Способ получения пептона

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения пептона. Цель изобретения унификация и упрощение способа, увеличение выхода целевого продукта, улучшение его качества за счет повышения доли среднемолекулярных пептидов с мол. м. 500 1500 Д. Способ заключается в проведении гидролиза внутренних органов сельскохозяйственных животных, их слизистых оболочек или вторичных жмыхов органов и тканей после извлечения биологически активных веществ щелочной и нейтральной протеазой Bacillus subtilis Г 3х и Г 10х при гидромодуле из расчета содержания сухого вещества в суспензии 10 24% до максимального накопления полипептидов. При этом оптимум pH устанавливают гидроксидом кальция и фосфорной кислотой. 3 табл. 2 з. п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения пептона. Цель изобретения унификация и упрощение способа, увеличение выхода целевого продукта, улучшение его качества за счет повышения доли среднемолекулярных пептидов с мол.м. 500-1500 Д. Способ заключается в том, что в качестве ферментного препарата для гидролиза внутренних органов сельскохозяйственных животных, их слизистых оболочек или вторичных жмыхов этих органов и тканей после извлечения биологически активных веществ используют щелочную и нейтральную протеазы Bacillus subtilis Г 3х, Г 10х, при этом гидролиз проводят при гидромодуле из расчета содержания сухого вещества и суспензии 10-24% до максимального накопления полипептидов. При этом оптимум величин рН устанавливают гидроксидом кальция и фосфорной кислотой. Щелочная протеаза B. subtilis (продуцент шт.72) имеет оптимум действия при рН 8,5-10,5 и 50^оС, активность ПС 100 ед ед/г в соответствии с ТУ 5901.003.74-8. Нейтральная протеаза B. subtilis (продуцент шт.103) имеет оптимум рН 6,5-7,5 в интервале температур 48-52^оС, протеолитическая активность 70 ед/г соответствует ГОСТ 23636-79. Определение суммарного содержания пептидов проводят по биуретовой реакции в соответствии с ГОСТ 13805-76. Определение фракций пептидов проводят по данным гель-фильтрации в сефадексе G-15. Содержание свободных аминокислот определяют на автоматических анализаторах фирм "Хитачи" КЛА-5 и "Дуррум" (США). П р и м е р 1. К жмыху поджелудочной железы после извлечения инсулина (влажность 64%) добавляют воду и получают гидромодуль из расчета содержания сухого вещества в суспензии 18% Устанавливают рН смеси гидроксидом кальция до 10,5, вносят при перемешивании 30 г щелочной протеазы Г 10х. Гидролиз ведут при 50 ± 0,5^оС и рН 10,5-9,0 до максимального содержания истинных пептонов (полипептидов) 7,0% при отрицательной реакции на белок с 20%-ной трихлоруксусной кислотой. По окончании гидролиза рН смеси доводят концентрированной ортофосфорной кислотой до 7,0, прогревают при 100^оС в течение 20 мин, фильтруют в горячем состоянии. Осадок на фильтре промывают 150 мл горячей воды. Фильтрат высушивают методом распыления. Осадок на фильтре высушивают при 105^оС для определения отходов исходного материала при гидролизе в качестве теста на полноту использования сырья. Процент отходов рассчитывают обычным способом. Количество отходов составляет 108 г (31), выход пептона после высушивания 140 г (40% от массы исходного сырья в пересчете на сухое вещество). Общая продолжительность процесса 16 ч. П р и м е р 2. Готовят суспензию того же сырья с гидромодулем из расчета содержания сухого вещества 24% Гидролиз и последующие стадии проводят так же, как в примере 1. Количество отходов составляет 140 г (40% от массы сухого сырья), выход пептона 105 г (32%). П р и м е р 3. К тому же сырью добавляют воду до содержания сухого вещества в суспензии 12% Гидролиз и последующие операции проводят так же, как в примере 1. Количество отходов 98 г (28% от массы сухого сырья). П р и м е р 4. К жмыху легких после извлечения гепарина (влажность 80%) после предварительной подготовки (отмывки избытка хлорида натрия водой) добавляют воду и получают гидромодуль из расчета содержания сухого вещества в суспензии 10% Доводят рН смеси до 9,5 суспензией гидроксида кальция, вносят 25 г щелочной протеазы Г 10х, перемешивают и проводят операции, как в примере 1. Содержание истинных пептонов (полипептидов) в гидролизате 7,2% при отрицательной реакции на белок. Выход пептона после высушивания 40% из расчета содержания сухого вещества в сырье, содержание полипептидов в пептоне 90,2% П р и м е р 5. К жмыху печени после извлечения витогепата (влажность 78% ) добавляют воду. Гидролиз проводят при гидромодуле из расчета содержания сухого вещества в суспензии 11% в присутствии щелочной протеазы Г 10х, взятой в количестве 20 г. Все операции проводят, как в примере 1. Содержание истинных пептонов 6,9% в гидролизате. Выход пептона после высушивания 77 г (35% от массы исходного сырья в пересчете на сухое вещество). П р и м е р 6. Для получения пептона используют жмых мукозы (влажность 58% ) после извлечения гепарина, который предварительно подвергают отмывке водой от хлорида натрия. Гидролиз и все последующие операции, как в примере 1. Гидромодуль соответствует 21% содержания сухого вещества в суспензии. Гидролиз ведут до содержания полипептидов (истинных пептонов) 10,8% Выход сухого пептона на 1 кг сырья составляет 126 г (30% в пересчете на сухое вещество). П р и м е р 7. 