Способ получения производных резоруфина

 

Изобретение относится к гетероциклическим соединениям, в частности к получению производных резоруфина формулы 1а или 16 .СНЛ,С(0)ЦЦ ( где RI- Нили С1 в положении 2; H или С|-Сд-алкил; Кэ - Н, С(-С4-алкил или С1; Кд - Н или R -fR -аннелированное фенильное кольцо; или 2; LI -N-CHu-CHu-N -CHu-CHfc, -N(CHs)-CHft-COO - или -С(0)-СН-СН,г-СНй-К-в свободном виде. 9 ил, -СН4-СНе;1,с-связь, -С(0)-(, где ,2 штиЗ, -NH-NHCHuCH 2-,-C(0)CHaCHe- -С(0)-, -С(0)СН(ОН)СН(ОН)С(0)-; А - радикал, образованный из гидантоина, дифенилгидантоина, трет-бутилоксикарбонил-Ь-тироксина, фенобарбитала , эстрадиола, 7-теофиллина, диг гоксигенина, дигоксигенинмонодигитоксозида, З-амино-3-дезокситетраиодотироуксусной кислоты, тироксинметилового эфира или ксантина, причем радикал - (CH$)m-C(O)-L4-L$-A при находится в положении 4 и при - в положении 2, а в случае и п 0,8-6,4 L Н(СНа)СН«Ј(0) - или -С(О) - CH-CH -CHfc-N-CH -CHfc; Le - простая связь и А - радикал, образованный из иммуноглобулина G, которые являются флуоресцирующими метками низкомолекулярных или высокомолекулярных соединений. Цель - разработка способа получения указанных соединений . Получение ведут из соединения формул 1а и 16, где , вместо заместителя LЈA имеется реакционноспособный радикал , С1 или -О- -N-C(0)-CH$-CH2-C(0), и соединения формулы X4L(jA, где L. jj А - укаэано выше; Х4 - Н или (0)-CHg- (О), причем активные радикалы соединений могут иметь защитные группы , которые при необходимости удаляют с выделением целевого продукта (Л в свободном виде. 9 ил, 1 табл. Од Ю 00 04

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

РЕСГЮЬЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ аааа а Ь ji

БИБд

Н IlATKHTV

В 4 Rl (cH ) c(o)l. ., h

В

"з (CHz)C(O)2-,2-, Л

0 0 ОН

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНЯТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4027894-04 (22) 24.07.86 (31) Р 3526565.5 (32) 25.07.85 (33) DE (46) 15.01.92, Бюл. Р 2 (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (DR) (72) Кристиан Кляйн, Ханс-Георг Батц и Руперт Херрманн (DH) . (53) 535.426.07(088.8) (56) Landon J. Kernel R.S. - Immunoassays, 80 s., Univ. Park Press, Baltimore. Nd., 1980, Seite 91-112. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ

РЕЗОРУФИНА (57) Изобретение относится к гетероциклическим соединениям, в частности к получению производных реэоруфина формулы la или Хб где R - Й или Сl в положении 2; К ьь - Н

Ci -C4-aJIKHJI ó R»> — Нь С -Сд-алкил или Cl; R4 - Н или Кз+К -аннелированное фенильное кольцо; m 0 или 2; а=*1; ь --N-сн -сн -N -сн„-сн, -N(cHy)-CHq-СОΠ— -С(о) -СН-Щ -СН -N„,80„„1621811 A 3 (Я)5 С 07 D 265/38, 413/12, С 07 J 71/00//(С 07 D 265/38

С 07 С 270 20 237 ° 22) 2 -CH<-СНф 1.<-связь, -С(0)-(СЩ -, где

: Р 1 ° 2 или Зь -NH NHCHqCHg C(0)CHgCHy

--С (О) -, -С(О) СН(ОН) СН(ОН) С(0) -;

А радикал, образованный из гидантоина, дифенилгицантоинаь трет-бутилоксикарбонил-Ь-тироксина, фенобарбитала, зстрадиола, 7-теофиллина, ди." гоксигенина, дигоксигенинмонодигитоксозида, З-амико-З-.деэокситетраиодотироуксусной кислоты, тироксинметилового эфира или ксантина, причем радикал — (СН }„,-С(О)-Ь -2.q-А при m 0 находится в положении 4 и при ш2в положении 2, а в случае mW и и= а. .: -.кинвиа)

-с(О) - сн-сн -сн„-N-сн,-сн, 2. простая связь и А — радикал, образованный из иммуноглобулина G, которые являются флуоресцирующнми метками низкомолекулярних или высокомолекулярных соединений. Цель — разработка способа получения укаэанных соединений. Получение ведут из соединения формул Ia и ?б, где и 1, вместо заместителя ЬоА имеется реакцнонноспособный радикал Х =нь Сl или -0-Я-С(О)-СН -СНо-с(О), и соединения форм пи Х 2, A, где 2.ьь и А - указано вине; Хg - Н или -О-N-С(О)-СН12ч % О), причем активные Ваникаиы соединений могут иметь защитные группы, которые при необходимости удаляют с виделением целевого продукта в свободном виде. 9 илеь 1 табл.

1621811

НО

О

Изобретение относится к хиэии гетероциклических соединений, в частности к способу получения новых производных резоруФина общей Формулы Ха . или Хб

В 4 . R1, (сн,) с(оЩ., 8 О

В п

В 4 R1

R (CИ ) иС(О) aй

ОН

Rg . я

1 где R - Н или Cl и полевении 2!

Я или G -(; ф алкил1 °

- я, С1-С4-алкнл или О3

R - Н нли R® u R4 вместе образу ют аннелированное сенильное кольцо, avO или 2;

1е -, -н1

СН3

1 сб зО, С (С Н )р

11

2 р 1, 2 или 8, — ин —,-янсн,сн;, С н;СН2С вЂ”,-CCH(OH) CH(OH) c

)!

О

А - радикал, образованный из гидантоина, ди Ьенилгидантоина, трет-бутилокси кар боннл-Й- тироксина, Аенобарбитала, эстрадисла, 7-теоджллина, дигоксигеннна, дигоксигенинмонодигитоксозида, З-амино-.З-дезокситетрайодотироуксусной кислоты, тироксинметилового эАира или ксантина, причем радикал -(СН )„-L L -А при

m 0 находится в полокении 4 и нри m 2 в полокенин 2, а в случае ш0 и п 0,8-6,4 p — МСН2С или — N С-! I

CHç 0 О

i Ь - простая связь и А - радикал, . образованный из иммуноглобулина G которые являются д луоресцирующими метками низкомолекулярных или высокомолекулярных соединений и могут быть использованы в медицине в Флуорес"., центном иммуноанализе для определения концентрации гаптена или антигена в пробе крови.

Целью изобретания является получение новых производных резору4жна общей формулы Х, которые в качестве

Фиуоресцируияв1х меток низкомолекуляр™

НЫХ ИЛИ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ позволяют повысить чувствительность и точность определения концентрации компонентов проб крови.

Поставленная цель достигается тем, что соединение общей формулы ХХа или ХХб где R -R4, m u Lq имеют указанные виие значения

X(- Í, СХ нли — О—

1621811 подвергают взаимодействию с соединением общей формулы Т1Х

)Xz I-g A имеют указанные выше зна5 где f„z и А ч ения, 10

Xe- H или

О причем активные радикалы соединений

IIa или ТХб и III могут иметь защит- 15 ные группы, которые при необходимости удаляют, с выцелением целевого продукта в свободном виде.

На фиг. 1 " 9 представлены кривые, поясняющие способ. 20

Пример 1. (3-(1-ДиАенилгидантоинил) пронионил1пиперазид резоруфин4-кар боновой кислоты. а.. Реэоруфин-4-карбоновая кислота.

16 г нитрозорезорцнна, 15,5 г 2,6- 25 диоксибензойной кислоты и 8,6 пиролюзита суспендируют в 200 мп метилового спирта, после чего суспензию охлажпают до О С. Затем к суспензии прибавляют по каплям 10,6 мп концентрирован- 30 ной серной кислоты, после чего смесь дополнительно перемешивают в течение

2 ч при комнатной температуре. Выделившуюся в виде окрашенного в красный цвет осадка резапурин-4-карбоновую кислоту отфильтровывают, промыва35 ют метиловым спиртом и сушат.

Производное диаз резорцина раство-. ряют в 200 мл воды и 50 мп 25Х-ного раствора аммиака и раствор Аильтруют.

К окрашенному в голубой цвет Аильтрату при охлаждении льдом прибавляют порциями 50 r цинковой пьши, причем реакционной смеси дают воэможность нагреться до комнатной температуры.

За ходом восстановления легко следить с помощью хроматограАии в тонком слое (элюирующее средство:метиловый спиртэтиловый эфир уксусной кислоты в соотношении 1:1; DC-пластины с силикагелем). Реакционный раствор Аильтруют, а затем фильтрат подкисляют ледяной уксусной кислотой и небольшим количеством концентрированной соляной кислоты. Выделившуюся в осадок Резоруфин4-карбоновую кислоту отфильтровывают и сушат в вакууме над пятиокисью Аосфора.

Выход 16,33 г.

Н (силикагель, элюирующее средст-. во: н-бутиловый спирт — ледяная уксусная кислота — вода в соотношении 4:1:

: 1) =0,4.

N,0,0-ТРиацетилдигидРоРезоРУ фин-4-карбоновая кислота.

12,9 r резоруАин-4-карбоновой кислоты растворяют в 30 мп ледяной уксусной кислоты и 30 мл ангидрида уксусной кислоты, раствор смешивают с 27,6 r хлорида олова (II) ° после чего смесь перемешивают в течение f ч при 80 С. Затем реакционную смесь выливают в 600 мл воды со льдом, производят перемешивание в течение 1 ч, после чего осадок отфильтровывают.

