Способ выделения пероксидазы из культурального фильтрата базидиального гриба cerrena махiма murr
Изобретение относится к производству ферментных препаратов, котомогут быть использованы для аналитических целей в микробиологической промышленности, в медицине для осуществления иммунопероксидазного метода гистологических исследований, проводимых в целях диагностики, Целью изобретения является повышение удельной активности пероксидазы, чистоты препарата и его термостабильности с сохранением суммарной активности фермента . Способ заключается в том, что выделение пероксидазы из культурального фильтрата базидиального гриба Cerrena maxima Murr проводят с использованием аффинного сорбента на основе альгинатного волокна, содержащего в своей структуре альбумин, ковалентно связанный глутаровым альдегидом. Обратимое взаимодействие пероксидазы с аффинным лигандом альбумином обеспечивает строгую специфичность по отношению к ферменту, Комплекс альбумин - пероксидаза разрушается в процессе десорбции 0,2 М уксусно-ацетатным буфером рН 4,7, причем пероксидаэа переходит в раствор, а селективный сорбент остается работоспособным для следующего цикла сорбции-десорбции . Применение нового селективного сорбента позволяет получить пероксидазу из культурального фильтрата с высокой удельной активностью
QQQ3 СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИН (51) 5 C 12 N 9/08
\ яп 1 Й
: ° 4 .а
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ к вто скомм свидктельствм
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
,21) 4642957/13 (22) 26. 12. 88 (46) 23.02.91. Бюп. У 7 (71) Ленинградский институт текстильной и легкой промппленности им. С.M Êèðîâà и Ботанический институт им. В.Л.Комарова (72) Н.И.Свердлова, В.П. Гаврилова, И,И.Шамолииа, Т. Н. Калинина, Е.Л.Илларионова, E. Н.Алексеева и И.Б.Курочкина (53) 577.15,07 (088.8) (56) Гаврилова В. П., Шамолина И.И., Степанова Л,С. Иммобилизация пероксидаэы из культурального фильтрата базидиального гриба Сеггепа maxima
Murr. - Прикладная биохимическая микробиология, 1981, т. 17, Р 2, с. 261264.
Свердлова Н.И., Данилова Е.Я., Шамолина И.И, Вольф Л.А. Изучение взаимодействия ионообменных полиакрилонитрильных волокон с пероксидазой иэ базидиального гриба Cerrena maxima Ицгг. " Химическая технология, свойства и применение пластмасс: Межвузовский сборник научных трудов.
Л.: ЛТИ им. Ленсовета, 1985, с. 123131. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЦ1ИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ ИЗ
КУЛЬТУРАЛЬНОГО ФИЛЬТРАТА БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА CERRENA MAXIMA MURR (57) Изобретение относится к производству ферментных препаратов, котоИзобретение относится к производству ферментных препаратов, которые
2 могут быть использ ованы для ана— литических целей ы микробиологической промышленности, в медицине для осуще ствле ния иммунолеро ксид as но ro метода гистологических исследований, проводимых в целях диагностики, Целью изобретения является повышение удельной активности пероксидазы, чистоты препарата и его термостабильности с сохранением суммарной активности фермента. Способ заключается в том, что выделение пероксидазы из культурального фильтрата базидиального гриба
Ce r rena maxima Mu r r проводят с использованием аффинного сорбента на основе альгинатного волокна, содержащего в своей структуре альбумин, ковалентно связанный глутаровым альдегидом.
Обратимое взаимодействие пероксидазы с аффинным лигандом альбумином обес- (, печивает строгую специфичность по от ношению к ферменту. Комплекс альбумин — пероксидаза разрушается в процессе десорбции 0,2 И уксусно-ацетат- щ» ным буфером рН 4,7, причем перокси- @ даэа переходит в раствор, а селективный сорбент остается работоспособным для следующего цикла сорбции-десорбции. Применение нового селективМного сорбента позволяет получить пе- ©» роксидазу иэ культурального фильтрата с высокой удельной активностью (68,7 ед. /мг белка), чистотой (R =
=0,87) и высокой термостабильностью.
