Способ определения концентрации иммуноглобулинов в биологической жидкости

 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимии. С целью упрощения и повышения точности способа применяют приготовляемый в виде полосок толщиной 2-3 мм агаровый гель (0,8-1,8%), содержащий полиэтиленгликоль (2-3%) и этиленгликоль (7-10%), на который накладывают полоски (2х5 мм) хроматографической бумаги, например N 15, пропитанные исследуемой жидкостью, с последующим измерением участков преципитации, просветляемых после инкубации 10-15%-ным раствором уксусной кислоты. Применение способа в практике позволяет повысить точность определения в 6 раз, снизить травматичность, увеличить сроки хранения системы до 1 года и снизить расход материалов в 3-5 раз.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕ ННЫ И КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОЬРЯтЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4348447/30-14 (22) 22,12.87 (46) 30,10.90. Бюл, ¹ 40 (71) Карагандинский государственный медицинский институт (72) К.А. Лебедев, Н.В. Козаченко, И.Д. Понякина, В.Н. Бесков, И.Е. Цаплина, Н.П, Бойченко и К.Б, Оспанова (53) 612.015(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 1050668, кл. G 01 N 33/48, 1983, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИММУНО! ЛОБУЛИНОВ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ (57) Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимии. С

Изобретение относится к иммунохимии и может быть использовано в клинической иммунологии для определения концентрации имунноглобулинов в биологической жидкости.

Цель изобретения — упрощение и повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом, Готовят гель, содержащий 0,8 — 1,8 агара, 2 — 3 полиэтиленгликоля и 7 — 10% этиленгликоля. Для этого в физиологический раствор засыпают соответствующее количество агара и оставляют на 2 —,3 ч для набухания. После этого добавляют полиэтиленгликоль и этиленгликоль в соответствующих количествах и инкубируют при 80 С в течение 2 ч. Получают агаровый гель, который можно хранить до использования в холодильнике. Полученный агаровый гель доводят до 50 С, после чего к нему прили„„ Ж „„1603301 А1 целью упрощения и повышения точности способа применяют приготовляемый в виде полосок толщиной 2 — 3 мм агаровый гель (0,8 — 1,8 ), содержащий полиэтиленгликоль (2 -- 3 %) и этиленгликоль (7 — 10 %), на который накладывают полоски (2 х 5 мм) хроматографической бумаги, например № 15, пропитанные исследуемой жидкостью, с последующим измерением участков преципитации, просветляемых после инкубации 10 — 15 — ным раствором уксусной кислоты, Применение способа в практике позволяет повысить точность определения в 6 раэ, снизить травматичность, увеличить сроки хранения системы до 1 года и снизить расход материалов в 3 — 5 раз. вают моноспецифическую антисыворотку к иммуноглобулинам класса А, M или G в таком количестве, чтобы конечная концентрация в растворе соответствовала указанной на ампуле, перемешивают и используют для заготовки пластин с полосками агарового геля. Для этого на пластину иэ стекла или прозрачной пластмассы накладывают трафарет, позволяющий получать полоски геля шириной 2 — 3 мм на расстоянии 5 — 6 мм друг от друга, лежащие на плоскОсти пластины.

После застывания агара трафарет сни-. мают (можно испольэовать разовые трафареты и не снимать их, оставляя в системе).

Разные области пластины можно заполнять агаровым гелем с антисыворотками к иммуноглобулинам разных классов, окрашивая агар с разными антисыворотками красителями разного цвета — тогда на одной пластине будут полоски агара с антисыворотками

1603301 при 80 С йериодически перемешивая, в течение 2 ч. Полученный гель использовали 40 для получения геля с антисывороткой к иммуноглобулинам класса А, M или G. Для этого температуру геля доводили до 50 С и добавляли соответствующую антисыворотку в количестве, определенном инструк- 45 цией используемого комплекта, тщательно перемешивали 3 — 4 мл полученной смеси заливали на предварительно нагретую до

50 С прозрачную пластину размером 8 х 12 см с приклееным к ней трафаретом из пластмассы толщиной 2 мм. Пластина должна лежать в строго горизонтальном положении. В результате на пластине получали 11 полос агара шириной 2 мм, длиной 11 см.

