Рекомбинантная плазмидная днк раусi 35а, кодирующая энтомоцидный токсин, штамм бактерий methylobacillus flagellatum - продуцент энтомоцидного токсина

 

(19) Я1 (ul 1623522Ь (51) ИХ1 33 А IN 3 0

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР.(ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ „"

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ - :---:" 1 (21) 4699228/13 (22) 01.06.89 (46) 30.10.93 Бюл. Йя 39-40 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) Цыганков ЮД; Чистосердов АЮ„Стернин В.З;

Азизбекян P.ЄÔðóíäæÿí В.Г„ Остерман АЛ„

Хачатурян С.В„баранов АЮ„ Загнитько.ОП; Залунин ИА; Карасин АИ; Честухина Г.Г„Тюрин СА;

Степанов В М. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК

РАУС135А, КОДИРУЮЩАЯ ЭНТОМОЦИДНЫЙ ТОКСИН, ШТАММ БАКТЕРИЙ

МЕТНУ1.ОВАСП.Ш$ FLAGELLATUIN - ПРОДУ-

ЦЕНТ ЭНТОМОЦИДНОГО ТОКСИНА

1628527

Изобретение относится к микробиологической промышленности, генной инженерии и биотехнологии и может найти применение при создании бактериальных средств борьбы с чешуекрылыми насекомыми — вредителями сел ьскохозяйственных растений и лесов.

Целью изобретения является создание штамма Methytobaciiius flagellatum — продуцентэ энтомоцидного токсина. 10

Для этого сконструирована рекомбинантная плазмида рАУС135а, которая обеспечивает экспрессию гена энтомоциднОГО токсина Вас. тпррring tensts var. kurstakl в широком круге грэмотрицэтельных хозяев, имеет длину 21Я т.п.н. и состоит из: — полной последовательности вектора рАУС75 размером 8,8 т.п.н. — полной последовательности плазмиды рОК2 размером 12,8 т.п.н., и содержит: 20 — фрагмент ДНК хромосомы Вас.

thuringIensts чэг, kurstaki, размером 3,0 т,п,н., несущий ген энтомоцидного токсина; — гены устойчивости к ампициллину

Ар и этээолу Sn, гены, ответственные за 25 мобилизацию плазмиды в широкий круг грамотрицэтельных бактерий (orl Т и mob); — 2 сэйта расщепления эндонуклеазной рестрикции ВэаН1 с координатами 0,0 и 8,8 т,п.н., за О принят BarnHI сайт, расположен- 30 ный около ЯиИена; — 2 сэйта расщепления эндонуклеаэной рестрикции Sacl (8,6 и 13,1 т.п.н.).

Путем конъюгативного скрещивания ре- 1 ципиентного метилотрофного штамма 35 MethyIobacIltus fiageilatum КТ со штаммом

Е.coil C600 (R 751, рАУС135а), получен штамм, продуцирующий энтомоцидный токсин.

Штамм характеризуется следующими 40 признаками, Морфологические признаки.

Форма и размер клеток в односуточной . культуре на синтетической среде с метанолом — грэмотрицательные подвижные палоч- 45 ки (1,4-1,8/0,5-0,6) мкм, размножающиеся делением, капсулы отсутствуют, имеют полярные жгутики. число которых варьирует от

1 до 4, пигмент не образует.

Спор не образует, 50

На синтетической агаризованной среде с метанолом образует колонии округлые, полупрозрачные, диаметром 1-2 мм, поверхность гладкая, цвет молочный, профиль выпуклый, край ровный, структура мелко- 55 зернистая, консистенция вязкая. Колонии образуются на вторые сутки, На мясопептонном агаре, на среде МакКонки роста нет, Культурэльные признаки.

При посеве уколом в столбики с .!Г.. . рост не наблюдается, Нитраты до нитритов не восстэнэвли".ает, Сероводород не образует.

Тесты на оксидазу и каталаэу положительные.

Окраска Ilo Граму отрицательная, Физиолого-биохимические признаки, Облигатный метилотроф (в качестве источника углерода используют мета;on и метиламин).

Прототроф.

В качестве источника азота использу o— соли аммония, нитраты. Активно рээвивэс.тся на среде с метанолом при нейтральном значении рН (6,8-7,2). Оптимальное значение рН 7,0, растет при 37-42 С, выдерживает 450С, но со снижением выхода биомассы, Оптимальная температура 42 С.