4 табл. . 3 могут быть использованы для аналитических целей особенно в микробиоло1629316 гической промышленности, в медицине для осуществления иммунопероксидазного метода гистологических исследований проводимых в целях диагности9
5 ки е
Целью изобретения является повышение удельной активности, чистоты препарата пероксидазы и его термостабил ьности с сохр анение м суммарной активности фермента.
Способ заключается в том, что в предлагаемом способе выделение пероксидазы из культур ального фильтр ата (КФ) базидиального гриба Cerrena ma"
xi ma Nurr используют волокнистый сорбент из альгинатного волокна с содержанием альдегидных групп глутарового альдегида 0,85-0,90 мас. . и альбу1 1- 1 3 Ml /r HolloKHa, Волокнистыи сорбент с указанным содержанием альдегидных групп глутарового альдегида и альбумина обеспечивает согласно спосо1 бу возможность получения пероксидазы с удельной активностью 68,3 ед/мг 25 белка, чистотой ИХ=09 87, термостабильностью при инкубации в течение 10 мин при 80 С 97Х и при 90 С 78 от исходной активности с сохранением суммарной активности по сравнению с исходной 81,1Х.
Пример ы 1-12, Апьгинатные волокна сформовань1: из 9 -ного водного раствора альгината натрия с рН
6 в осадительную ванну, содержащую 5Х хлористого кальция и 3 ммоль/л соляной кислоты.
Температура приготовления: прядильо ного р аст вор а 60 С, те мне р атур а формования 30 С, температура осадительо ной и пластификационной ванн 20 С.
Скорость формования 2,5 м/мин, величины фильерной и пластификационной вытяжек 140 и 85 соответственно. Ппастификационное вытягивание проводят в среде изопропилового спирта, Апьгинатные волокна имеют абсолютную разрывную нагрузку 14,8 сН, относительное разрывное удлинение 1997%.
Альгинатное волокно массой 10 r9 модифицированное глутановым апьдегидом с содержание.м альдегидных групп
0,80 мас. обрабатывают раствором апьбумина с концентрацией 1 мг/мп при
18+2 С в течение 60 мин. Получают волокно с содержанием 9 мг/г ковалентно присоединенного альбумина. Продукт, промывают дистиллированной водой и обрабатывают 1000 мл КФ базидиально-.
ro гриба Се r rena maxi ma ии г г в течение
20 мин при 18+2 гС. Затем волокно отделяют от жидкой фазы и промывают дистиллированной водой до отсутствия в промывных водах белка. Разрушение комплекса альбумин-пероксидаза осуществляют 500 мл 0,2 М уксусно-ацетатного буфера в течение 10 мин при
18+2 С. Раствор белка в указанном буо фере подвергают диалиэу против воды в течение 24 ч и лиофильной сушке. В полученном препарате определяют пероксидазную активность по скорости расщепления пероксида водорода с применением о-дианизидина как донора водорода9 которую измеряют по изменению скорости развития окраски при
460 нм. Содержание белка определяют по изменению окраски красителя
Coomassi c 81ое. Термостабильность устанавливают путем инкубации испытуемого образца в 0,01 М ацетатном буфере при 80 и 90 С в течение 10 мин.
Активность вьщеленной пероксидазы составляет 63,5 от исходной, удельная активность 50, 7 ед. /мг, чистота фермента К 0,63, термостабильность9 характеризуемая сохранением активнос- . ти препарата фермента, при 80 C cocо тавляет 81Х, при 90 С вЂ” 53 .
Характеристика пероксидазы, вьщеленной из КФ Сеггепа maxima Hurr селективными сорбентами волокнистой структуры, с различным содержанием альдегидных групп и альбумина приведена в табл. 1.
Анализ данных табл. 1 показывает, что уменьшение содержания альдегидных групп (менее 0,80 мас. ) невозможно, так как альгинатное волокно набухает и разрушается в процессе десорбции уксусно-ацетатным буфером, о чем свидетельствует изменение усадки волокна от 2,5 при содержании альдегидных групп 0,77 мас. . (пример 3) до 5,4g при содержании альдегидных групп 0,87 мас.Х и выше (примеры 6-12). Увеличение содержания альбумина в,волокне влечет за собой повышение выхода пероксидазы от
63,5 до 81,1 от начапьного содержания по активности в КФ. Увеличить содержание апьбумина в альгинатном волокне (более 13 мг/г) экспериментально не удалось, Удельная активность также возрас- тает от 50 7 (пример 6) до 68,3 ед,/, /мг (пример 12) при увеличении чис5 16293 тоты препарата, характеризуемой пока зателем R» который возрастает в указанном ряду от .0,63 до 0,87. Термостабильность выделенного препарата пероксидазы повышается с увеличением его чистоты.