После сушки твердое вещество растворяют в 500 мп ацетона. Раствор фильтруют и фильтрат упаривают, в результате чего получают после сушки

11,3 г продукта. Н-ЯИР((Д)4-ДИСО),Д 2,24, 2,26 и 2,29 (по S, 9Н); 6,94 (dd, J=8,5 и 2,2 Гц, 1Н); 6,98 (d, J=2,2 Гц, 1Н);

7,04 (d, J=9 Гц, 1Н); 7,61 (d, J=

=8,5 Гц, 1Н); 7,67 (d, J=9 Гц, 1Н) млн

gg (силикагель, элюирующее сред-. ство: хлороАорм — метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:

:0,1)=0,46. в. Хлорангиприд N,О,О-триацетилдигидрорезоруфин-4-карбоновой кислоты.

38,5 r триацетата, описанного в примере 1б, смешивают с 54 мл оксалилхлорида и смесь охлаждают до 0 С.

К охлажденной смеси прибавляют несколько капель диметилАормамида, после чего смеси дают возможность нагреться до комнатной температуры, При этом растворение твердого вещества сопровождается выделением rasa.

Реакционную смесь упаривают в вакууме досуха, по три раза продукт растворяют в 200 мп сухого хлористого метилена и раствор вновь упаривают досуха.

Выход 41 г.

r. N-трет-Бутилоксикарбонил (БОК)пиперазин.

12,61 г N-бензгидрилпиперазина (EMPA-chemic) растворяют в 100 мл смеси 1,4-диоксана и воды, взятых в соотношении 3: 1. К приготовленному раствору прибавляют по каплям раствор

12,0 г ди-трет-бутилдикарбоната в

1621811

50 мл 1,4-диоксана. Смесь перемешивают в течение 0,5 ч, затем прибавляют к ней по каплям 50 мл воды, фильтруют, после чего осадок сушат, Выход 16,2 r N-БОК-N -бензгидрилпиперазина.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:

:0,1)=0 92.

7 г N-БОК-N -бензгидрилпипвразина растворяют в 100 мл этилового эфира уксусной кислоты и 5 мл ледяной уксусной кислоты. Производят гидрирование в присутствии 0,3 r палладия на активированном угле, после чего катализатор отфильтровывают, а фильтрат упаривают. Полученный остаток смешивают со 100 мл воды и 20 мл 1 н.

20 раствора соляной кислоты, фильтруют, фильтрат дважды экстрагируют этиловым эАиром уксусной кислоты, а затем водную Аазу доводят до основной .реакции путем прибавления раствора гидро- 21 окиси натрия. Выделившийся в осадок маслообразный продукт экстрагируют дихлорметаном. После сушки органической фазы над сернокислым натрием и упаривания получают 3,2 г N-БОК-пипе- >0 разина в виде маслообразного вещества, которое спустя несколько суток полностью закристаллизовывается.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1)=

3S

=0,05 с нингидрином становится синим. д. Ы -Бок-пиперазид N,О,О-триацетилцигидрорезоруфин"4-карбоновой кислоты.

К 25 г хлорангидрида кислоты, описанного в примере 1в, и 17,3 мл триэтиламина в 450 мл дихлорметана при

О С прибавляют по каплям раствор

13 8 г N-БОК-пиперазина в 50 мл диЭ 45 хлорметана. Реакционную смесь дополнительно перемешивают в течение 1 ч без охлаждения, затем три раза экстрагируют водой, после чего органическую Аазу упаривают.

Выход 36,0 r.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороАорм — метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1)=

=0,64.

«э5 е. N -БОК-пиперазнд N-ацетилдигид-, рорезоруАин-4-карбоновой кислоты.

34,3 г триацетата, описанного в примере 1д, и 17,1 r сульфита натрия перемешивают в течение 1 ч при 60 С в 500 мл смеси 1,4-диоксана и воды, B3BTblx B соотношении 1: 1 . После этогс реакционную смесь упаривают, остаток растворяют в этиловом эфире уксусной кислоты, раствор отАильтровывают от нерастворимой соли, после чего фильтрат хроматограАируют на 2 л силикагеля (элюирующее средство:этиловый эфир уксусной кислоты — дихлорметан в соотношении 4:1, как только начинает вымываться продукт, переключаются на чистый этиловый эАир уксусной кислоты).

Выход 14 r, Rf (силикагель, элюирующее средство:этиловый эфир уксусной кислоты— дихлорметан в соотношении 4:1)=0,28.

t ж. N -БОК-пиперазид резоруАин-4карбоновой кислоты.

5 г N-ацетильного соединения, описанного в примере 1е, растворяют в

200 мл метилового спирта и 600 мл воды. К приготовленному раствору прибавляют 1,8 г кислого углекислого натрия и 10,7 мл 1 н. раствора гидроокиси натрия, а затем 14 г калийгексацианоферрата. Реакционную смесь перемешивают в течение 0,5 ч при комнатной температуре, после чего рН смеси доводят до 5. Выделившийся в осадок продукт отфильтровывают с применением вакуума.

Выход 2,72 r, Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9: 1:0,1)=

=0,28. з. Трифторацетат пиперазида реэоруфин-4-карбоновой кислоты.

1 r БОК-производного, описанного в примере 1ж, выдерживают в течение

15 мин в 20 мл триАторуксусной кислоты. Затем реакционную смесь упарива-, ют, остаток обрабатывают диэтиловым эфиром, после чего продукт отфильтровывают.

Выход 0,96 r.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороАорм — метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) =

=0,02. и. Взаимодействие пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эАиром 3-(1-дифенилгидантоинил)пропионовой кислоты.

191 мг трифторацетата, описанного в примере 1з, и 210 мг N-оксисукцини1621811!

О мндного эфира 3-(1-дифенилгидантоинил)пропионовой кислоты (получен из натриевой соли дифенилгидантоина и этилового эфира 3-бромпропионовой кислоты) перемешивают в течение 15 ч в 20 мп диоксана и 20 мл О, 1 М калийФосфатного буферного раствора с рН 8,5. Выделившийся в осадок продукт отфильтровывают, фильтрат упаривают к хроматографируют остаток на силккагеле КР 18 (элюирующее средство: изопропиловый спирт), в результате чего получают дополнительное количество продукта. Продукт кристаллизуют из смеси этилового эфира уксусной кислоты и метилового спирта, в результате чего суммарно получают 250 мг сопряженного продукта.

Rf (силикагель, элюирующее средст-20 во: хлороформ-метанол-ледяная уксус1 ная кислота в соотношении 9:1:0,1)=

=0,61. Н-ЯМР{Я -ЛМСО),8: 2,6-2,8 (m, 2H); 3 ° 0-3,8 (mý 1OH)1 ;6э74 (dу J= 25

=2,2 Гц, 1Н); 6,82 (d, J=9.,5 Гц, !Н);

6,91 (dd, J=.9,5 и 2,2 Гц); 7,25-7,33 (ш, 10Н), 7,55 и 7,66 (no d, J=9,5 Гц, 2Н) млн.

УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный бу- 30 ферный раствор с рН 7,5): и ц„ =

=576,8 нм.

Эмиссия флуоресценции: "jlщд д =

=592 нм.

П р н м е р 2. Взаимодействие пипе-.5 ! разида резоруфин-4-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эфиром 3«(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты.

По аналогии с описанным в примере

1и из 365 мг трифторацетата пиперази-gp да резоруфин-4-карбоновой кислоты и

339 мг N-оксисукцинимидного эфира

3-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты получают 210 мг (2-дифенилгидан-. тоинилметилкарбонил)пиперазида резоруФин-4-карбоновой кислоты.

Ы (силикагель, элюирующее средство: н-бутанол - ледяная уксусная кислота — вода в соотношении 4:1:1)=0,82.

Н ЯМР (ЕОь ТИСО) 8: 3 2 4 5 (ш 5

10Н); 6,60 (d, J=2,4 Гц, 1Н); 6,71 (d, J 9,5 Гц, 1H) 6,80 (dd, J=9,05 и 2,04 Гц, 1H); 7,39 ("S", 10H) 7,52 (d, J=9,5 Гц, 1Н); 7,61.(d, J=9,0 Гц, 1Н); 9,65 (S, 1Н) мпн.

УФ!ЧТ$ (0,1 М калийфосфатный буферный раствор, рН 8,0): р акс =575,4 нм.

Эмиссия флуоресценции: 9 ча„с

592 нм.

Пример 3. Взаимодействие пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эфиром N-БОК-L-тироксина.

По аналогии с описанным в примере

1и из 212 мг трифторацетата пиперазкда резофурин-4-карбоновой кислоты и 419 мг N-оксисукцинимидного эфира

N-БОК-L-тироксина получают 320 мг продукта.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:

:0,1) 0,58.

N-Оксисукцкнимидный эфир N-БОК-Lтироксина получают следующим образом. а) N-БОК-тироксин.

Раствор 10 г (12,5 ммоль) натриевой соли L-тироксина Н О в смеси, состоящей из 300 мл смеси диоксана и воды в соотношении 2:1 и 15 мл 1 н. раствора гидроокиси натрия, смешивают с 3 r (13,75 ммоль) ди-трет-бутилдикарбоната (БОК)дО, после чего реак. ционную смесь перемешивают в течение

2 ч при комнатной температуре в усло-. виях, исключающих доступ света.