300 г шляма кишечника крупного рогатого скота (содержание сухого вещества 14%) кипятят 20 мин, добавляют гидроксид кальция до рН 10,2 и 3% щелочной протеазы Г 10х. Гидролиз проводят при 37^оС. Гидромодуль соответствует 14% содержания сухого вещества. Все операции проводят, как в примере 1. Содержание полипептидов в гидролизате 7,55% Выход сухого пептона 27,3 г (65% по сухому веществу). П р и м е р 8. К высушенному шляму (влажность 16%) добавляют воду из расчета содержания сухого вещества в суспензии 14% гидроксид кальция до рН 7,65 и 2% нейтральной протеазы Г 3х. Гидролиз ведут при 37^оС и рН 7,65-6,85. Гидролизат по окончании гидролиза (отрицательная реакция на белок, содержание полипептидов 7,65%) прогревают при 90^оС в течение 10 мин и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин для отделения осадка. Полученный супернатант высушивают методом лиофилизации. Выход пептона 19 г (45,2% в пересчете на сухое вещество). Как показывают приведенные данные, выбранный гидромодуль из расчета содержания сухого вещества в суспензии 10-24% позволяет получать достаточно высокий выход готового продукта (от 30 до 65% в пересчете на сухое вещество). Полученные по предлагаемому способу образцы пептона по содержанию пептидов и аминокислот существенно отличаются от образцов известных пептонов (см.табл.1 и 2). Как видно из табл.1 и 2, при изготовлении пептона из разного сырья унифицированным способом общее количество полипептидов возрастает в сравнении с базовым вариантом до 83-95% из них доля среднемолекулярных пептидов увеличивается до 89-100% Содержание низкомолекулярных пептидов и аминокислот в препаратах пептона, изготовленных по предлагаемому способу, достоверно ниже, чем по способам-аналогам, при этом со щелочной протеазой оно меньше, чем с нейтральной. Приведенные данные позволяют предполагать, что добавление такого пептона к аминокислотной основе питательной среды должно наиболее полно удовлетворять потребности микроорганизмов как в аминокислотах, так и в пептидах. Определение ростобеспечивающей способности полученных образцов пептона проводят в средах на основе перевара Хоттингера. С этой целью используют 5-суточный панкреатический гидролизат мяса с аминным азотом 790 мг% и разводят его до содержания аминного азота 190 мг% добавляют 0,5% хлорида натрия. Из полученного разведения готовят четыре среды с использованием образцов пептона по предлагаемому способу в соответствии с примерами 1, 4 и 7, а также с производственной серией пептона Семипалатинского мясокомбината (базового образца). С этой целью добавляют 1% пептона, доводят рН до 7,4-7,6. Среды разливают в пробирки по 8 мл и стерилизуют 30 мин при 0,5 атм. Засев проводят из 24-часовых бульонных культур тест-штаммов микроорганизмов, по 0,2 мл. Пробы культивируют при 37^оС в течение 20-24 ч. Интенсивность роста определяют турбидиметрически на фотоэлектроколориметре при длине волны 670 нм. Полученные результаты отражены в табл.3. Как видно из табл.3, рост тест-штаммов на испытуемых питательных средах в большинстве случаев был более обильным, чем на контрольной среде с производственной серией пептона (базовый образец). Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет унифицировать получение пептона из разного сырья, упростить технологию изготовления стандартного целевого продукта, отвечающего требованиям НТД (ГОСТ 13805-76 и ТУ 49-278-74), с увеличением его выхода и улучшением качества за счет повышения доли среднемолекулярных пептидов и с мол.м. 500-1500 Д. Выход целевого продукта увеличивается с 12-16% по сухому веществу сырья до 30-40% время гидролиза сокращается с 12-15 ч до 7-8 ч.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТОНА, включающий гидролиз внутренних органов сельскохозяйственных животных, их слизистых оболочек или вторичных жмыхов этих органов и тканей после извлечения биологически активных веществ ферментным препаратом при оптимальных значениях его концентрации, температуры и рН, коагуляцию негидролизованного белка и инактивацию фермента нагреванием с последующим отделением продуктов гидролиза и сушкой, отличающийся тем, что, с целью унификации и упрощения способа, увеличения выхода целевого продукта, улучшения его качества за счет повышения доли среднемолекулярных пептидов с мол. м. 500 1500 Д, в качестве ферментных препаратов используют щелочную или нейтральную протеазы Bacillus subtilis Г 3х и Г 10х, при этом гидролиз проводят при гидромодуле из расчета содержания сухого вещества в суспензии 10 24% до максимального накопления полипептидов. 2. Способ получения пептона по п.1, отличающийся тем, что в качестве белкового сырья дополнительно используют жмых печени и жмых мукозы. 3. Способ получения пептона по п.1, отличающийся тем, что оптимум величины рН для действия бактериальных протеаз устанавливают гидроксидом кальция и фосфорной кислотой.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3