Учитывая это, оптимальное количество альдегидных групп в структуре альгинатного волокна составляет 0,850,90 мас.7, а содержание альбумина
11-13 мг/г сухого сорбента.
Результаты сорбции и десорбции окислительно-восстановительного фермента пероксидазы приведены в табл. 2.
Анализ данных табл. 2 показывает, что использование предлагаемого способа по сравнению с известным позволяет получить препарат с удельной актив- 20 ностью 68,3 ед./мг, что в 2,2 раза выше, чем по известному способу, причем выход фермента по активности не снижается и составляет 81,17, при этом термостабильность пероксидазы значи- 25 тельно возрастает в сравнении с из— вестным способом.
Пример 13. Аффинный сорбент может быть использован многократно.
Результаты исследования альгинатного 30 волокна, модифицированного глутаровым альдегидом и альбумином в нескольких циклах сорбции и десорбции окислительно-восстановительного, фермента пероксидазы из КФ Cerrena maxima Nurr приведены в табл. 3.
I !
:Анализ данных табл. 3 показывает, что использование указанного волокна в нескольких циклах сорбции-десорб- 40 ции снижает выход препарата пероксидазы от цикла к циклу. Хотя свойства выделенной пероксидазы изменяются незначительно, использование сорб ента более чем в 7 циклах работы нецелесообразно с экономической точки зрения, 16 о так как выход препарата значительно снижается.
Характеристика прочностных свойств модифицированного альгинаторного волокна изменяется несущественно, что позволяет рекомендовать его для проведения регенерации. Последнюю осуществляют путем обработки волокна
0,1 М HCI и альбумином. После регенерации работоспособность волокна по отношению к пероксидазе восстанавливается, Физико-механические ."войства
l альгинатного волокна позволяют проводить три цикла регенерации (табл. 4) °
Из данных табл. 4 видно, что в четвертом цикле регенерации абсолютная разрывная нагрузка и относительное удлинение уменьшаются, вследствие этого волокно теряет способность к формоу стойчивости.
Учитывая возможность регенерации, альгинатное волокно, модифицированное глутаровым апьдегидом и альбумином можно использовать в 4к7=28 циклах сорбции пероксидазы из КФ Cerrena
maxima Иигг.
Формула изобретения
Способ выделения пероксидазы из культурального фипьтрата базидиального гриба Cerrena maxima Hurr, включающий взаимодействие культурального фипьтрата с волокнистым сорбентом с последующей десорбцией фермента уксусно-ацетатным буфером, о т л и ч аI ю шийся тем, что, с целью повышения удельной активности, чистоты препарата пероксидазы и его термостабильности с сохранением суммарной активности фермента, в качестве волокнистого, сорбента используют альгинатное волокно, содержащее 0,85-0,90 мас.Ж .альдегидных групп глутарового альдегида и 10-13 мг апьбумина на 1 г .сухого сорбента, )6293)6 и!
Д l (1
И о а
«tl (»
О
СО лс r л сО сО со а л а а оооо («« св(° в
О (а м
U w о с( и Q йГ, I о (с
В с о
1С ьГ
О
«:О
QCt ."
«J g lO
> о
333
Вэ а
g аа и л о м а еь а а с (с(с
«е а а 5 а а а а агьла
1
K а
Ц о
0 а а у(1 и Св
Ц у а
О I
1
I (4
О
cd ж о
Ф
I l I 1 !
О О (I
1 I I I I I
«Ч
«а
1
Х
g а с
1 о
I Ж
А
3 о
«d (а
«) а о л а и
«((о
I.