После застывания геля и охлаждения пластину накрывали крышкой, герметизировали при помощи пластиковой изоляционной лено ты и хранили до использования при 1... — 8 С.

Перед использованием систему (пластину с полосами геля) доводили до комнатной для определения содержания иммуноглобулинов разных .классов, окрашенные в

: разные цвета. Полученную готовую систему для определения содержания иммуноглобулинов накрывают крышкой, герметиэируют при г1омощи клейкой полиэтиленовой ленты и хранят при-1 ... — 8 С до 1 года.

Перед использованием систему вскрывают, на полосы агара перпендикулярно к ним накладывают стандартные полоски хроматографической бумаги, например

М 15, размером 2 х 5 мм, пропитанные тестируемой жидкостью, так, чтобы концы этих полосок находились вне полоски агара, Накладывают также полоски, пропитанные контрольной сывороткой в различных разведениях. Затем систему с нанесенным тестируемым материалом вновь закрывают крышкой, герметизируют клейкой полиэтиленовой лентой и инкубируют при 36 С в течение 12-40 ч. После окончания инкубации крышку снимают, пластину погружают в 10 — 15 g, -ный водный раствор уксусной кислоты, через 10 мин вынимают и измеряют ширину преципитата при помощи. бинокулярной лупы. По. данным контрольных сывороток в разных разведениях строят кафь либровочную кривую, по которой определяют содержание иммуноглобулинов в сывортке или другой текстируемой жидкости.

Пример 1. 0 8 г агара заливали 50 мл физиологического раствора, оставляли для набухания на 2 — 3 ч. После этого добавляли

2 г полизтиленгликоля и 7 г этиленгликоля и доливали физиологический раствор до общей массы раствора 100 г, тщательно перемешивали и инкубировали

35 температуры, затем раскрывалй. Полоски хроматографической бумаги размером 2 х 5 мм брали эа конец пинцетом, пропитывали текстируемым материалом и накладывали перпендикулярно полосам геля на расстоянии 1 — 1,5 см друг от друга, плотно прижи- . мая к поверхности геля пинцетом. На полосы геля накладывали также полоски бумаги, пропитанные стандартной сывороткой человека, неразведенной и в разведениях 1:2 ° 1.4, 1:8, 1:16. После нанесения всех образцов указанным способом систему вновь герметично закрывали, герметизируя клейкой пластиковой лентой, и инкубировали при 37 С для JgG до 22 ч, для

J оА до 24 ч, для ) g М до 40 ч. Затем пластины погружали в 107, — ный водный раствор уксусной кислоты. Через t0 мин пластины вынимали и измеряли ширину "проявленных" преципитатов при помощи бинокулярной лупы с .окуляр-микрометром. По стандартной сыворотке в разных разведениях строили калибровочную линию, по которой определяли содержание иммуноглобулинов в тестируемой жидкости.

Указанным способом тестировали следующие образцы, 1, У горнорабочего В., 29 лет, выделяли сыворотку крови. Сыворотку хранили в замороженном состоянии, перед тестированием размораживали.

2, У горнорабочего М., 45 лет, выделяли плазму крови (центрифугированием гепаринизированной крови). Плазму хранили в замороженном состоянии, перед тестированием размораживали, 3. У лаборанта А., 24 г., прокалывали палец, полоски хроматографической бумаги непосредственно перед определением пропитывали кровью из пальца.

4, У больного С„37 лет (диагноз — варикозное расширение вен правой нижней конечности в стадии декомпенсации, трофическая язва голени) полоски хроматографической бумаги пропитывали отделяемым язвы.

5. У больного М., 42 лет (диагноз — стоматит автозный), полоски хроматографической бумаги прикладывали к пораженным участкам слизистой оболочки полости рта.

6, У горнорабочего С„ЗО лет, брали слюну. Хранили в замороженном состоянии, перед тестированием размораживали.