Прибавлением 2 М раствора КН$0 рН смеси доводят до 2, смесь экстрагируют этиловым эфиром уксуснойкислоты, экстракт, представляющий собой раствор продукта в этиловом эфире уксусной кислоты, промывают водой, сушат над сернокислым натрием и упаривают. Твердый остаток растирают с петролейным эфиром, отфильтровывают продукт с применением вакуума и сушат в эксикаторе.

Выход 9,45 г (86Х от теоретически рассчитанного значения).

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ — лигроин - уксусная кислота в соотношении 6:3:1)=0,6. б. N-Оксисукцинимидный эфир N-БОКтирокскна.

К раствору 8,8 r Ь-БОК-тироксина в 200 мп диметилового эфира этиленгликоля прибавляют 1,2 г (9,5 ммоль)

N-оксисукцинимида. Раствор охлаждают до !О С, после чего его смешивают по каплям с раствором 2,3 r (9,9 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 40 мл диметилового эфира этиленгликоля. Реакционную смесь перемешивают в тече-, ние 2 ч при комнатной температуре, вьделившуюся в осадок дициклогексилмочевину отфильтровывают с применением вакуума, после чего фильтрат упарива1621811

12 ют в вакууме .при 40 G. Полученный остаток растирают с изопропиловым спиртом и отфильтровывают с применением вакуума, а затем сушат в эксикаторе при комнатной температуре.

Выход 9, 19 r N-(Н-ВОС-L-тироксин) пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты (94K от теоретически рассчитанного значения), общий выход по отноше- 0 нию к тироксину 81Х.

М (НРП.С-RP 18; элюирующее средство: нитрометан - этанол в соотношении

9:1) 0,8 или (HPTLC-RP 18; элюирующее средство; ацетонитрил - вода в соот" ношения 8:2)=0,6.

H-ЯМР Щ ЛИСО),8: 1,36 (S, 9Н);

2в81 (Я» 4Н)1 2э9 3 ° 2 (ше 2Н)в 4в54 9 (m, 1Н); 7 08 (S, 2Н); 7 63 (d, J=9 Гц, 1Н); 7,90 (S> 2Н)1 9,2 (8, 1Н) млн

Пример 4, Сопряжение пиперазида реэоруфин-4-карбоновой кислоты с

3-0- 1.3-(N-сукцинимидоксикарбонил)про- пил 3экстрадиолом.

По аналогии с описанным в примере 1и из 212 мг трифторацетата пиперазида реэофурин-4-карбоновой кислоты и

220 мг 3-0- (3-(N-сукцинимидилоксикарбонил)пропил эстрадиола получают 30

295 мг N- (3-0-(3-карбонил)пропил эстрадиолилпиперазида резоруфин-4карбоновой кислоты.

Rf (снликагель, элюирующее средстI во: хлороформ — метанол — ледяная ук35 сусная кислота в соотношении 9:1:0,1)=

=0,58.

3-0- (3-(N-Сукцинимидоксикарбонил) пропигДэстрадиол . получают обычным способом иэ 3-0-карбоксипропилэстра- 40 диола (получен из эстрадиола и броммасляной кислоты).и М-оксисукцинимида в при»утствяи дициклогексилкарбодиимида.

Пример 5. Сопряжение пипераэи-45 да резоруфин-4-карбоновой кислоты с

И- 3-(И-сукцинимидоксикарбонил)пропил фенобарбиталом.

По аналогии с описанным в примере 1и из 212 мг три@торацетата пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты и

205 мг N- tj-(N-сукцинимидоксикарбо" нил)пропил фенобарбитала получают

220 мг fN-(3-карбонил)пронял1фенобар« битала резоруфин-4-карбоновой кислоты.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9;1:0,1)=

=0,45„

N-13- (N-Сукцинимидоксикарбонип) пропил фенобарбитал получают обычным способом из фенобарбитап-1-масляной кислоты и N-оксисукцинимипа в присутствии дициклогексилкарбодиимнца. . Пример 6. Сопряжение пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эфиром теофип" лин-7-пропионовой кислоты.

Из 212 мг трифторацетата пиперазида реэоруфин-4-карбоновой кислоты и

175 мг N-оксисукцинющпного эфира теофкллин-7-пропионовой кислоты получают по аналогии с описанным в примере 1 и 200 мг N-(теофиллин-7-пропионил) пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:

:0,1)=0,44.

М-0ксисукцинимидный эфир теофиллин-7-пропионовой кислоты получают обычным способом из теофиллин-7-про-. пионовой кислоты и Я-оксисукцинимида в присутствии дициклогексилкарбодиимипа.

Пример 7. Сопряжение N-оксисукцинимнцного эфира N-(4-реэоруфинил-карбонил)саркоэина с 1-(2-амидоэтил)дифенилгидантоииом. а. (трет-Бутоксикарбонилметил)метиламид N,О,О-триацетилдигидрорезоруфин-4-карбоновой кислоты.

10 .г хлорангидрида кислоты, описанного в примере 1в, вводят во взаимодействие по аналогии с описанным в примере 1д с трет-бутиловым эфиром саркозина.

Выход 7,5 г.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9:.1:0,1)=

=0,72. б. (трет-Бутоксикарбонклметкл)метилавщц N-ацетилдигидрорезоруфин-4карбоновой кислоты.

7,5 г продукта, описанного в примере 7а, деацетилировали по анлогии с описанным в примере 1ж.

Выход 5,2 r. й: (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная.уксусная кислота в соотношении 9: 1:0,1)

0,56. в; (трет-Бутоксикарбонилметил)метиламид резору@ин-4"карбоновой кислоты.!

13

1621811

4,5 г продукта, описанного в примере 7б, вводят во взаимодействие по аналогии с описанным в примере 1ж.

Выход 2,6 r.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:О, 1)=

=0,64. г. N-(карбоксиметил)метилами ц резоруфин-4-карбоновой кислоты.

0,55 г продукта, описанного в примере 7в, выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре в 6 мл три фторуксусной кислоты. Затем реакцион- 15 ную смесь упаривают досуха, остаток растирают с диэтиловым эфиром, после чего продукт отфильтровывают.

Выход 0,45 r.

Rf(силикагель,,элюирующее средст- >0 во: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1)=

0,11. д. И -оксисукцинимидный эфир N-(4резоруфинилкарбонил)саркозина. 25

200 мг продукта из примера 7 в те:. -чение 14 ч перемешивают с 72 мг N-оксисукцинимида и 138 мг дициклогексилкарбодиимида в 40 мл тетрагидрофурана.

Выделившуюся в осадок мочевину от- 30 фильтровывают, фильтрат упаривают и полученный остаток хроматографируют на силикагеле RP 18 (элюирующее средство: нитрометан - этаиол в соотношении 4:1).

Выход 150 мг.

Rf (силикагель RP-18, элюируннцее средство: нитрометан - этанол в соотношении 4:1)=0,79. е. Сопряжение N -оксисукцинимидного эфира N-(4-резоруфинилкарбонил)саркозина с 1-(2-аминоэтил)дифенилгидантоином, 125 мг К-оксисукцинимидного эфира из примера 7д перемешивают в течение

1 ч с 90 мг 1-(2-аминоэтил)дифенилгидантоина в 40 мл смеси, состоящей

ps диоксана и KBJIHHAOGABTHoro буферного раствора с рН 8,5, взятых в соотношении 1:1. Диоксан отгоняют от реакционной смеси, к остатку прибавляют аммиак до полного изменения цвета, производят Фильтрование, после чего из фильтрата осаждают продукт прибавлением соляной кислоты.

Выход N-(4-реэоруфинкарбонил) саркосинил-1- (2-амино этил) дифенипгидантоина 110 мг.

Rf (силикагель, элюирующее средство: н-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода в соотношении 4:1: 1)=0,78.

УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный буферный раствор, рН 8,0): я а с =

=575 нм.

Эмиссия флуоресценции: 3 дквп

=572 нм.

Пример 8. 2-(1-Дифенилгидантоинил)этиламид резоруфин-4-карбоновой кислоты. а. 2-(1-Дифенилгидантоинил)этиламид N,О,О-триацеткпцигицрорезоруфин4-карбоновой кислоты.

По аналогии с описанным в примере 1д 1,37 г 1-(2-аминоэтил)дифенилгидантоина вводят во взаимодействие ,с 1,2 г хлорангидрида И,О,О-триацетил-г !

:дигидрорезоруфинкарбоновой кислоты.

В результате получают 1,9 г продукта в виде слабо окрашенного пенообразного вещества., б. 2-(t-Дифенилгидантоинил)этиламид резоруфин-4-карбоновой кислоты.

Полученный в примере 8а продукт окислительно деацетилируют по аналогии с описанным в примерах 1е и 1ж.

Из 1,9 г вещества поЛучают 600 мг

N- 2-.(1-диФеиилгидантоинил)этилЯреэо. руфин-4-карбоновой кислоты.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ — метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9: 1:

:0,1)=0 68.

1Н-ЯИР ((Lq6 -ДМСО),8: 3,2-4,6 (m, 4Н); 6,73 (d, J 2,2 Гц, 1Н); 6,84 (d, J=9,5 Гц, tH); 6,86 (dd, Я=9,5 и

2,2 Гц, 1Н); 7,2-7,4 (m, 10Н); 7,62 и 7,66 (no d, J 9,5 Гц, 2Н); 8,66 (t, широкий, J=5 Гц 18); 9э58 (Sý

1Н) млн"

УФ/VIS .(О ° 1 М калийфосфатный буферный раствор, рН 8,0): шаг= 575 им.

Эмиссия флуоресценции: $

=591 нм.

Пример 9. Сочетание пиперази да 6-метилрезоруфин-4-карбоиовой кис ,лоты с N-окснсукцинимидним эфиром

2-(1-дифеиилгидантоинил)уксусной кислоты. а. 2-Метил-4-ннтрозорезорцин.