1 Г
1 K
1 а
«((I с:(0
l
I 1 (о
I Э
Х
Ж «(( а Ов (» а «d
C О о с( (С E
1 I
1 t! о
1
I
t! о
СО
1 l
Л Л СО М с СО С0 ! аааеiолt r r
l О\ О л ««со М с/Ъ л (Л СO 00 СО СО О1 Ch Ch Ch О О Yl л мм I а а л а В ООООО с(О ллс(сол Мм а В б а еь а В еь а «ч « О с(и О л со со М О1 О О во О 1О О 1 1 мсчаОcnO — —— В В б а В ев а В а м л м щ «) ° л се ьО а л л СО 00 со ООФООООО Г 00 Оь О1 О С (О л О «Ч ссь л О1 О Ch СО СО CO СО СО Ch ев а я В A еь o o ОООООООО Ю а Ф Ф л СО Ов « « 1629316 Ю 1 1» абой 3 g xw ы Ы 3» Сс O с33-Ыс) сЧ Ю О л л с Ъ О ыое О 33 ф 3» )33 Ю О С» ф Р ы "ф с3 с32 о 1 3» 1Р t 5. Ю ° . 3 ц A 3» Ф с Ъ Ю сЧ л Ю О сЧ. л C3 CV ) I t с Ъ с Ъ N hl с ) сч 1 С) о 8 О CO O O с Ъ 1 331 о i i:3 ф в I с Ъ D о1 Ю О оъ Ф В Ф О 1 I 1 и Ф С) 1 Зо» as x И 43 XC3X с» 3 сс) СЬ t k t !! м l В 2I 1а аи Ьа и ! ct t 5c) ьо ! 3C I 3 3 5 2К о,ссЪ л O В О ф ф О О а В О О РЪ re В В cv с) 1 ! 1 С3 1 Э 1 Ю 1 ь 1 О g Оы X 1 Î а Е О 3 С3, З а 3- сВ R X CS f а 5 а 4 3 5 5 i 3 33 5 t I 1 1 ! 1629316! ! 0)g 1 Уе о о I I o 1 а 1 1 ) ! t 1 1 1 Cl 1 1 (1 Ia Я» I х 01 i ! 1 и »!1 в в о m л ° Ф »Ч о »Ч <Ч »Ч »Ч л 0» СЧ ФЪ о о 1 1 01 » О»0 » о Л и а 0» л 00 о 00 Ф O O Ф Ф »0 а 1»а I & I0Мф0» а1 2 aI lo л сч а а 4Ч ф 1 1 I I а Х о 1 0» 1 Г4 о а а в Ф 01 X I aI al Я а! О Ц 0» сл» 1 о о о о м Л СЪ IO л » о х о хо v x мх 00 01 О 00 л I »0! у х 1 i °, Э ! !! j4l CV (II) ф ! g Й aII М мф 3 6 а j 1 ф 1 I 1 ! "Б 1 о С» о 1 1 03 ,а » f и о 1 al 1 Х ! Я о о » Э I 0») Ф 16293! 6 13 Т аблица3 Цикл р або Характеристика волокна Характеристика пероксидазы Изменение усадки волокна в буфере, Ж АктивОт носительное Термостабильность, % от исходной, при о темпер атуре, С Выход, 7 от исходного ты ность ед/мг разрывное удлинение, Ж 80 90 П р и м е ч а н и е. Содержание альдегидных групп в волокне 0,90 мас.Ж содержание альбумина !3 мг/г. Т абли ца4 Цикл Абсолютная разрывная нагрузка сН От но сит ел ьное удлинение, Ж 2. 3 12,5 10 9 9,5 8,7 17,5 16,9 ! 6,1 15,0 Составитель А. Семенов Техред А. Кравчук. Редактор Н. Гунько Корректор М. Шароши Заказ 410 Тираж 362 . Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101! 81,1 2 81,0 3 76,3 4 70,5 5 65,1 6 605 7 55,7 8 53,0 68,3 68,3 67,9 66,3 65,5 64,5 64;0 64,0 0,87 97 0,87 97 0,85 95 0,83 95 0,83 93 0,80 93 Оь 80 93 0,79 90 78 78 73 73 73 Аб солютная р аз рывная нагрузка, сН! 4,8 ! 4,8 4,! ! 3,5 13,0 ! 3,0 12,5 12,0 19,7 ! 9,7 19 ° 2 ! 8,4 18,0 18,0 l7 5 17,3 5,4 5,4 5 4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4