Данные анализов приведены в табл, 1.

Пример 2. Агаровый гель с антисыворотками и систему для определения иммуноглобулинов готовили так же, как в примере 1, но на 100 г.раствора брали 1 r агара, 2,5 г полиэтиленгликоля, 10 г этиленгликоля, Для "проявления" использовали

1603301

Таблица1

Примеры использования способа при тестировании различных биологических жидкостей

15%-ный водный раствор уксусной кислоты. Тестировали те же жидкости, что и в примере 1.

Результаты анализов приведены в табл. 1.

Пример 3. Агаровый гель с антисыворотками готовили так же, как в примере 1, но брали 1,8% агара, 3% полиэтиленгликоля, 8 этиленгликоля. К прозрачной пластине размером 8 х 12 см плотно прижимали и закрепляли трафарет, равномерно смазанный вазелином. Пластину нагревали до 50 С, после чего заливали гелем (3 — 4 мл на пластину) при 50 С. Посде застывания геля трафарет аккуратно снимали. Получали 10 пooocoK агара шириной 3 мм, длиной 11 см.

Готовую систему накрывали, герметизировали при помощи изоляционной ленты и хранили при-1... — -8 С до использования.

Для "проявления" преципитатов использовали 12% — ный раствор уксусной кислоты.

Тестировали те же жидкости, что и в примере 1. Результаты анализов приведены в табл. 1, Данные, подтверждающие достижение указанной цели, представлены в табл, 2 и 3.

Из табл. 2 видно, что ошибка, получаемая при тестировании одной пробы трижды по предлагаемому способу, достоверно (рО,001) и существенно (в 6 и более раэ) ниже, чем по прототипу, что свидетельствует о повышении точности предлагаемого способа по сравнению с прототипом, Предлагаемый способ обладает следующими преимуществами по сравнению с известным: область применения предлагаемого способа существенно шире эа счет снижения материалоемкости и увеличения длительности хранения системы от 2 недель до 1 года; он требует материалов в 3 — 5 раз меньше, обладает более высокой точностью в связи с работой по принципу линейной иммунодиффузии, менее трудоемок, так как не требует пробивания лунок, внесения в них тестируемой жидкости при помощи мик5 рошприца, окрашивания; удобен, поскольку предполагает внесение материала для исследований непосредственно из объекта без предварительного забора и подготовки ма- " териала; требует очень мало тестируемого

10 материала, что позволяет определять иммуноглобулины в отделяемом ран, в локальных областях поверхности слизистых оболочек, в крови непосредственно из пальца (не только у взрослых, »о, что особенно важно, 15 у детей младшего возраста) или из ран; значительно менее травматичен для пациента, Предлагаемый способ полностью готов к применению и может быть рекомендован к широкому использованию в клинических

20 иммунологических лабораториях и в экспедициях при проведении массовых иммунологических обследований.

Формула изобретения

Способ определения концентрации иммуноглобулинов в биологической жидкости путем пропитывания носителя исследуемой жидкостью с последующим нанесением на агаровый гель, содержащий антисыворотку, 5 инкубации и вычисления концентрации по значению участков преципитации, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, вводят 2—

3% — ный полиэтиленгликоля и 7-10% этиленгликоля в агаровый гель, иэ которо35 го готовят полоски шириной 2 — 3 мм, после чего на них накладывают полоски носителя иэ крупнопористой хроматографической бумаги, а после инкубации участки преципитации обрабатываются 10 — 15% — ным

40 раствором уксусной кислоты. t603301

Продолжение табл. 1

Таблица2

Ошибка, получаемая при троекратном тестировании одной пробы по предлагаемому впособу и прототипу (исследовано 48 проб плазмы )

Та бл и ца3

Количество материалов, используемых для тестирования по трем классам иммуноглобулинов 960 образцов

Составитель Н.Валеева

- Редактор И.Касарда Техред M.Moðråêòàë Корректор И.Муска

Заказ 3382 Тираж 514 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат ".Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101