Штамм бактерий rнizовiuм lеguмinоsаruм вiоvаr viceae для получения бактериального удобрения под вику
Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур, и представляет собой штамм клубеньковых бактерий, используемых для предпосевной обработки семян вики. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий вики с более высокой эффективностью симбиотической азотфиксации для производства бактериального удобрения под вику. 1Чтамм бактерий Rhizobium leguminosarum biovar biceae № 0622 выделен из клубеньков вики посевной, экотипа из Марокко, произраставшей на дерново-подзолистой , хорошо окультуренной почве. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером ВНИИСХМ № 0622. Штамм 0622 позволяет увеличить в среднем урожай зернавики на 6 ц/гк (25,6%), влажной зеленой массы - на 27 ц/га (8,8%) и сухой зеленой массы - на 12,0 ц/га (16,2%) по сравнению с известным штаммом. 5 табл. I (П
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН (51)5 С 05 F ii/08, С 12 N I/20 //
//(С 12 N 1/20, С 12 R 1/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
КГ60 1/3-,„
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ производства бактериального удобрения под вику.
Бактерии штамма ЕМzobium leguminosarum biovar biceae У 0622 выделены из клубеньков вики посевной, экотипа из Марокко, произраставшей на дерново-подзолистой, хорошо окультуренной.почвз.
Штамм R.leguminosarum bv. viceae депонирован и хранится во Всесоюзной коллекции клубеньковых бактерий
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ
l1O ИЗО6Р1=ТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ AEHT СССР (21) 4660289/13 (22) 09.03.89 (46) 23.02.91. Бюл. 9 7 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (72) А.Т.Новикова, В.Л.Князева, А.П.Кожемяхов и Н.Г.Орищенко (53) 631.847.211(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
У 629733, кл. С 05 Е 1!/08, 1977. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВНТКOHIUM LFGUMIN0SARUM BI0VAR 7?СЕАЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ
БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД ВИКУ (57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур, и представляет собой штамм клубеньковых бактерий, используемых для предИзобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур, и представляет собой штамм клубеньковых бактерий, используемых для предпосевной обработки семян вики.
Целью изобретения является получение нового штамма клубеньковых бактерий вики с более высокой эффективно- стью симбиотической азотфиксации для
„„SU„„1629295 А 1
2 посевной обработки семян вики. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий вики с более высокой эффективностью симбиотической азотфиксации для производства бактериального удобрения под вику. Штамм бактерий Rhizobium leguminosarum biovar
biceae У .0622 выделен иэ клубеньков вики посевной, экотипа иэ Марокко, произраставшей на дерново-подзолистой, хорошо окультуренной почве. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером ВНИИСХМ Р 0622. Штамм 0622 позволяет увеличить в среднем урожай зерна вики на 6 ц/гк (25,67), влажной зеленой массы — на 27 ц/га (8,87) и сухой зеленой массы — на 12,0 ц/га (16,2X) по сравнению с известным штаммом.
5 табл.
1629295
45 во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под ¹ 0622.
Культурально-морфологические признаки штамма. Штамм 0622 растет на питательных средах. Гороховый агар, г/л: горох 100,0; сахароза .20,0; агар 20,0; рН среды 6,8-7,0. Маннитно-дрожжевой агар, г/л: маннит
10,0; К НРО 0,5; NgSOyх 7Н О 0,2;
НаС1 0,1 дрожжевой экстракт 0,4; агар.15,0; рН среды 6,8-7,0.