Устойчив к антибиотикам: неомицину (5-30 мкг/мл), линкомицину (2 мкг/мл), стрептомицину (10 мкг/мл), эритромицину .(15 мкг/мл), ампициллину (10 мкг/мл), этэзолу (500 мкгlмл), рифампицину (100 мкг/мл), Устойчив к бактериофагам, Фэги, лиэирующие штамм, не выявлены.

Хранение штамма.

Штамм хранится в лиофилизировэнном состоянии, а также путем периодических пересевов на минеральной агариэовэнной среде М 9 с 27ь метанола (2 — 3 раза в месяц).

При выращивании на жидкой среде используют минеральную среду M 9 с 2;ь мета нала.

Штамм не патогенен для теплокровных животных и человека, Пример 1, Конструировэние плэзмиды рАУС135а, содержащей ген энтомоцидного токсина Вас.thuringiensis var.Kurstakl, способный реплицировэться в широка,1 круге грамотрицательных бактерий.

0,1 мкг ДНК плэзмиды рОК2 и 0,1 мкг вектора рАУС75 расщепляют рестриктэзой

8amHI в следующих условиях, 10 мм TpucCI, pH 7,6, 10 мМ MgCI2, 50 мМ NaCI и 1 мМ дитиотрейтола, BamHI 10 ед, активности, объем реакционной смеси 20 мкл, Реакцию проводят в течение 1 ч при 37 С и остэнэвливают прогревом при 68 С в течение 15 мин. Затем проводят лигировэние полученных фрагментов с помощью ДНК-лигэзы фага Т4 в следующих условиях: t0 MM Трис-CI, рН 7,6, 10мМ М9С12, 50 мМ ИэС(, 10 мМ ДТТ, 1 мМ АТФ, ДНК-лигазэ 10 ед. активности, объем реакционной смеси 25 мкл. Лигироаэние проводят при 4 C в течение 10 ч, посла чего смесь используют для трансформации.

Трансформацию проводят следующим образом: выращивают Е,coll С600 на среде 1 В до плотности ОДрщ=1,0 ед., при t=37"Ñ, 1,5

l 628527 мкл ",ëåòî÷íîé суспензии охлаждают и осаждают центрифугированием. супернатанг выбрасывают. Все дальнейшие процедуры п ро водят и ри t=0 — 2 С. Клетки суспендируют в 1 мл охлажденного 50 мМ

CaCtz и инкубируют 20 мин. "àòåì клетки осаждают центрифугированием, супернатант отбрасывают. Осадок клеток суспендируют в 100 мкл 50 мМ CaCtz, добавляют 5 мкл лигазной смсси и выдерживают 40 мин. Затем клетки переносят на 42 С на 2 мин и добавляют 1 мл LB среды, Клетки в среде инкубируют 1 ч без аэрации при 37 C, а затем высеваются на чашки, содержащие

0,4",/ глюкозы, 80 мкгlмл треонина и лейцина, 1 мкг/мл тиамина, 100 мкг/мл Ар и Sn.

Из полученных трансформантов выделяют плазмидную ДН К. Плазмиды обрабатывают рестриктазами BamHI u SaGt в условиях, описанн,!х выше и анализируют в 0,8Ж агарозном геле в трис-ацетатном буфере (0,04

М Трис, рН 8,3, 2,5 мМ ЗДТА) с последующим окрашиванием бромистым этидием. 6 клонов содержат плазмиду, при рестрикции

BamHi, дающую два фрагмента — 12,8 и 8,8 т.п.н„что свидетельствует о том, что плазмиды являются гибридами рОК2 и рАУС75, Пример 2. В штамм Е.соП с600 рАУС135а в коньюгативном скрещивании с

Е.coil С600 (Rtt 751) переводят плазмиду R

751 (Тр, Тга+), Отбор потомков проводят на среде LB, содержащей Ар (100 мкг/мл), Sn (1000 мкг/мл), Полученный штамм Е.сои

С600 {R 751, рАУС135а) используют в качестве донора в скрещивании с M.flageiiatum

КТ, который используют в качестве реципиента. Скрещивание проводят в селективных условиях. Отбор потомков проводят на.среде М9, содержащей 2g, метанола, 100 мкг/мл Rf и 500 мкг/мл Sn. Для этого чашку с селективной средой делят на 3 сектора. На

1 и 2-й секторы наносят по 10 MKll суспензии

{10 мл ") клеток донор-иреципиента,,на

3-й — совместно по 10 мкл суспензии донора и реципиента, Отобранные на третьем секторе клоны — 1 и 2 секторы — контрольные проявляют также на устойчивость к Ар (до

2000 мкг/мл) и представляют собой, таким сбр.зом, М flagellatum КТ (рАУС135а).

