесью добавляют по 10 см 0,1М боратного буферного раст3 вора (pEI 9,3) и по 1 смз 0,7%-ного раствора 2,4,6-тринитробензолсульфокислоты, реакционную смесь энергично взбалтывают и выдерживают при 30 С 30 мин, после чего добавляют по 1 см бМ формах.ина, перемешивают и определяют оптическую плотность колориметрированием на спектрофотометре при длине волны Я = 420 нм против контрольной пробы. Контрольную пробу готовят аналогично опытному гидролизату, добавляя 1 см инактивированного кипячением на водяной бане 2-3 мин ферментного 25 раствора. Активность вычисляют по формуле (1) . По данным параллельного гидролиза очищенной щелочной протеазой из 30 В. Subtilis шт. 72 окрашенного казеина OKA-АС и N,N-дикарбамидоэтил-с(з -казеина (табл. 3) при помощи уравнения (2) методом наименьших квадратов находят коэффициенты пересчета К„:и 1 К для данной партии окрашенного ка зеина ОКА-АС. Данные определения коэффициента пересчета для окрашенного казеина ОКА-АС приведены в табл. 3.,@ В 0,1М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 10,5) готовят 0,4%-ный .. раствор окрашенного казеина ОКА-СА ° и раствор исследуемого препарата "Биомаг" (концентрация 3 мг/мл). Далее проводят гидролиз окрашенного казеина ОКА-АС описанным образом, т.е. к 5 см 0,4%-ного раствора субстрата, з термостатированного при 40 С, добавляют 2 см раствора "Боимаг", перемешивают и инкубируют при 40 С. Через 45 мин добавляют 5 см 1,2 M раствора трихлор уксусной кислоты, пер емешивают и въдерживают в термостате еще 10 мин. Полученную смесь фильтруют через плотный .бумажный фильтр (синяя лента) 55 и определяют оптическую плотность фильтрата при h = --400 нм против контрольной пробы. Контрольную пробу готовят аналогично опытному гидролизату, добавляя 2 см инактивированного (кипячением 9 на водяной бане 3 мин). раствора "Био-, маг". Получают В =0 320. Используя значения коэффициентов К „ и К, по формуле (2) вычисляют активность ПА = = 4,72 ИЕ/г ° Пример 4. Определение протеолитической активности протосубтилина Г10х при помощи азоказеина. В О, 1М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 10,5) готовят 0,3%-ный . раствор азоказеина, 1%-ный раствор N-сукцинил-4 -казеина и раствор очищенной щелочной протеазы из В.Subtilis шт. 72 (концентрация 2,5 .10 мг/см ). Делают пять разведений раствора очищенной щелочной протеазы (концентрация 0,00075-0,0025 мг/см ) и проводят по пять параллельных опытов протеоли-. за с каждой концентрацией фермента следующим образом. K 5 смз 0,3%-ного раствора азоказеина, термостатированного при 40 С, добавляют 2 смз ферментного раствора, перемешивают и инкубируют при 40 С. Через 45 мин добавляют 5 см 1,2М раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и выдерживают в термостате еще 10 мин. Полученную смесь фильтруют через плотный бумажный фильтр (синяя лента) и определяют оптическую плотность фильтрата при Л = 400 нм против контрольной пробы. Контрольную пробу готовят ана>логично опытному гидролизату, добав3 ляют 2 см инактивированного кипячением на водяной бане 3 мин ферментного раствора. Параллельно проводят гидролиз субстрата сравнения — И-сукцинил-g— Ф -казеина при помощи одного из растворов очищенной протеазы из B. Subtilis шт. 72 по методу примера 3 и по формуле (1) вычисляют активность в международных единицах. По данным параллельного гидролиза очищенной щелочной протеазой из В.Subtilis mr. 72 азоказеина и N-сукцинил- о з-казеина (табл. 4), используя уравнение (2), методом наименьших квадратов находят коэффициенты пере- счета К, и К для данной партии азоказеина. Данные определения коэффициентов переСчета для азоказеина приведены в табл. 4.! 