Рекомбинантная плазмидная днк pcca7, кодирующая поверхностный антиген вируса гепатита в (hbsag) и штамм дрожжей accharomy ces cerevisiae - продуцент поверхностного антигена вируса гепатита b

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Целью изобретения является повышение выхода поверхностного антигена вируса гепатита в (HBsAg). Сконструирована рекомбинантная плазмида pCGA7, которая содержит ген HBsAg под контролем 5ʹ и 3ʹ регуляторных последовательностей дрожжевого гена PHO5. Получено дрожжей 1RDB 11/pCGA7 с продуктивностью HBsAg 2 мг на 1 л культуры, обладающей 100% -ной стабильностью плазмиды в неселективных условиях роста.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для производства рекомбинантного НВsAg из трансформированных клеток дрожжей. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Плазмида рСGA7, кодирующая поверхностный антиген вируса гепатита В (НBsAg), состоит из следующих элементов: плазмидная ДНК бактериального вектора рUC19 (2,67 т. п. о); Bam HI-Sal GI - фрагмент, содержащий промотор дрожжевого гена РН05 (0,53 т. п. о); Хho I-Bam HI - фрагмент ДНК вируса гепатита В (ayw-субтип), содержащий ген НВsAg) 1,28 т. п. о. ); Ваm HI-Pst I - фрагмент, содержащий терминаторную область дрожжевого гена РНО5 (0,37 т. п. о. ), Hind III-Hind III - фрагмент дрожжевой ДНК, содержащий ген 4 ЕU₂ и ori - репликации 2 мкм плазмиды (3,2 т. п. о. ). Мол. м. плазмиды рСGA7 равна 5,3 МД (размер 8,05 т. п. о. ). В плазмиде рСGA7 присутствуют последовательности промотора рНО5 и гена НВАg в одной копии, что позволяет исключить возможность рекомбинации внутри плазмиды и тем самым значительно повысить ее структурную стабильность: в кассете экспрессии использован терминатор гена РНО5, а бактериальная часть представлена ДНК плазмиды рUC19. Плазмидой трансформируют дрожжевой штамм IRDB11. Характеристика дрожжевого штамма ВКПМ У - 1232. Диплоидный штамм IRDB11/pCGA7 собственной конструкции получен в результате скрещивания клеток гаплоидных штаммов DВY746 (L, leu 2-3,2-112 his 3- Δ I ura 3-52 trp I-289) и IR2B (а, ude l leu 2-3,2-112) и трансформации гибридной плазмидой рСGА7. Штамм IRDB11 является диплоидом следующего генотипа: МАТа МАТ α ade 1 ADE1, leu 2-3 leu 2-3, leu 2-112 leu 2-112, his 3-Δ I HIS³, ura 3-52 URA 3, trp 1-289 TRP 1. Клетки штамма IRDB11/pCGA7 округлой, иногда слегка овальной формы, размером до 20 мкм в длину и 10 мкм в поперечнике. Деление клеток происходит в форме почкования. Максимальный титр культуры в жидкой полноценной среде YEPD достигает 2х10⁸ кл/мл. При размножении в минимальной среде YNB без добавок аминокислот титр в стационарной фазе достигает 7х10⁷ кл/мл. На агаризованной среде клетки штамма IRDB11/hCGA7 образуют макроколонии бежевого оттенка, гладкие с ровными краями, т. е. характерные для дрожжей-сахаромицетов. На определенных средах, содержащих ацетат натрия или калия, клетки претерпевают мейоз и превращаются в аск с четырьмя гаплоидными спорами, которые одеты общей оболочкой. Эффективность споруляции высокая. Клетки штамма IRDB11/pCGA7 растут в пределах широкого диапазона температур и рН, оптимальный рост при 28-30^оС и рН 5,6-5,9. В качестве источника углерода могут использовать широкий спектр моно- и дисахаридов, получая энергию за счет процесса дыхания, а также лактат, ацетаты, глицерин, этанол, переходя на процессе брожения. Штамм депонирован. П р и м е р 1. Плазмидную ДНК YEp13/pho 3/pho5 (20 мкг) подвергают гидролизу эндонуклеазами рестрикции Sau 3A (20 ед) и Pst I (20 ед) в буфере А (10 мМ трис-НСl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ МgCl₂, 1 мМ ДТТ). Реакцию проводят при 37^оС 3 ч. После инкубации смесь подвергают электрофорезу в 1,5% -ном агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия. По окончании электрофореза из геля вырезают кусочек, в котором находится фрагмент 374 по. Фрагмент элюируют из геля, используя центрифугирование через мембранный фильтр, осаждают