19,8 r 2-метилрезорцина и 13,4 г гидроокиси калия растворяют в 120 мп этилового спирта, после чего раствор осаждают до 5 С. После этого к . охлалценному раствору прибавляют по каплям 24 мп изопентилнитрила, смесь

1621811

16 перемешивают в течение 3 ч, после чего отфильтровывают образовавшийся осадок. Окрашенное в желтый цвет твердое вещество перемешивают в

200 мл 5 н. раствора серной кислоты.

При этом в осадок выделяется окрашенный в светло-желтый цвет продукт.

Выход 22 r.

Rf (силикагель) элюирующее средст- 10 во: хлороформ — метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9: 1:О, 1)=

0,53. б. 6-Иетилреэапурин-4-карбоновая кислота. 15

15,3 r 2-метил-4-нитрозореэорцина, 15,4 г 2,6«диоксибензойной кислоты, 8,8 r пиролюзита и 11 мп концентрированной серной кислоты вводят во взаимодействие по аналогии с описанным в 20 примере 1а.

Выход 28,7 г.

Rf (силикагель),элюирующее средство: хлороформ — метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 5

-"О, 15. в. К,О,О-Триацетил-б-метилдигидрорезоруфин-4-карбоновая кислота.

Из 10 r 6-метилрезапурин-4-карбоновой кислоты, 19,8 г хлорнда оло". ЗО ва (II), 20 мл ангидрида уксусной кислоты и 150 мл ледяной уксусной кисло» ты получают по аналогии с описанным в примере 1б непосредственно триацетилированное лейкосоединение. Неочищен,5 ный продукт очищают путем обработки кипящим ацетоном.

Выход 7,3 r.

Rf (силикагель) элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная 40 уксусная кислота в соотношении 9: 1:

:0,1)=0,51.

Н-ЯИР ((Д -ДИСО),8: 2) 10) 2) 25)

2,29; 2.33 (по 12Н); 7,00; 7,09; 7,50 и 7,74 (по d) J 8)8 Гц, 4Н) млн . )5

r. K -BOK-пипераэид N )0,0-триацетнл-6-меткпдигидрорезоруфин-4-карбоновой кислоты.

По аналогии с описанным в примерах

1г и 1д из 5 г N,О,O-триацетил-б-метилдигидрореэоруфин-4-карбоновой кислоты, 10,7 мл оксалилхлорида и 2 r (N-БОК-пиперазина получают 3 г продукта.

М (силикагель) элюирующее средст-55 во: этиловый эфир уксусной кислоты)=

**О, 57. д. Трифторацетат пиперазида 6-метилреэоруфин-4-карбоновой кислоты.

1 г триацетильного производного, описанного в примере 9г, вводят во взаимодействие по аналогии с описанным в примерах 1ж и 1з.

Выход 0,43 r. е, Взаимодействие пипераэида 6-метнлрезоруфин-4-карбоновой кислоты с

К-оксисукцинимндным эфиром 2-(1-дифеннлгндантоинил)уксусной кислоты.

222 мг соединения, полученного в примере .9д, вводят во взаимодействие с 200 мг N-оксисукцинимидного эфира

2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты.

Выход N- ((1-дифенилгидантоинил)метилкарбонил пиперазида 6-метилрезоруфин-4-карбоновой кислоты 250 мг.

УФ/ЧТЯ (О, 1.И калийфосфатный буфер раствор, рН 8, О): $ „с =584 нм.

Эмиссия флуоресценцни: $> << =

=600 нм.

Пример 10. Взаимодействие пиперазида 9-окси-5-беиэо(а) феноксаэон8-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эфиром 2-(1"дифеннл-гидантоинил)уксусной кислоты. а. 12-Оксид 9-окси-5-бензо Ea) феноксаэон-8-карбоновой кислоты.

2,84 г 1,3-диокси-4-нитрозонафталина, 2,31 г 7)6-диоксибензойной кисло ты) 1,29 r пиролюзита .и 1,6 мл кон-, центрированной серной кислоты вводят во взаимодействие по аналогии с описанным в примере 1а.

Выход 2,8 r.

Rf (снликагель) элюирующее средство: н-бутанол - ледяная уксусная кислота — вода в соотношении 4:f:1)=0,63. б. 12-Ацетил-5,9-диацетоксибензо(а)феноксазон"8-карбоновая кислота.

По аналогии с описанным в примере 9в из 2,4 r 12-.оксида 9-окси-5бензо (а)феноксазон-8-карбоновой кисло" ты получают 1,8 г триацетилированного дигидросоединения.

Rf (силикагель) элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:

:0,1)=0 31. в. N -БОК-пиперазид 12-ацетил-5,9диацетоксибенэо (а феноксазил-8-карбоновой кислоты.

1,6 г триацетильного соединения, описанного в примере 10б, вводят во взаимодействие по аналогии с примером .9г с оксалилхлоридом и К-БОК-пиперазином.

Выход 1,2 r.

1621811

17

18 H-ЯМР (СВСа,),E: 1,49 (S, 9H):

1,1?, 2,27, 2,46 (по S, 12Н); 3,03,9 (m ЯН); 7,03 (d J 9 Гц, 1Н);

"7,16-7,94 (m, 6Н) млн

I г. N — BOK-пиперазид 9-окси-5-бензо(а феноксазон-8-карбоновой кислоты.

Ло аналогии с примером 1е из

0,93 r триацетильного соединения, полученного в примере 10в, получают 10

0,51 г продукта.

Rf (снликагель, элюирующее средство; хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1)=

=0,69.

5 д. Трифторацетат пипераэида 9-окси-5-бензо(а феноксазон-8-карбоновой кислоты

Из 0,5 г БОК-защищенного соединения, описанного в примере 10r по аналогии с примером 1э получают 0,5 r продукта.

Rf (снликагель, элюирующее средст во: хлороформ - метанол - ледяная ук 5 сусная кислота в соотношении 9: 1:О, 1}=

=0,02. е. Сопряжение пиперазида 9-окси-5бензо(а)феноксазон-8-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эфиром

2-(1-дифенилгндантоинил)уксусной кис- 30 .лоты.

Из 50 мг пиперазида, полученного в примере 10д, и 150 мг N-оксисукцннимидного эфира 2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты получают по ано- 35 логии с примером 1и 70 мг N- f(1-дифенилгидантоинил)метнлкарбонил)пиперазида 9-окси-5-бензо jB) феноксазон-8карбоновой кислоты.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:

:0,1)=0,57.

УФ/ЧХБ {О, 1 М калийфосфатный буферный раствор, рН 8э,O): 3юакс=

=560 нм.

Эмиссия флуоресценции: lI я = .=615 нм.

Н-ЯМР ((Д)6-ДИСО),8: 3, 0-4, 5 (ш, 10Н); 6,37 ($, 1Н); 6,80 (d, J=8 Гц, и 1Н); 7,2-7,35 (тп, 10Н); 7,35-8,0 (m, 3Fl); 8,10 (dd, J=8 и 2 Гц, 1Н);

856 (dd, J8 Гц, 1Н); 960 (S, 1Н)

1 мпн

Пример 11. (1-Лифенилгидантоиннлметилкарбонил)пиперазид 8-этилреэоруфин-4-карбоновой кислоты. а. 6-Этил-4"нитрозорезорцин.

По аналогии с описанным в примере

9а из 7,5 г 4-этилрезорцина, 4,5 гидроокиси калия и 8 мл изопентилнитрила получают 6-этил-4-нитрозорезорцин в вине окрашенного в желтый цвет твердого вещества.

Выход 7,5 r °

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ — метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:

: О, 1) =0,37. б. 8-Этилрезоруфин-4-карбоновая кислота.

По аналогии с описанным в примере 1а из 7,4 r 6-этилнитроэореэорцина, 6,8 r 2,6-диоксибенэойной кислоты, 3,9 г двуокиси марганца и 5 мп концентрированной серной кислоты получают после восстановления с применением 8 r цинковой пыли 9,5 r продукта.

Rf (силикагель, элюирующее средст-. во: хлороформ - метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1)=

0,05. в. N -БОК-пиперазид N,О,О-триацетил-8-этилцигидрорезоруфин-4-карбоновой кислоты.

По аналогии с примером 1б из 7,7 г

8-этилреэоруфин-4-карбоновой кислоты, 15,4 г хпорида олова (II), 30 мп ледяной уксусной кислоты и 15,3 мп ан- . гидрида уксусной кислоты получают

N,0,0-триацетил-8-этилрезоруфин-4-карбоновую кислоту, которую в виде неочищенного продукта подвергают дальнейшей переработке по аналогии с примером 1в,непосредственно в хлорангидрид кислоты и по аналогии с приме ром 1д - в БОК-пиперазщ .

Выход 4 r.

Rf (силикагель, .элюирующее средство: хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1)=

=0,86. г. N -БОК-пипеГазид 8-этилрезоруl» фин-4-карбоновой кислоты.

Из 4 г Nt-БОК-пиперазнда N,О,Отриацетил-8-этилдигидрорезоруфин-4-. карбоновой кислоты получают по аналогии с примерамн 1е и 1ж N -БОК-пипе-! разид соответствующей карбоновой кислоты.

Выход 0,5 г.

Rf (силикагель,,элюирукнцее срадст во: хлороформ — метанол — в соотношении 4:1) 0,67. д. Трифторацетат пиперазида 8-этилрезоруфин"4-карбоновой кислоты.