5974 В О, 1М карбонатно-бикарбонатном буфере (РН 10, 5) готовят 0,4Х-ный раствор азокаэеина и раствор протосубтилина Г10Х (концентрация 0,03 мг/см ). Далее проводят гидролиэ з 5 азоказеина описанным образом, т,е. к 5 см Оу37-ного раствора субстрата, g термостатированного при 40 С, добаво ляют 2 см раствора протосубтилина з Г10х и инкубируют при 40 С. Через 45 мин добавляют 5 смэ 1,2М раствора трихло уксусной кислоты, перемешивают и выдерживают в термостате еще 10 мин. Полученную смесь фильтруют через плот- 5 ный бумажный фильтр (синяя лента) и определяют оптическую плотность фермента при 4 = 400 нм против контрольной пробы. Контрольную пробу готовят аналогично опытному гидролизату, 20 добавляя 2 см инактивированного киэ пячением на водяной бане 3 мин,ферментного раствора. Получают D = 0,4 15. Используя значения коэффициентов К т и К по формуле (2) вычисляют актив- 25 ность ПА = 3075 ME/г. Пример 5 ° Определение протеолитической активности протосубтилина ГЗх при помощи окрашенного гольевого порошка ОГП=О. 30 В О, 1 M фосфатном буфере (РН 7, 2) готовят 2Х-ный раствор N,N-диметил†-каэеина и раствор очищенной нейтральной протеазы из В.Subtilis шт.65 (концентрация 3 .10 - мг/см ), а в 0,1М фосфатном буфере (РН 6,0) -. Раствор очищенной нейтральной протеазы из В. Subtilis шт. 65 (концентрация 1 5 10 мг/см з) . Делают пять разведений 0,1М фосфат-40 ным буфером (рН 6,0) очищенной нейтральной протеаэы и проводят по пять параллельных опытов гидролиза окрашенного головьевого порошка ОГП-О с каждой концентрацией фермента следу- 45 ющим образом. 1 В термостэтируемую при 30 С кювету, поставленную на магнитной мешалке, помещают 200 мг субстрата, наливают Б см> буферного раствора (РН 6,0) и термостатируют .5 мин. При перемешивании со.скоростью 300 об/мин добавляют 2 см У раствора очищенной нейтРальной протеазы и выдерживают при 30 С 5 мин. По окончании инкубационного времени реакционную смесь немедленно фильтруют через бумажный Фильтр средней плотности. Определяют 05 10 оптическую плотность фильтрата при Л= 480 .нм против контрольной пробы, Контрольную пробу готовят аналогично опытному гидролизату, добавляя вместо 2 см раствора фермента 2 смЗ раствор инактивированного кипячением в водяной бане 3 мин Фермента. Параллельно проводят гидролиэ субстрата сравнения — N,N-диметил-e -казеина при помощи очищенной нейтральной протеазы из В.Subtil is шт. 65 по методике примера 1 и по формуле (1) вычисляют активность в международных единицах. По данным параллельного гидролиза очищенной нейтральной протеаэой окрашенного гольевого порошка ОГП-0 и N,N-диметил-о(-казеина (табл. 5) при помощи уравнения (2) методом наименьших квадратов находят коэффициенты пересчета К и К для данной партии окрашенного гольевого порошка ОГП-О. Данные по определению коэффициента пересчета для окрашенного гольевого порошка ОГП-0 приведены в табл. 5. В 0,1М Фосфатном буфере (pH буО) готовят раствор исследуемого препарата протосубтилина ГЗх (концентрация 2 мг/см З). Далее проводят гидролиэ окрашенного гольевого порошка ОГП-О описанным образом, т„е., B термостатируемую при 30 С кювету, поставленную о HB магнитной мешалке, помещаl„T 200 NI субстрата, наливают 5 см Буферного раствора (РН 6,0) и термостатируют 5 мин. При перемешивании со скоростью 300 об/мин добавляют 2 см раствора протосубтилина ГЗх и выдерживают при о,,30 С 5 мин. По окончании инкубацион ного времени реакционную смесь немедленно фильтруют через бумажный фильтр .