этанолом, затем растворяют в воде. Одновременно плазмидную ДНК рUC19 (0,5 мкг) повергают гидролизу эндонуклеазами Вam HI (5 ед) и Pst I (5 ед) в буфере А и инкубируют 1 ч при 37^оС. Анализ полноты гидролиза проводят при помощи электрофореза. Полученные препараты ДНК рUC19 (0,1 мкг) и элюированного фрагмента (0,1 мкг) смешивают в буфере для лигирования (66 мМ трис-НСl, pH 7,6, 5 мМ МgCl₂, 5 мМ ДТТ, 1 мМ АТР), добавляют ДНК-лигазу (10 ед) и инкубируют 10-16 ч при 10^о. Полученной лигазной смесью трансформируют штамм Е, Соli IM83 по стандартной методике при помощи хлористого кальция. Трансформированные клетки высевают на среду Мак Конки, содержащую 100 мкг/мл ампициллина. На чашке отбирают белые колонии, которые содержат плазмиду рUС19 со вставкой фрагмента 374 по, включающим в себя терминатор дрожжевого гена РНО5. Полученную плазмидную ДНК подвергают рестрикции эндонуклеазами ЕсоRI (5 ед) и Ваm HI (5 ед) в буфере В (50 мМ трис-НСl, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ МgCl₂, 1 мМ ДТТ) при 37^оС в течение 1 ч. После электрофореза в 0,8% -ном агарозном геле вырезают и элюируют фрагмент 3,05 т. п. о. В то же время плазмидную ДНК рр7 (1 мкг) обрабатывают эндонуклеазами рестрикции Есо RI (5 ед) и Sa1Gl (10 ед) в буфере В при 37^оС в течение 14 ч. После электрофореза из 0,8% -ного агарозного геля элюируют фрагмент 0,53 т. п. о. , содержащий промотор дрожжевого гена РНО5. ДНК плазмиды рНВ320 (3 мкг) гидролизуют рестрикционными эндонуклеазами Хho I (10 ед) и Bam HI (10 ед) в буфере В при 37^оС в течение 1 ч. После электрофореза в 0,7% -ном агарозном геле выделяют фрагмент 1,28 т. п. о. , содержащий ген НВsAg. Полученных три фрагмента смешивают в эквимолярных количествах в буфере для лигирования, добавляют ДНК-лигазу (10 ед) и инкубируют 20 ч при 10^оС. Полученный лигазной смесью трансформируют штамм Е. coli НВ101 и трансформированные клетки высевают на чашки с агаризованной средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Среди выросших колоний проводят скрининг на наличие нужной плазмиды рСG3, структуру которой проверяют с помощью рестрикционного анализа. Плазмидную ДНК рСG3 (0,5 мкг) подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции Hind III (10 ед) в буфере А при 37^оС 1 ч. Полноту гидролиза проверяют электрофорезом. Одновременно с этим ДНК плазмиды рNMVG20 (2 мкг) подвергают рестрикции эндонуклеазой Hind III (20 ед) в буфере А при 37^оС в течение 1 ч. После электрофореза в 0,8% -ном агарозном геле вырезают и элюируют фрагмент размером 3,2 т. п. о. , содержащий дрожжевой LEU2 ген и ori репликации 2 мкм ДНК дрожжей. Выделенный фрагмент (0,5 мкг) смешивают с гидролизованным вектором рСG3 (0,05 мкг) в буфере для лигирвоания, добавляют ДНК-лигазу (10 ед) и инкубируют 10-16 ч при 10^оС. Этой смесью трансформируют штамм Е. Соli НВ101 и клетки высевают на чашки с агаризованной средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Среди выросших колоний проводят скрининг на наличие плазмиды со вставкой Hind III - Hind III фрагмента размером 3,2 т. п. о. В результате скрининга и последующего рестрикционного анализа отбирают плазмиду рСGA7, содержащую все необходимые элементы для экспрессии НВsAg в клетках дрожжей. Полученную плазмиду рСGA7 используют для трансформации клеток дрожжей штамма IRDB11. Анализ генетических маркеров плазмиды рСGA7 проводят следующим образом. 1. Резистентность к ампициллину клеток штамма Е. Соli HB101, содержащих плазмиду рСGA7, анализируют на агаризованной среде LB с содержанием ампициллина 10-100 мкг/мл. Данные клетки растут на среде с этой концентрацией ампициллина. 2. Наличие в клетках S. cerevisiae плазмиды рСGA7 с геном LEU2 обусловливающим способность данных клеток расти на среде без лейцина, устанавливают таким образом: на агаризованную минимальную среду, не содержащую лейцин, штрихом рассеивают клетки исходного штамма IRDB11 и трансформантов IRDB11/pCGA7. После инкубации при 30^оС в течение 48-72 ч определяют, что рост на среде без лейцина дают только клетки дрожжей, содержащих плазмиду рСGA7. Стабильность плазмиды рСGA7 в трансформантах дрожжей. 