1671811

30

330 мг соответствующего BOK-пиперазида выдерживают в течение 1,5 ч в 35 мл смеси, состоящей из дихлорметана и трифторуксусной кислоты, взятых в соотношении 6:1. Полученный после упаривания остаток обрабатывают диэтиловым эфиром, продукт отфильтровывают с применением вакуума и сушат.

Выход 350 мг.

Rf (силикагель, элюирукяцее средство: бутанол — ледяная уксусная кислота — вода в соотношении 4:1 1)=0,33. е. Взаимодействие с Я-оксисукцинимидным эфиром 2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты.

По аналогии с примером 1 и иэ

325 мг трифторацетата пиперазида 8этилреэоруфин-4-карбоновой кислоты и 435 мг N-оксисукцинимидного эфира

2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты получают 120 мг продукта.

Rf (силикагель, элюирукяцее средство: хлороформ - метанол - ледяная 25 уксусная кислота в соотношении 9:1:

:0,1)=0,43. и-ЯМР ((Д„Д-ДМСО),о: 1,15 (Е, J=

=7,2 Гц, ЗН); 2,52 d, J 7,2 Гц, 2Н)1

3,1-4,0 (m, 8Н); 4,25-4,45 (m, 2Н);

6,42 (Б, широкий, 1Н); 6,94 (d, J=

=9,0 Гц, 1Н); 7,3-7,5 (S, 11H); 7,68 (d, J=9,0 Гц, 1Н); 9,54 (S, 1Н); 11,2 (S, широкий, 1Н) млн

УФ!ЧТЯ (0,1 М калийфосфатный буфер-З5 ный раствор, рН 8,0): мак =575 нм.

Эмиссия Флуоресценции: g макс =

=598 нм.

Пример 12. (1-Дифенилгидантоинилметилкарбонил)пиперазид 8-xrtop- 40 резоруфин-4-карбоновой кислоты. а. 8-Хлоррезалурин-4-карбоновая кислота.

Иэ 17,3 r 4-хлор-6-нитрозорезорцина, 15,4 r 2,6-диоксибензойной кисло-,45 ты, 8,6 r пиролюзита и 10,7 мл концентрированной серной кислоты получают по аналогии с примером 1а 8-хлоррезапурин-4-карбоновую кислоту.

Выход 17,1 r °

Rf (силикагель, элюирующее средство: бутанол — ледяная уксусная кислота — вода в соотношении 4:1:1)=0,58. б. N,О,О-Триацетил-Я-хлордигидро-. резоруфинкарбоновая кислота.

16,3 r 8-хлоррезалурин-4-карбоновой кислоты и 18,9 r хлорида олова (II) нагревают в течечие 0,5 ч в

100 мл смеси ледяной уксусной кислоты и ангидрида уксусной кислоты, взятых в соотношении 1:1 при 80 С, после чего реакционную смесь выливают в 500 мл води со льдом. Смесь перемешивают в течение 2 ч, осадок отфильтровывают и сушат над Sicapent ". Твердое вещество растворяют в 500 мл ацетона, после чего от раствора отделяют фильтрованием остатки нерастворенного вещества. Фильтрат упаривают, причем после сушки остатка получают 12,3 r продукта.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1)=

=0 39. Н-HMP (Pg<-ДМСО), : 2 25 (S

3Н); ("$" 6Н); 7, 16 (d, 3=8,8 Гц, I H);

7,30 (S, 1Н); 7,76 (d, J 8 8 Гц» 1Н)»

7,90 (S 1Н) млн . в. N ÁÎÊ-пиперазид 8-хлоррезоруфин-4-карбоновой кислоты.

По аналогии с примерами 1б, 1в, 1д и 1ж из 5 r N,О,О-триацетил-8-хлордигидрореэоруфин-4-карбоновой кислоты получают 0,8 г продукта.

Rf (силикагель,,элюирующее средство: хлороформ — метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1)=, =0,7.

r. Трифторацетат пиперазида 8-хлоррезоруфин-4-карбоновой кислоты.

По аналогии с примером 1з из 0,8 r

БОК-защищенного соединения, полученного в примере 12в, получают 0,81 г продукта.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1)=

=0,07. д. Сопряжение пиперазида 8-хлорреэоруфин-4-карбоновой кислоты с Nоксисукцинимидным эфиром 2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты.

По аналогии с примером 1и иэ

400 мг трифторацетата пиперазида 8хлоррезоруфин-4-карбоновой кислоты и 410 мг N-оксисукцинимидного эфира

2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты получают желаемый продукт.

Rf (снликагель, элюирующее средство хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9: 1: О, 1)=

-"0,38.

УФ/VIS (О, 1 И калийфосфатный буФерный раствор, рН 8,0): дакр58! нм.

Эмиссия флуоресценции: Фмакс=

=597 нм.

2!

22

1621811

Пример 13. Сопряжение пипераэида 8-хлоррезоруфин-1-карбоновой кислоты с (2-аминоэтил)амидом теофиллин«

7-пропионовой кислоты. а. 8-Хлорреэоруфин-1-карбоновая кислота.

8,7 r 4-хлор-6-нитрозорезорцина и 7,71 г 3,5-диоксибензойной кислоты растворяют в 200 мп метилового спирта.0

К приготовленному раствору при О С прибавляют 4,8 r пиролюзита и порциями 5 3 мл концентрированной серной кислоты. Реакционную смесь перемеши" . вают в течение 2 ч при комнатной тем- 15 пературе, фильтруют и прибавляют к раствору аммиак до изменения окраски на голубую, а затем 200 мп воды. Раствор фильтруют, фильтрат при охлаждении смешивают с 25 мп концентрирован- 20 ного раствора аммиака и 20 г цинковой пыли, после чего смесь дополнительно перемешивают беэ охлаждения примерно в течение 15 мин. Затем к смеси прибавляют 200 мг активированного угля, 25 производят фильтрование, фильтрат подкисляют до рН 2, после чего выделившееся в осадок производное разоруфина отделяют с помощью центрифугирования.

Выход 3,9 г.

Rf (силикагель, элюирующее средство: н-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода в соотношении 4:1:1)=0,88. б. N,O,О-Триацетил-8-хлордигидрореэоруфин-1-карбоновая кислота.

Из 3,5 r 8-хлоррезоруфин-1-карбоновой кислоты по аналогии с примером

1б получают 3,2 г продукта.

Rf (силикагель, элюирующее средст- во: хлороформ — метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1)=

=0 43. в. Трифторацетат пипераэида 8-хлорреэоруфин-1-карбоновой кислоты.

Из 3 г триацетильного соединения, полученного в примере 11б, по аналогии с примерами is - 1з получают 1,4 r продукта.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1)=

=0,08.

r. Взаимодействие пипераэида 8хлоррезоруфин-1-карбоновой кислоты с (2-аминоэтил)амидом теофиллин™7-про55 пиоиовой кислоты.

По аналогии с примером 8 из 420 мг . пиперазида N,О,О-триацетил-8-хлордигидрорезоруфин-1-карбоновой кислоты и 300 мг (2-амнноэтил)ам ща теофиллин-7-пропионовой кислоты получают

190 мг N- ((теофиллин-7-пропионил)2-аминоэтил амида 8-хлоррезоруфин1-карбоновой кислоты.

Пример 14. Мечение иммуноглобулина G N-оксисукцинимидным эфиром

N-(4-реэоруфинилкарбонил)саркозина.

100 мг IgG человека растворяют в

10 мп 0,1 М калийфосфатного буферного раствора с рН 8,0, после чего приготовленный раствор смешивают с 5 мг

N -оксисукцинимидного эфира N-(4-ре1 эоруфинилкарбонил) саркозина (пример 7д) . Реакционную смесь выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре, а затем хроматографируют на

Ultrogal АСА 202 (ЬКВ) К-(4-реэоруфинилкарбонил)саркозинил-иммуноглобулин.

При этом меченый белок вымывается до свободного низкомолекулярного резоруфина. Степень мечения определяют с помощью измерения экстинкции. Она составляет 3, т.е. молекула IBG связана с тремя молекулами производного резоруфина.

Пример 15. Мечение иммуногло" булина С N -оксисукцинимидным эфиром (4-резоруфинилкарбонил)пиперидин-4I карбоновой кислоты. а. N-(4-Резоруфинилкарбонил)пиперидин-4-карбоновая кислота.

2,0 г хлорангщ рида N,О,О-триацетилдигидрорезоруфин-4-карбоновой кислоты, описанного в примере 1в, по аналогии с примером 1д вводят во взаимодействие с 0,9 r гидрохлорида метилового эфира пиперщ ин-4-карбоновой кислоты, по аналогии с примерами 1е и 1ж производят деацетилирование и окисление, после чего продукт омыпяют раствором гидроокиси натрия до N-(4-резоруфинилкарбонил)"пиперидин-4-карбоновой кислоты.

Выход 0,9 r.

Rf (силикагель RP-18, элюирующее средство: нитрометан — этанол в соотношении 4:1)=0,44.

УФ/VIS (0,1 М калийуосфатный буферный раствор, рН 8,5): „ =576,2 нм. б. N -оксисукцинимидный эфир й-(4резоруфинилкарбонил)-пиперидин-4-кар» боновой кислоты.

t

Из 200 мг N-(4-реэоруфинилкарбо- нцл) пиперидин-4-карбоновой кислоты, 240 мг (N-оксисукцинимида и 468 мг дициклогексилкарбодиимида получают по

1621811

24 аналогии с примером 7д 190 мг продукта.

Rf (силикагель RP-18, элюирующее средство; нитрометан — этанол в соотношении 4:1)=0,7. 5

ИК (прессованный с бромистым калием образец): 3415 (m, широкий), 1814 (m), 1773 (m), 1734 (S), 1626 (тп), 1214 (тп) см в. Мечение IgG кроликов N -окси1» сукцинимидным эфиром N-(4-резоруфинилкарбонил)пиперидин-4-карбоновой кислоты.