Маннитно-дрожжевой агар с бромтимол синим, г/л: маннит 10,0;
К НРО4 0,5; MgSOyx7H 0,1; дрожжевой экстракт 0,4: агар 15,0; бромтимол синий 5 мл; 0,5% спиртового раствора, рН среды 6,87,0. Бактерии штамма №- 0622 имеют фор- 20 му палочек: до 36 ч подвижные, через 48 ч утрачивают подвижность, перитрихи, грамотрицательные. Величина клеток 2-суточной культуры на гороховом агаре 1,2-1,8х0,7-0,8 мкм. Бактери- 25 циды имеют ветвистую форму. Быстрорастущая культура. Штрих на гороховом arape умеренный, бесцветный, алабовыпуклый, слизистый, стекающий. Колонии появляются на 3-и сутки, однотипные, круглые, выпуклые, слизистые, беловатые до 2 мм. На маннитно-дрожжевом arape штрих обильный, бесцветный, плоский, слизистый, стекающий. Колонии появляются на 3-и сутки, однотипные, круглые, 35 слабо-растекающиеся, выпуклые, слизистые, беловатые до 3 мм. На маннитно-дрожжевом агаре с бромтимол синим признаки штамма 0622 аналогичны росту на маннитно-дрожжевом агаре, но культура и среда окрашиваются в желтоватый цвет, Физиолого-.биохимические признаки штамма ¹ 0622. Молоко с лакмусом не пептонизирует, подщелачивает с образованием слизистой прозрачной зоны на поверхности, Подщелачивание молока с лакмусом происходит на 2-е сутки, максимальное изменение окраски отмечается на 3-5-е сутки. Образование слизистой зоны происходит на 3-и сутки, максимальных размером (до 3 мм) она достигает через 15 сут. Маннитно-дрожжевбй агар с бромтимол синим подкис55 i ляет. Желатину не разжижает. Аэроб, о оптимум температуры 26"28 С при оп" тимуме рН 6,8-7,0. Предельные значения рН для роста 5,8-7,5. Отношение к углеродам, Растет на средах с углеводами, подкисляя среду. Активно усваивает глюкозу, галактозу, рамнозу, ксилоэу, мальтозу, сахарозу, лактозу, маннит, сорбит, клетчатку и крахмал не используют. Отношение к источникам азота. Хорошо растет на средах с азотнокислым натрием, аммонийными солями, тирозином. На МПА не растет, Признаки штамма устойчивы. Штамм не патогенен. Штамм № 0622 хранится на гороховом агаре при 4-5 С и пересевается один раз в 6 мес. Технология приготовления препарата на основе штамма № 0622. Посевную культуру выращивают на качалке в колбах и пятилитровых бутылях в течение 2 сут на среде следую— щего состава, мас. : гороховый агар 10,0; сахар,(пищевой) 1,0; (NH )zSÎ 0,05; КНдРОс, 0,05 . К НРО,,ЗН О 0,05 Mg$0 i 7Н О О,02. СаСО О 1 водопроводная вода до 100,0; рН после стерилизации (1,0 атм, 30 мин) 6,8-7,0. Титр клеток 3-4 млрд/мл. Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культуры. Ее готовят в пятилитровых бутылях или фермантаторах на среде следующего состава, мас.%: кукурузный экстракт 1,0; меласса 2,0; (ЕН ) 80,1 О,1; КН Р01. 0,025; К НРО4iЗН О 0,025; MgSOp 7Н О 0,02; CaCOg 0,1; водопроводная вода до 100,0; рН после стерилизации 6,8-7,0. Бутыли и ферментаторы засевают посевной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5%, Бутыли встряхивают на качалке в течение 40-48 ч. В ферментаторах бактерии выращивают 18-36 ч при аэрации 0,7-1,5 об/мин под избыточным давлением 0,3-0,5 атм, при 28 30 С Титр 4 5уО млрд/мл. После микробиологического контроля культуральную жидкость из бутылей или ферментаторов — инокулюм используют для смешивания с торфом, Подготовка торфа. Размолотый низинный торф, нейтрализованный меломдо рН 6,8-7,0,влажностью 30-40 в полиэтиле,новых пакетах по 200-400 r стерилизуют гамма-облучением при дозе 2 5 Мрад. Стерильный торф в пакетах инокулируют инъекцией смеси: культуральная жидкость + меласса (б ) из расчета исход162929 Спосо6 внесения препарата с ер щий: 200 г ризоторфина разводят н 1,5 л водопроводной воды и, не давая суспензии -отстаиваться, наносят ее на гектарную норму семян. Затем сеного титра бактерий н торфе 0,30,5 млрд/г торфа и влажности 45"60Х. Затем пакеты загружают в специальные смесители, при вращении которых перемешивается их содержимое. Культуру в торфе подращинают, выдерживая пакеты 3-5 сут при )5-20оС Ризоторфин хранят при 3-8 С в темном сухом помещео нии отдельно от ядохимикатов. 