Редней плотности. Определяют оптическую плотность фильтрата при J =480 нм против контрольной пробы. Контрольную пробу готовят аналогично опытному гидролизату, добавляя вместо 2 см раствора исследуемого фермента 2 смэ раствора инактивированного кипячением на водяной бане 3 мин фермента. Получают D = 0,37. Используя значения коэффициентов К и К < по формуле (2) вычисляют активность ПА = 23 1,25 МЕ/г. Формула изобр:ет ения ! 1 . Способ опр ед ел ения пр от еолитической активности ферментов в междунаТаблица 1 Опыт Значение коэффициентов пересчета Активность кристаллического химотрипсина в международных единицах (используя N,N-дикарбамидоэтил- o(-казеS ин) D npu 3 =420 нм (с модифицированным казенном ИКА-1) Концентрация кристаллического химотрипсина, мг/см 0,60 О., 48 0,38 0,24 0,15 1 1,0 2 0,8 3 0,625 4 0,4 5 0,25 K,=1233, 90 К =-1,84 740,3 Таблица 2 ПА в международных единицах (используя N,N-дикар бамидоэтил- g -каS зеин) Значение коэффициентов пеD npu Л= 400 нм (с окрашенным казенном) Кон чентрация протеазы, мг/см Опыт ресчета 0 150 О, 205 0,310 0,355 О, 444 О, 05 0,07 О, 10 0,12 0,15 2 4 К,=677,47 202016 К =-0 35 ll 15974 родных единицах, включающий инкубацию исследуемого фермента с рабочим" субстратом — модифицированным белком и регистрацию продуктов протеолиза путем определения оптической плотности анализируемой пробы„ о т л и ч а юшийся тем, что, с целью расширения технологических возможностей способа и повышения его воспроизводимос1О ти, определяют коэффициенты пересчета измерением скоростей параллельного протеолиза стандартного фермента с "рабочим" субстратом и субстратом сравнения, в качестве которого исполь-. l е 12 зуют e(q -казеин с блокированными алкилированием или ацнлированием аминогруппами. 2. Способ по п, 1, отличаюшийся тем, что в качестве "рабочего" белкового субстрата используют окрашенный казеин ОКА-АС, азоказеин, модифицированный казеин MKA-1, окрашенный гольевой порошок ОГП-О. 3. Способ по п. 1, отличаюшийся тем, что в качестве субстрата сравнения используют N,N-дикарбамидоэтил-o(-казеин, N>N-диметил— (-казеин, N-сукцинил- -казеин. 1597405 Таблица 3 Опыт Концентрация очищенной протеазы, 10 Mr/ìë 9900 К,=82,88 К =1,78 Таблица 4 Опыт Значение коэффициентов ПА в международных единицах (используя (N-сукцинил- Ы -казеин) пересчета 1 7,5 2 10 3 15 4 20 5 25 К,=110,39 К,=O 31 9900 Таблица 5 ПА в международных единицах (используя N,К-дикар бамидоэтил- а(-ка3 зеин) Концентрация очи щенной протеазы, i 0-т ммг/с„З Опыт нач ение оэффицинтов пеесчета К = 2500 2500 K" z=- 0 Г Составитель В. Банзакова Техред JI.Îëèéíûê Корр ект ор M. Шар о щи Редактор И. Дербак Заказ 3033 Тираж 491 Подписное опгииыь р пл .v лнмитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 2 4 2 0,5 0,75 1,0 1,5 2,0 Концентрация очищенной протеазы, 10 мг/см 0,5 0,75 1,0 1,25 1,50 D npu = 400 н м (с окрашенным казенном ОКА-АС) 0,087 О, 153 0,227 0,333 0,455 D npu Л= 400 им (с азоказеином) 0,15 О, 215 0,325 0,452 0 57 D npu Л = 400 нм (с окрашен ным гольевым порошком) 0,155 0,240 0,315 0,390 0,475 ПА в международных единицах (используя N,N-дикарбамидоэтил- 0(з-ка зеин) Значение коэффициентов пересчета