10 мг IgG кроликов в 1 мп О, 1 М калийфосфатного буферного раствора с рН 8,5 смешивают со 100 мкл раствора 1,9 мг N-оксисукцинимидного эфира N-(4-резоруфинилкарбонил)пиперидин4-карбоновой кислоты в 1 мл 1,4-диок- 0 сана, после чего приготовленную смесь выдерживают в течение 2 ч при комнатной температуре. Это отвечает молярному соотношению производного резоруфина и IgG кроликов 6,4:1.

После хроматографирования на АСА

202 (злюирующее средство: 0,1 М калийфосфатный буферный раствор, рН 8,5) получают фракцию белка, которая имеет отношение поглощений А 5щ /Aqyp =О, 97, 30 соответственно степень нагрузки

3,4 моль резоруфина на 1 моль IgG, Если в аналогичном опыте 10 мг IgG кроликов смешивают с 20 мкл раствора активированного резоруфина, то при

1,05 моль укаэанного красителя на

1 моль IgG получают степень нагрузки 0,8.

Максимум поглощения меченного резоруфином IgG около 578 нм. Раствор дает сильную флуоресценцию светлокрасного цвета.

Если раствор меченного реэоруфином IgG в течение месяца подвергают воздействию дневного света, то интен45 сивность флуоресценции уменьшается до 59 от первоначального значения, в то время как аналогично полученный, но меченный флуоресцениизотиоцианатом

IgG уменьшает интенсивность до 16 ., а меченный красителем Texas Rot IgG †. 0 до 12 .

Пример !6. Определение дифенилгидантоина в сыворотке человека с помощью ФНИА.

1950 мкл (0,1 М натрийфосфатного i буферного раствора (рН 7,8) смешивают с 5 мкл пробы (1), 25 мкл раствора антитела (2) и 25 мкл раствора дифенилгидантоин-резоруфина (3) . Смесь выдерживают в течение 5 мин при 37 С, а затем измеряют флуоресцентную поляризацию (длина возбуждающей волны

575 нм, длина излучаемой волны 594 нм, измерительный прибор - флуоресцентный спектрометр 650-10 "Хитачи" ).

1. Проба: донорская сыворотка человека, дополненная известным количеством дифенилгидантоина. Для получения калибровочной кривой применяли донорскую сыворотку человека, которая содержит дифенилгидантоин в концентрациях, мкг/мп: а — 2,5; б — 5; в—

10; г — 20; д - 40.

2. Раствор антитела: 450 мкг антитела на 1 мл 0,1 М натрийфосфатного буферного раствора (рН 7,8).

Антитела получают обычным способом посредством иммунизации овец дифенилгидантоином, который связан с альбумином сыворотки крови крупного рогатого скота.

Антисыворотку очищают с помощью осаждения сульфатом аммония и хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе.

3. Раствор дифенилгидантоинрезору-6 фина (10 M): конъюгат дифенилгидантоина и резоруфина из примера 1и в

0,1 М натрийфосфатном буферном растворе (рН 7,8).

Результаты измерений, которые получают с растворами дифенилгидантоина

1а 1б, 1в, 1г и 1д, представлены на фиг. 1.

С помощью такой калибровочной кривой также могут быть определены. концентрации дифенилгидантоина в пробах с неизвестным содержанием дифенилгидантоина.

Аналогичные калибровочные кривые также могут быть получены в тех случаях, когда вместо примененного выше конъюгата дифенилгидантоина из примера 1 применяют конъюгаты дифенилгидантоина из примеров 7,7,8 или 10е.

На фиг. 2 — калибровочные кривые, полученные при применении конъюгата (1-дифенилгидантоинкпметилкарбонил)пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты (пример 2); на фиг. 3 - то же, конъюгата И-(4-резоруфинилкарбонил) саркосинил-1-(2-аминоэтил)-дифенилгидантоина (пример 7); на фиг. 4 то же, конъюгата 2-(1-дифенилгидантоинил)этиламипа резоруфин-4-карбоновой кислоты (пример 8); на фиг. 5 — то же, 26

1621811

25 конъюгата (2-(1-дифенилгидантоинил)пиперазидметилкарбонил1-пипераэида

9-окси-5-бенэо а -феноксазон-8-карбоновой кислоты (пример 10) .

Пример 17 ° Определение актив5 ности эндогликозндазы реэоруфин-высокоманнозным гликопептидом, а ° Мечение высокоманнозного гликопептида N -оксисукцинимидным эфиром

N-(4-резоруфинилкарбонил)-саркозина.

50 мг высокоманнозного гликопептида смешивают с 10 мл О, 1 М калийфосфатного буферного раствора с рН 8,0.

Раствор доводят до рН 8,0. Прибавляют к нему 25 мг N --оксисукцинимидного эфира N-(4-резоруфинилкарбонил) саркозина, растворенные в 3 мл диоксана, через 1 ч еще раз прибавляют такое же количество N-оксисукцинимид- 20 ного эфира красителя в 3 мл диоксана.

Смесь перемешивают в течение 14 ч при комнатной температуре, затем производят отгонку диоксана в вакууме, после чего остаток разбавляют водой до 25

70 мл, а затем буферным раствором А (=0,02М трис-НС1, 2 мМ хлористого магния, 2 мМ хлорида марганца (Ы), 2 мМ, хлористого кальция, рН 7,2) до 140 мп.

Прибавлением водного раствора амми- 30 ака рН доводят до 7,2. Образовавшийся при этом осадок отделяют центрифугированием. Находящуюся над осадком жидкость вводят в заполненную Соп А-сефарозой колонку (1х х15 см). Свободный краситель вымыва35 ют буферным раствором А. Как только протекающая жицкость теряет красную окраску, вымывают первую фракцию— реэоруфин-высокоманнозный гликопептид

27.-ным метилманнозидом в буферном растворе А в качестве элюирующего ,средства (приблизительно 100 мп).

После этого элвируют вторую фракцию

27.-ным водным раствором метилманноэида. Обе фракции подрергают диалиэу

45 по отношению к воде и лиофилизуют.

Обе фракции пригодны для описанного ниже определения активности эндогликоэидазы.

50 б. Определение активности эндогликоэидазы.

Резоруфин-высокоманнозный гликопептид выдерживают в подходящем буферном растворе с эндогликозидазой, например в цитратном буферном раст воре с рН 5,5 с эндогликоэидазой Н (проба 1). Параллельно готовят пробу, не содержащую эндогликоэидазы (проба 2) .

После инкубации обе пробы смешивают с Соп А-сефарозой, после чего пробы встряхивают для того, чтобы связался реэоруфин-высокоманнозный гликопептид. Меченный резоруфином пептид, у которого в результате активности фермента отщеплен фрагмент ! сахара, не связывается. Через 15 мин

Соп А-сефарозу отделяют центрифугированием, находящуюся над осадком жидкость доводят до рН 7, 5, после чего измеряют флуоресценцию (воэбущцение, например, 550 нм, эмиссия gg

=595 нм) . Разница межпу пробой 1 и контрольным значением (проба 2) показывает количество расщепленного резоруфин-высокоманнозного гликопептида и является, следовательно, мерой активности фермента.

Пример 18. Соединение дигитоксигенин-3-гемисукцинат-N-гидроксисукцинимидэфира с резоруфин-4-пипераэидом карбоновой кислоты.

438 мг реэоруфин-4-пипераэида карбоновой кислоты и 570 мг дигитоксигенин-3-гемисукцинат-N-гидроксисукцинимип-эфира вводят в 160 мл смеси диоксан — вода 1:1. Раствор доводят до рН

8,5 5Х-ным водным раствором карбоната калия К СО и перемешивают 3 ч при комнатной температуре. Выпаривают диоксан, доводят до рН 1 и отсасывают осажденный продукт.

Выход 670 мг.

Rf (силикагель-HPTLÑ, средство текучести: бутанол — ледяной уксус вода 4:1:1)=0,64.

Rf реэоруфин-4-пиперазид ка боновой кислоты 0,09.

Л р и м е р 19. Соединение реэоруфина-4-пиперазида карбоновой кислоты

t с дигоксигенинмонодигитоксозид-(3 гемиглютарат)-N-гидроксисукцинимидэфиром.

Аналогично примеру 18 из 438 мг резоруфин-4-пиперазида карбоновой кислоты и 731 мг дигоксигенинмонодигитоксозид-(3 -гемиглютарат)-N-rwpoxcecyxцинимиц-эфира получают 630 мг сырья.

После хроматографии на силикагеле RP

18 (элюент:изопропанол — вода 2:1) получают 34 мг продукта. .Rf (силикагель-HPTI.C, средство те" кучести. бутанол — ледяной уксусвода 4: 1: 1) =0,61. .. Пример 20. Соединение N-(4реэоруфинилкарбонил)пиперидин-4-карбоновой кислоты-N -гидроксисукцинимид1621811 эфира с 3-амино-3-дизоксидигоксигекином, 140 мг 3-амнно-3-дезоксидигоксигенина и 140 мг N-(4-резоруфинилкарбонил)пиперидин-4-карбоновой кислотьг-М" 5 гидроксисукцинимид-эфира из примера 15 перемешивают 2 ч в смеси из 80 мп

0,1 И буферного раствора фосфата калия рБ 8,5 и 120 мп смеси диоксандиметилформамнд 1:1. Выпаривают при ком" наткой температуре до сухого и очищают на силикагеле RP !8 (элюент:гради" ент от 0,1Ж трифторуксусной кислоты

1 в Воде до О у 1Ж тркфторуксусной кисло 15 ты в изопропаноле — воде 65: 35) . .Получают 30 мг продукта.