10 Характеристика готового продукта. Ризоторфин для вики на предлагаемом штамме представляет по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета, без запаха, нерастворимую в воде. Влажность готового препарата 50-55%. Ризоторфин содержит 4-6 млрд клубеньковых бактерий на 1 г торфа. Срок годности препарата 6 мес со дня изготовления, Расход препарата 200 г 20 на гектарную норму семян. Условия проведения вегетационных и полевых опытов. Вегетационные опыты проводят в сосудах с 6 кг дерновоподзолйстой -почвы с внесением солей 25 по прописи Прянишникова, r/êã почвы; КС1 0,15; MgS04 0,06; СаНР04 0,172; МпБО4 0,003; борная кислота 0,003; (%14) Мо04 0,001; но без азота. Повторность опыта четырехкратная. 30 Используются районированный сорт вики Немчиновская 72. Для инокуляции семян ники чистую культуру бактерий выращивают на скошенном гороховом агаре. .Культуру в пробирках с титром 4-6 млрд омывают водопроводной водой, затем суспензию наносят на семена вики, разложенные в лунки, сделанные н почве каждого сосуда. В сосуд вносят 10 клеток. Полевые опыты проводят в районах, рекомендованных для возделывания ни ки, на почвах, типичных для этих регионов. Используется агротехника выращивания вики, принятая в каждом 45 конкретном районе. Доза препарата 200 r на гектарную норму семян. В опытах используются районированные сорта вики: Немчиновская 72, Белорозовая 109, Камалинская 611. Повторность опытов четырехкратная. В полевых опытах семена вики обрабатывают торфяным препаратом-ризоторфином, изготовленным, на опытах штаммах. 5 6 мена тщательно перемешивают для равномерного распределения преп. рата. Обработанные ризоторфином семена высеивают в тот же день но влажную почву. Площадь опытных делянок 10-20 .м Пример 1. Эффективность симбиотической аэотфиксации у штамма У 0622 в сравнении с известным штаммом У 145 определяют в вегетационных опытах, поставленных по описанной методике, по величине урожая зеленой массы вики. Полученные данные приведены в табл.1. Kaid показывают данные табл.1, клубеньконые бактерии вики штамма У 0622 обеспечивают более высокую эффективность азотфиксации, в результате чего урожай зеленой массы растений, инокулированных этим штаммом, на 20,7Х выше, чем у растений, бактеризованных штаммом У 145. Содержание общего азота у растений, инокулированных штаммами, было одинаковым, но за счет более высокого уровня зеленой массы при бактеризации штаммом Р 0622 накопление азота н этом варианте на 21,6 выше, чем от штамма Р 145. Пример 2 ° Эффективность штаммов R leguminosarum Ьч. viceae У-0622 и Р 145 определяют в полевых опытах по конкурсному испытанию штаммов клубеньковых бактерий вики в научных учреждениях Географической сети опытов с азотфиксирующими микроорганизмами (табл.2) по величине урожая зерна и зеленой массы (влажной и сухой). Данные табл.2 показывают, что штамм Р 0622 отличается от известного штамма Р 145 более высокой и стабильной эффективностью. Средняя грибавка урожая зерна, зеленой массы (влажной и сухой) вики составляет 9,4, 76,5 и 21,0 ц/га соответственно,.