Пример 3. Культуру M.ftagettaturn КТ

{рАУС135а) выращиваЬт на агаризованной сред МЗ " 1;/, метанола и антибиотиками ампицилл IHotn (500 мкг/MR) и этазолом (500 мкгlмл) в течение 60 — 70 ч при 42 С и используют для приго овления посевного материала, Биомассу с чашки Петри переносят в колбы Эрленмейера обьемом 750 мл со средой М9 (100 мл), антибиотиками и 2; мета20

55 нола и инкубируют на качалке в течение

36 — 42 ч при интенсивном перемешивании и

42 С. Клеточную суспензию с оптической плотностью до 2-2,2 оптических единиц переносят в ферментер объемом 2 л, содержащий питательную среду следующего состава, г/л: Na2HPO4 12HzO 6,0; КН2РО4—

3,0; NH4Cl 1.0; NaCI 0,5; MgSQ4 7Н20 0,2;

CaCtg 0,011, микроэлементы, ампициллин

500 мкгlмл; этазол 500 мкг/мл, метанол 100 мл.

Ферментацию проводят в гечение 70 ч при рН 6,7, температуре 42 С, парциальном давлении растворенного кислорода 2030 от насыщения, которое поддерживают изменением оборотов мешалки при расходе воздуха 1:1. Культуру выращивают до концентрации биомассы 25 г/л, культуральную жидкость центрифугируют и определя ют эн-. томицидную активность биомассы путем скармливания гусеницам непарного шелкопряда 1-2 возраста. Для этого на чашки Петри наносят по 3 r искусственной питательной среды для насекомых и 0,65 мл анализируемого образца культуральной жидкости и 15 гусениц, инкубируют при

22 С при дневном свете не мене 12-16 ч.

Гибель гусениц оценивают на 5-й день наблюдения.

Смертность, оцененная на 5-й день достигает 86,2 — 90,7 . 8 контроле при использовании метилотрофных бактерий бесплазмидного штамма М flageilatum КТ гибель гусениц не наблюдается. . При использовании лиофилизирован- ного образца биомассы бактерий

M.fiagellatum КТ(рАУС135а) при концентрации 400 мкг/мл биомассы гибель гусениц достигает 90Я .

Таким образом, штамм Methytobaclttus

fiagellatum КТ (рАУС135а) растет только на средах, содержащих в качестве единственного источника углерода метанол; — растет на дешевых синтетических средах при 37-42 С, что обеспечивает снижение себестоимости производства энтомицидного токсина; для бактерий вида Methytobactttus

flagellatum не описаны фаги, что исключает возйожность фаголизиса предлагаемого штамма в промышленном производстве; плаз мида рАУС135а стабил ьно наследуются при культивировании штамма, что способствует стабильности уровня накопления токсина при его производстве. (56) ЕПВ, кл. С 12 N 15/00, 0200708, 1986, 1628527

Составитель Т,Забойкина

Техред ММоргентал Корректор H.Ìèëþêîâa

Редактор В.Трубченко

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Заказ 3193

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рАСУ135а, кодирующая энтомоцидный токсин размером 213 т.п.н., содержащая: - 5

Вав Hl - Bam Hl - фрагмент вектора рАУС75 размером 8,8 т.п.н.; - Bam Hl - Bam

Hl - фрагмент плазмиды рОК2 размером

12,8 т.п.н.; фрагмент ДНК хромосомы

Bacillus thurlnglensis размером 3 т.п.н„не- 10 сущий ген энтомоцидного токсина, - Ар ген устойчивости к ампициллину; - Sn - ген устойчивости к этазолу; - гены orIT и mob, ответственные за мобилизацию плазмиды в широкий круг грамотрицательных бактерий: сайты расщепления.эндонуклеазами рестрикции Sacl (8,6 и 13,1 т.п.н.), Вав Hl (О и 8,8 т,п.н,).

2. Штамм бактерий Methylobacillus

fIagellatum ВКПМ в 4198 - продуцент энтомоцидного токсина.