Rf (сипикагель RP 18, средство те-,, кучести: изопропанол - вода 1:1)=0,60.

Rf аминодигоксигенина 0,55. 20

Rf резоруфин-N-гидроксисукцннимидэфира 0,71, Пример 21, Получение N-(3 (резоруфин-2 -ил)-пропионнл)-тироксинметилэфира путем соединения реэору- 25 фин-2-пропионовой кислоты с тироксинметилэфиром, а. Гидрирование 7-гидроксикумарина в дигидроксифенилпропионовую кислоту.

6,5 r 7-гидроксикумарина растворя- 30 ют в 25 мл 5 И раствора едкого натра, 100 мл воды и 20 мл этанола и после добавления 2 г Pd-активированного угля гидрируют при комнатной температуре и нормальном давлении. Отфильт- 35 ровывают, подкисляют и центрифугируют раствор.

Выход 9ОХ.

Н"-ЯМР (ДАССО-И6,%: 2,4-2,9 (m 4H);

4И™н .. 40 б. Резоруфин-2-пропионовая кислота.

40 ммоль дигидроксифеннлнропионовой кислоты и 40 ммоль нитрозореэорцнна растворяют в ATM@, добавляют 3 г двуокиси марганц1 и каплями добавляют

4 мп серной кислоты. Производное резоруфина отфильтровывают, растворяют в аммиаке и восстанавливают цинком.

Очистку продукта осуществляют хроматографией на силикагеле (растворители: уксусный эфир — метанол 8:1).

Выход 257..

ИБ (продукт ТИ S 2, Е1)И+429. в. Сопряженная реакция-.

ЗО мг реэоруфин-2-пропионовой кислоты превращают с Я-гидроксисукцинимндом и морфолиноэтилизоцианидом в

Д4Ф ь активный эфир. Затем добавляют

100 мг тироксинметнлэфнра и триэтиламина. По окончании реакции подкисляют и очищают через сефадекс 1 Н

20/ДМФ.

Выход 20 мг.

Пример 22. Получение N-(3-ре" зоруфин-2 -ил-пропионил)-аминоэтил-! гидантоина сопряжением реэоруфин-2пропионовой кислоты с аминоэтилгидантоином, Аналогично предшествующей реакции превращения получают соответственно из 150 мг аддукта 100 мг требуемого продукта.

Н-ЯМР (ДИСО-йе),о: 6,27-7,95 (m, 5H); 7,34 (S, 10H), млн

Пример 23. Получение резоруфин-4-карбоновая кислота(дигоксигенинсукциноил)пипераэида путем сопряжения резоруфин-4-карбоновая кислотапиперазип-трифторацетата с дигоксиге.нин-сукциноил-N-гидроксисукцинимидом.

1 ммоль исходных соединений преобразуют, как в примере 1. Получают

170 мг требуемого продукта.

Rf (силикагель, растворитель: хлороформ — метанол - ледяная уксусная кислота 9:1:0,1) =0,19.

Пример 24. Получение N-(реэор уфин-4-кар бонил) аминодиго ксиг енилсаркозина путем сочетания саркозинN"оксисукцинимидового эфира реэоруфин4-карбоновой кислоты с аминодигоксигенином.

0,174 ммоль каждого вещества превращают в требуемый продукт при условии примера 7е.

Rf (силикаг ель, хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота 9:1:

:0,1)=0,28.

Пример 25. Сопряжение 2"хлорреэоруфин-4-карбоновая кислота-пиперазид-трифторацетата с дифенилгидантоинуксусная кислота-N-гидроксисукцини" мидом.

Превращение осуществляют аналогично примеру 1. Из 270 мг 2-хлор-резоруфин-4-карбоновая кислота-пиперазидтрифторацетата и 173 мг дифенилгидантоинилуксусная кислота-Я-гидроксисукцннимид-эфира получают 20 мг N-{дифенилгидантоинилметилкарбонил)пиперазид-2-хлоррезоруфин-4-карбоновой кислоты.

И (силикагель, растворитель: хлоpohopM - метанол — ледяная уксусная кислота 9: 1: О, 1) =О, 38.

Н р и м е р 26. Получение резоруфин-4-карбонил-тетраиодтироацетнл-пи1621811

30 чиной РН 8,5 и очищают через препаратный HPL

Виход 20 мг.

Н-ЯМР (СДзОД),О: 7,06, 7,11, 7,80, 7,85 (4S, 4Н); 6,35-7,58 (тп, 5Н).

Пример 27. Сопряжение реэоруфин-4-карбоновая кислота-пипераэидl трифторацетата с 1-метил-3-(N-сукцинимидокарбонилпропил)ксантином.

Превращение осуществляют аналогично примеру 1.

Из 194 мг 1-метил-3-(N"cóêöèíèìèäoкарбонил)пропилксантина и 245 мг резоруфин-4-карбоновая кислота-пиперазид-трифторацетата получают 110 мг (1-метил-3-N-сукцинимидокарбонилпропил)ксантинил-пипераэида реэоруфин4-карбоновой кислоты.

Rf (силикагель, хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота 9:1: 10

:О, 1) =0,43.

Пример 28, Определение теофиллина в человеческой сыворотке с помощью FPIA.

Опыты проводят так же, как описано д в примере 16, но в качестве раствора антитела (2) используют раствор

7,5 мкг/мл поликлонального антитела по отношению к теофиллину, в качестве раствора Реэоруфина {3) - Рас вор

2,14 нмол/л (теофиллин"7-пропионовая кислота)пипераэида реэоруфин-4-карбоновой кислоты в соответствии с примером 16, а в качестве пробы — человеческую донорскую сывоРотку со следую-55 щими добавками TeoARKHHHG мкг/мп.

a) 2,5; Ь) 5; с) 10; d) 20 ; е) 40.

В результате получают калибровочную кривую, изображенную на фиг. 6.

30 перазида путем сочетания N-оксисукцинимидового эфира тетраиодуксусной кислоты с пипераэид-трифторацетатом рвзоруфин-4-карбоновой кислоты

5 а. Тетрайодотироуксусная кислотаN-гидроксисукцинимид-эфир.

Обичным образом (например, как в примере 21) иэ кислоти (500 мг) путем превращения с N-гидросукцинимидом и 10 морфолиноэтилизоцианидом получают активный эфир.

Выход 300 мг.

Rf (силикагель, растворитель. хлороформ — метанол — ледяная уксусная 15 кислота 9:1:0,1)=0,87. б. Сопряженная реакция.

0,18 ммоль исходных соединений превращают, как описано в примере 1, в диоксановый буферный раствор с вели- 20

С помощью этой кривой можно опреде" лять концентрацию теофиллина в исследуемых пробах.

П р и и е р 29. Определение тирок-. сина в человеческой сыворотке с помо" щью ГР?А.

Опыты проводят так же, как описано в примере 16, но в качестве раствора антитела (2) используют раствор

376 кг/мл поликлонального антитела по отношению к тироксину, в качестве раствора реэоруфина (3) — раствор 1,56 нмол/л (I,-тироксин)- пиперазида реэоруфин-4-карбоновой кислоты, полученного из соединения в соответствии с примером 3 после отщепления от него с помощью трифторуксусной кислоты защитной ВОС-группы, а в качестве пробы — человеческую донорскую сыворотку со следующими добавками тироксина, мкг/0,1 л: а)3; Ь) 6; с) 12; d) 18; е) 30.

В. результате получают калибровочную кривую, изображенную на фиг.7.

С помощью этой кривой можно определять концентрацию тироксина в исследуемых пробах с неизвестной концентрацией.

Пример 30. Определение дигок- сина в человеческой сыворотке с помощью FPIA.

Опыты проводят так же, как описано в примере 16, но в качестве раствора антитела (2) используют раствор

440 нг/мл поликлонального антитела по отношению к дигоксину, в качестве раствора резоруфина (3) - раствор

0,25 нмол/мл М-(4-реэоруфинил-карбонил)саркосинил-3-аминодигоксигенина (пример 24). а в качестве проб - человеческую донорскую сыворотку со следующими добавками дигоксина, нг/ил: а) 0 5; Ь) 1; с) 2; d) 3; e) 5 °

В результате получают калибровочную кривую, изображенную на фиг.8.

С помощью этой кривой можно определять концентрацию дигоксина в исследуемых пробах с неизвестноМ концентрацией.

В гетерогенном нммуноанализе, прежде чем определить концентрацию свободного или связанного лиганда, необходимо разделение лиганда, связанного с антителом, и свободного лиганда

1 посредством осаждения подходящими ве ществами или посредством применения антитела, связанного с твердым носителем. В гомогенном иммуноанализе исследуют образование комплекса антитело — лиганд в пробе без такого разделения. К методам гомогенного иммуноанализа могут быть причислены, например, флуоресцентный Qnenching-метод, флуоресцентный Enhancement-метод и флуоресцентный поляризационный метод, при которых флуоресцирующее вещество применяют в качестве метки.

Так как соединения, отвечающие общим формулам Ia или Хб, имеют максимумы поглощения и эмиссии, которые в значительной степени лежат вне области биологического материала, мешающего определению вследствие своей собственной флуоресценции, они особенно пригодны для применения в флуоресцентном поляризационном иммуноанализе (ФПИА). Кроме того, предлагаемые сое- 10 динения при подходящем замещении обладают особенно высоким Stokes-перемещением, достигающим приблизительно

70 нм.

В основном ФПИА-способ базируется 25 на принципе обычного Флуоресцентного иммуноанализа.