что на 6,0 (25,6 ), 27 (8,8 ) и 12,0 ц/ra (16,2 ) превышает урожай, полученный при использовании штамма Р 145, кото-. рый в ряде опытов не обеспечивает достоверного повышения урожая (опыты 1 и 4) ° Содержание белка в урожае вики, инокулированной штаммами Р 0622 и У 145, было одинаковым. Влияние штаммов Р 145 и Р 0622 клубеньковых бактерий вики на содержание белка в урожае (полевые опыты) показано в табл.3. Условия проведения полевых опытов и эффективность штаммов Р 145 иР 0622 1629295 Таблица 1 Варианты инокуляции Прибавка урожая к штамму N- 145 Накопление азота Урожай надземной масСодержание общего азота на сосуд, мг г/состав % сы, г/состав в растениях, % «1 21,6 30,5 37,1 0,94 1,05 1,06 20,7 0,6 Таблица 2 Прибавка ур ная ot нтан ма Р 0622 п сравнению с нтамном е 14 Бид .продукта Урокаи в конт ропе, ц/га Прибавка урокая при испольео888ББнтвнмов татнсти eckIA обаботка ц/га р 145 р 0622 р 145 р 0622 ц/га Й l5 0 25,5 Z0,3 199 Зерно о Немчиновская 72 Бело-розовая 109 Среднее Вело-роэовая.109 6,0 3,$ 3,6 3,7 4,2 7,9 6,0 25,5 25,7 25 6 10,0 5,7 10 38,0 ! 3,1 20,4 51,4 9>4 15 ° 2 44 ° 7 )l9 45,2 . 59,8 I 5 5,2 3,4 Зеленая масса S2 4S8 9 ЭЯ 49>5 76 ° 5 10,9 15,6 7>1 26>4. 4 Немчиновская 12 Среднее 5 Немчиновская 72 6 Баналинская 611 2,3 25,3 7,6 8,8 7, l 25,2 27 4 7 19 3 2,1 10,3 24,0 35>1 l9>9 28,4 l0 2 Э7,9 329 264 54>9 69>6 2,0 3 9 4,4 3,9 Сукая зеленая масса 62>3 9>0 21>0 15>l 33>Z 12>0 16>2 Среднее клубеньковых бактерий вики даны в табл.4.: Как показывают данные табл.4, штамм 18 0622 дает значительную большую при5 бавку урожая зеленой массы вики, чем штамм У 145. Пример 3. Дополнительным преимуществом штамма У 0622 являются его. высокие технологические свойства, при-10 веденные в табл.5. Данные табл.5 показывают, что по основным технологическим показателям бактерии штамма 1г 0622 превосходят штамм 11 145, т.е. более интенсивно размножаются на жидких регламентных средах, дают более высокие титры в торфяном препарате. Особо следует отметить стабильность показателя высокой Без инокуляции. 2,3 Штамм 11>145 2,9 Штамм 11>0622 . 3,5 P 3,2%; НСР— 0,3 г/состав выживаемости бактерир1,, в препарате при хранении. В изученных регионах возделывания вики при бактеризации ее семян ризоторфином на основе штамма 11> 0622 получают более высокую урожайность зерна и зеленой массы, чем при использовании штамма 11> 145. Кроме того, предлагаемый штамм клубеньковых бактерий вики превосходит штамм Р 145 по технологическим свойствам. Формула изобретения Штамм бактерий Rhizobium leguminosarum biovar viceae BHHHCXM Р 0622 для получения бактериального удобрения под вику. 1629295 Содержание белка в урожае,7 при использовании штаммов Сорт вики h"- 145 . N - 0622! 5,8 18,8 ! 8,4 Показ.атели Вариант 2 млрд/г Чернозем южный карбонатный. 200 с титром 3-5 Дерново-подзолистая, хорошо окультурен-,. ная Немчиновская 72 12 Камалинская 611 20 Не вносят 329 69,6 7,1 26,4 34 2,3 25 3 4,5 3,9 15,6 15,8 Штамм Титр бактерий, млрд/мл 145 2,2 0622 2,9 4,3 5,5 Немчиновская 72 15,6 Бело-розовая 109 18,7 Немчиновская 72 18,5 Доза препарата на 1 га,г Почва Сорт вики Повторность и Площадь делянки, м Количество минерального удобрения — нитроаммофоса, ц/га Урожай зеленой массы в контроле, ц/га Прибавка урожая зеленой массы, ц/га, от штаммов: 1!2 145, !!2 0622 Статистическая обработка Р, 7 НСРО 5, Содержание белка, 7: У 0622 Ф в посевной в рабочей культуре культуре Таблица 3 Таблица 4 Таблица 5 Титр бактерий в торфяном препарате, млрд/г, при сроке хранения 10 дн. 1 мес. 3 мес. 6мес. 0,7 4,4 2,9 0,9 . l,6 5,5 8,2, 5,5