1. Стабильность поддержания плазмиды рСGA7 в митотически делящихся клетках дрожжей определяют по числу клеток (% от общего числа) сохраняющих leu⁺ фенотип при инкубации в селективной и неселективной средах. При росте в селективной среде плазмиды рСGA7 не утрачивается в течение 120-150 генераций, а при выращивании клеток IRDB11/pCGA7 в богатой, неселективной для плазмиды среде в течение 50-70 генераций. Таким образом, в условиях лабораторного и промышленного культивирования плазмида рСGA7 в клетках штамма 1RDB11 обладает 100% -ной стабильностью. Плазмида рСGA7 находится в клетке в автономном состоянии и большом числе копий (> 100 копий на клетку). 2. Структурную стабильность плазмиды рСGA7 определяют при помощи рестрикционного анализа и последующего электрофореза в агарозном геле плазмидной ДНК, полученной после ретрансформации рCGA7 из дрожжей в Е. Соli. Анализы показывают, что плазмида рСGA7 в течение длительного культивирования в клетках штамма дрожжей IRDB11 cохраняет свою первоначально заданную структуру. Другим доказательством служит стабильная экспрессия НВsAg клетками штамма IRDB11 после многократных пересевов культуры. Уровень экспрессии НВsAg стабильно сохраняется после большого числа генераций и составляет не менее 2 мг/л культуры или 0,6% от клеточного белка. П р и м е р 2. Клетки дрожжей штамма IRDB11/pCGA7 выращивают в 1 мл селективной среды (0,67% Least Nitrogen Base до плотности 5-8˙10⁷кл/мл при 30^оС в течение 16-24 ч. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 5 мин, 4^оС), отмывают в стерильной воде и переносят в 20 мл среды Low Pi (содержание неорганического фосфата 15 мкг/мл). Культуру выращивают в условиях аэрации при 30^оС в течение 24-48 ч. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 5 мин, 4^оС), отмывают в буфере С (20 мМ Na-фосфат рН 7,2б 0,14 М NaCl). К клеточному осадку добавляют равный объем стеклянных шариков (диаметр 0,5 мм). Смесь интенсивно перемешивают в течение 2 мин при комнатной температуре на встряхивателе Vortex. Затем к смеси добавляют 200 мкл буфера С, содержащего 0,2 мМ РМSF, охлаждают до 0^оС и продолжают интенсивно перемешивать еще в течение 2 мин. После этого смесь центрифугируют (10000 g, 30 мин, 4^оС) и отбирают надосадочную жидкость, в которой определяют содержание НВsAg при помощи стандартных диагностических тестов РПГА или РИА. Изобретение позволяет получить штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae - продуцент НВsAg. Уровень синтеза НВsAg в клетках штамма, содержащего плазмиду рСGA7, составляет не менее 2 мг с 1 л культуры клеток. (56) Авторское свидетельство СССР N 1524484, кл. С 12 N 15/00, 1988.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pCGA7, кодирующая поверхностный антиген вируса гепатита B (HBsAg), мол. м. 5,3 МДа и размером 8,05 т. п. о. , содержащая Pst I - Bam HI - фрагмент вектора pUC19 размером 2,67 т. п. о. , Bam HI-Sal GI - фрагмент с промотором дрожжевого гена PH05 размером 0,53 т. п. о. , Xho I - Bam HI - фрагмент ДНК вируса гепатита B геном HBsAg размером 1,28 т. п. о. , -Bam HI - Pst I - фрагмент с терминаторной областью дрожжевого гена PH05 размером 0,37 т. п. о. ; -Hind III - Hind III - фрагмент дрожжевой ДНК с геном LEV2 и ori - репликации 2 мкм плазмиды (3,2 т. п. о. ); гены и регуляторные участки: - LEU -2-ген, обеспечивающий синтез лейцина; - HBsAg -ген поверхностного антигена вируса гепатита B; - Ampⁿ - ген устойчивости к ампициллину;
-PH05 -промотор дрожжевого гена;
уникальные сайты рестрикции: Pst I, по два сайта, Hind III и Bam HI. 2. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У-1232 - продуцент поверхностного антигена вируса гепатита В.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 8-2000

Извещение опубликовано: 20.03.2000        

---