Если подходчщий флуоресцирующий меченый лиганд возбуждается плоско поляризованным светом до флуоресцен- ЗО ции, то в результате незначительных временных задержек между возбуждением и эмиссией молекула, прежде чем эмиттируется излучение, поворачивается.

Таким образом плоскость плоско поляризованного света равным образом поворачивается на определенный угол, Множество молекул внутри этого короткого промежутка времени может привес" ти в результате вращательной диффузии 4О к известной деполяризации флуорес-, центной эмиссии, Для поляризации эмиттированной флуоресценции характерна та, что она тем больше, чем больше мол(кулаю и» следовательнав чем мед- 45 дленнее вращение. Эта зависимость ма-> жет быть использована для измерения связи лиганда с антителом, так как свободный меченый лиганд имеет меньший объем молекулы, чем комплекс, 56 состоящий из меченого лиганда, связанного с антителом. Поляризация обратно пропорциональна концентрации определяемого лиганда, находящегося в пробе. 55

Концентрация .меченого лиганда или аналога лиганда и необходимого для такого иммуналогического способа антитела определяется в зависимости от

32 примененного измерительного прибора, а также от характерных свойств примененного меченого лиганда или аналога лига ща и самого антитела. Эта кон- . центрация зависит также от подвергаемого определению лиганда и поэтому должна устанавливаться эмпирически.

Это установление может быть произведено посредством простой оптимизации.

Концентрация лиганда, который должен быть. определен, в большинстве случаев колеблется в области 10

10 моль. Предпочтительная для измерения концентрация лиганда в определяемой пробе составляет 10 "

10 моль, наиболее предпочтительная10 — 10 ® моль. Более высокая концентрация лиганда может быть измерена после разбавления первоначальной . пробы.

Измерение производят при определенном значении рН, которое может находиться в интервале 3 — 12. Обычно значение рН лежит в области S - 10, предпочтительна 6 " 9. Для установления и поддержания определенного значения рН во время измерения могут быть применены различные буферные растворы, например боратньм, фосфатный или карбанатный нли трис-6уАеу

При использовании предлагаемых соединений не имеет решающего значения то, какой буферный раствор применяют.

Выбор определяется, в первую очередь, в зависимости от применяемого антите" ла, лиганда, который должен быть определен, а также примененной флуоресцентной метки.

Метод ФПИА преимущественно осуществляют при постоянной температуре, обычно при 10 — 40 С. д

Точная зависимость между поляризацией и концентрацией подвергаемого определению лиганда или аналога лиганда может быть определена по калибровочной кривой. Ее получают, измеряя значения поляризации растворов с pasличными, но известными концентрациями соответствующего вещества. Неизвестная концентрация лиганда в исследуемой пробе может быть определена saтем по такой калибровочной кривой.

Соединения, отвечающие общим Формулам Ха и Хв, могут ширака применяться в качестве флуоресцентной метки.

Так,например,в иммунофлуоресцентной микроскопии в качестве антигена белки или целые клетки могут быть сделаны

1б21811

34 видимыми с помощью флуоресцирующе меченного антитела. В соответствующих способах можно непосредственно наблюдать также распределение гаптена или антигена в клетке в том случае, ког5 да в клетку вводят в качестве флуоресцирующей метки соответствующее соединение, а затем производят наблюдение, например, под микроскопом. При этом, в противоположность описанному выше гомогенному флуоресцентному иммуноаналиэу, флуоресцентные свойства производных реэоруфина не изменяются.

Недостаток известных красителей, которые применяются в качестве флуоресцирующей метки, например таких флуоресцеинов, как флуорвсцеинизотиоцианат, или таких родаминовых красителей, как Texas Rot, заключается в 20 том, что они флуоресцируют при относительно малых длинах волн. Кроме того, выход при реакции сочетания с соответствующим носителем чаще всего низок, и образующиеся в результате реак- 25 ции продукты обладают плохой цветостабильностью.

Предлагаемые соединения, отвечающие общимформулам Ia и Тб, флуоресцируют длинноволново при хорошей цвето- g0 стабильности, причем они с хорошим выходом могут быть получены из соединения, отвечающего общей формуле IIa или ТТб, и соответствующего партнера, 35 применяемого для реакции сочетания.

1 системы лектин — производное углевода.

При сортировании клеток в Fluorescent Ac t iva t eo Cell Sor ter применение находят флуоресцирующие частицы латекса. Такие частицы могут быть хорошо флуоресцентно помечены, например, в результате реакции частиц латекса, содержащих гидроксильные группы, аминогруппы или жв карбоксильные или сульфокислотные группы, с реакционноспособными соединениями реэофурина, отвечающими общим формулам

IIa или ТТб.

Соединения, отвечающие общим формулам Ia и I6, могут быть применены для определения ферментов. Для этой цели производное резоруфина, отвечающее общей формуле IIa или ТТб, может быть связано с субстратом, который способен расщепляться определяемьм ферментом. Этот продукт реакции сочетания также является соединением, отвечающим общей формуле Ia или Iá. После взаимодействия меченного резоруфином субстрата, который не вступил во взаимодействие, может быть определена активность фермента.

Например, реакционноспособное произ» водное реэоруфина, отвечающее общей формуле IIa или ТТб, может быть связано с гликопептипом, причем полу" ченный в результате этого продукт реакции сочетания может быть применен в качестве субстрата для определения активности эндогликоэидазы.

Для определения эндогликозидазы известно мечение соединениями данзила.

Производные резоруфина в сравнении с такими соединениями отличаются более высокой чувствительностью.

Недостаток известных соединений состоит в том, что длина волны их флуоресцирующего излучения находится в области, где лежит излучение компонентов проб крови, что приводит к искажению результатов измерений.

Это следует иэ кривой 1 на фиг. 9.

Очевидно, что при длине волны

525 нм, соответствующей максимуму флуоресценции известного соединения, сама проба испускает флуоресцирующее излучение, оказывающее мешающее действие. Максимум излучения испускае-, мого предлагаемы соединением равен, по меньшей мере 590 нм. При этой дли- не волны фоновая флуоресценция пробы

Предлагаемые соединения могут быть применены для мечения вещества и при других флуоресцентных иммунологических способах. Так, возможно мечение этими

40 реакционноспособными соединениями резоруфина и реагента другой комплексообразующей системы. При этом под комплексообразующей системой подразумеваются все те комбинации веществ, 45 которые, учитывая специфическую силу обменного взаимодействия, способны образовывать комплексы. Известными комбинациями являются, например, гормон/спец. рецептор, биотин/авидин, про- 50 изводное углевода/лектин и т.д. Например, меченный биотином протеин может быть определен с помощью продукта сочетания, полученного из авидина и реакционноспособного соединения, отвечающего общей формуле ТТа или ТТб, Кроме того, соединения, отвечающие общим формулам Ia и Тб, могут быть применены при определении реагента крови значительно ниже, чем при

362181 3

525 нм (максимум эмиссии известных соединений).

Таким образом, с помощью соединений, полученных по предлагаемому способу, можно без помех, вызываемых

5 компонентами проб, определять содержание лигаков.

Способ получения производных резоруфина общей формулы Ia или Хб (се 1,„e(0) L, ., 0

20 - = — NC Н2С-или — N С—

25 Il

I,0 — простая связь и А — радикал, образо30 ванный из иммуноглобулина G, отличающийся тем, что соединение общей формулы IIa или 11б где R

К5

Кф

35 ВЗ

С вЂ ;

ii

О (СН2)щ С,Х, он гт

50 где Ц %, п1 и 1.(имеют указанные значения;

55 — CCH СЯ С—

2 2

О O

О подвергают взаимодействию с соединением общей формулы ПТ

Формула из обретения

В р (С 8 1 С(0 L,1. ф

О, О,- ОН н2

Н или С1 в положении 2;

Н или С -С "алкил

Н, С -Cg-алкил или С1;

Н или R и Rg вместе образуют аннелированное фенильное кольцо;

Оили 2;

19 ь =- ы-, -н-сн,— соо

1 2

3 (2 — сбю „С (СН2)Р

ii

О где р=1, 2 ила д, ХН,-1ЧНСН2СН2 — С С Н(ОН) C H(0H) C —, ll

А - радикал, образованный иэ гидантоина, дифенилгидантоина, трет-бутилоксикарбонил-L-тироксина, фенобарбитала, эстрадиола, 7-теофиллина, дигоксигенина, дигоксигенинмонодигитоксозида, 3"амино-3дезокситетраиодотироуксусной кислоты, тироксинметилового эфира или ксантина, причем радикал -(СН ) -g-1 g-?,д-А

О при ш О находится в положении 4 и при m=2 в положении 2, а в случае m=O и n=

=0,8...6,4

Х4 Н, С1 или 0

36Z181 1

Х - Н или

37

XgQA где I- и А имеют указанные значения;

О причем активные радикалы соединений !

IIa или ТТб и III могут иметь защитные группы, которые при необходимости

5 удаляют, с выделением целевого продукта в свободном виде.

/Янцеудрация 6иренилыбантоина Ю арабе

Pia.1

1621811 .Р Я Я

Жжююйчж авенштдавмина Рада

Фи» 8

f50

N0

Ю

0 У Ю 6 Ж Ю Ю Л

/Ьавцаща» диеенижидвнтина б юфаФ

Фи» У

Кснценарация ДФ/ Ф npmfe

Фиг.Ф аи

1621811

СгммФрмивю 440Ю

4Ьа7

1621811

ФиаУ

Составитель Н.Нарышкова

Редактор Л.Веселовская Техред М.дндык Корректор <-Лемчик

Заказ 4257 тираж Подписное

ВНИКНИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Paymczas наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101