Способ получения полимерного гидрогеля с ковалентно иммобилизованным ферментом-холинэстеразой

 

Изобретение относится к -iCH2-CH)r CH2-CHV CH2-CH 2 химий полимеров и химической энзимо- 1 логии и может быть использовано в химическом анализе и медицине для определения субстратов холинэстеразы, детоксикации биологических жидкостей и медицинской диагностики. Изобретение позволяет создать полимерный гидрогель с ковалентно иммобилизованной холинэстераэой, обладающей повышенной (в 2,0-3,3 раза) устойчивостью к действию фосфорорганических соединений при сохранении общей ферментативной активности. Это достигается ацилированнем водного раствора холинэстеразы хлорангидридом ненасыщенной кислоты при рН 7,5, 9,0 и молярном соотношении фермента и хлорангидрида 1:(10- и последующей радикальной сополимеризацией ацилированного фермента с гидрофильным мономером и бифункциональным сомономером - сшивателем в присутствии 1-4% от массы реакционной смеси линейного водорастворимого сополимера общей формулы V CH2-CH NHo Ј (Л о СО -и 0 J ю

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 08 Г 289/00, 2/16, С 12 N 11/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ЮТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

- сн,— сн -(сн; с н -„— (сн; сн3-, 1

С=О

1 ЧН2 м®

СН2ВГ

C=NOH где r. = 50-55 мол.7:, у = 10-15 мол., 2 табл.

z = . О-40 мо:t.7,, мол.м.50000-100000.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4663300/05 (22) 17.03.89 (46) 15.03.91. Бюл. В 10 (71) МГУ им.М.В.Ломоносова и Институт нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева (72) А.К.Андрианов, В.В.Чупов, Л.И.Валуев и Н.А.Платэ (53) 678.745-139(088.8) (56) Axen R. Heilbronn Е., Winter А., Preparation and properties of cholinesterases covalently bound to

sepharose. Biochem. Biophys.Acta, 1969, v.191, 11 2, р.478-481.

Андрианов В.K-, Платэ Н.А. Ковалентная иммобилизация холинэстераз в матрицах высоконабухающих сшитых сополимеров, Материалы VI Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии, Вильнюс, 1988, ч.I, с.56. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНОГО

ГРЩРОГЕЛЯ С КОВАЛЕНТНО ИММОБИЛИЗОВАН

HblM ФЕРМЕНТОМ вЂ” ХОЛИНЗСТЕРАЗОЙ (57) Изобретение относится к

„„SU,„, 16 4672 А 1 химий полимеров и химической энзимо- логии и может быть использовано в химическом анализе и медицине для определения субстратов холинэстеразы, детоксикации биологических жидкостей и медицинской диагностики. Изобретение позволяет создать полимерный гидрогель с ковалентно иммобилизованной холинэстеразой, обладающей повышенной (в 2,0-3,3 раза) устойчивостью к действию фосфорорганических соединений при сохранении общей ферментативной активности. Это достигается ацилированием водного раствора холинэстеразы хлорангидридом ненасыщенной кислоты при рН 7,5, 9,0 и молярном соотношении фермента и хлорангидрида 1:(10200) и последующей радикальной сополимеризацией ацилированного фермента с гидрофильным мономером и бифункциональным сомономером — сшивателем в присутствии 1-47 от массы реакционной смеси линейного водорастворимого сополимера общей формулы

1634672

Изобретение относится к химии полимеров и химической энэимологии, а именно, к способу получения иммобилизованной на синтетических полимерах холинэстеразы.

Цель изобретения — повышение устойо чивости иммобилизованного фермента к действию фосфорорганических соединений при сохранении общей ферментатив- 10 ной активности.

Пример 1. Смесь мономеров, состоящую из 63,1 r (0,6 М) 4-винилпиридина (4-ВП) и 7,1 г (0,1 М) акрил- . амида (АА) растворяют в 120 мл диметилформамида, добавляют 0,12 r динитрила азобисизомасляной кислоты, обезгаживают и полимериэуют при 60 С

24 ч. Синтезированный сополимер осаждают избытком диэтилового эфира, сушат, растворяют в 100 мл метанола и проводят реакцию с 2,8 r (0,014 M) фенацилбромида при 60 С 6 ч. Образующийся продукт выделяют осаждением в диэтиловом эфире и после сушки раст- 25 воряют в 40 мл абсолютного этанола, прибавляют 1, 1 г солянокислого гидроксиламина (0,016 И), 40 мл пиридина и выдерживают реакционную смесь при

80 С 5 ч. Сополимер осаждают диэтило- 30 вым эфиром и высушивают. Содержание звеньев АА и 4-ВП в сополимере определяют по данным элементного анализа некватернизованного образца, количество звеньев 4-винил-N-фенацилок35 симпиридинийбромида (4-ВФП) рассчитывали по данным ИК-спектроскопии и потенциометрического титрования оксимированного образца и модельных систем. Для данного сополимера значения 40 параметров х,у и z составляют 52,13 и 35 мол.Ж молекулярная масса, определенная методом светорассеяния, составляет 85000.

В табл.1 приведены данные синтеза, 45 сополимеров 4-винил-фенацилоксимпиридинийбромида, 4-винилпиридина и акриламида.

Пример 6. 2 г ацетилхолинэстеразы растворяют в 100 мл 0,1 M фосфатного буфера (рН 8,5), охлаждают до 0 С и по каплям добавляют ?1 мг хлорангидрида метакриловой кислоты, после чего раствор перемешивают 1520 мнн. К этому же раствору добавляют при перемешивании 29,4 r AA; 13,2 r N; . 55

N-метиленбисакриламида; 2,2 г сополимера, полученного по примеру !;

0,008 г персупьЬат» аммония, продувают аргоном 20-30 мин, затем добавляют

0,008 r N,N>N,N-тетраметилэтилендиамина и оставляют на 1 ч. Образовавшийся гель измельчают на нейлоновых ситах, промывают денонизованной водой и водно-спиртовой смесью и оставляют набухать в воде. Активность иммобилизованной холинэстеразы определяют спектрофотометрически порС -нафтилацетату. В качестве ингибитора холинэстеразы используют ДДВФ. Время полуинактивации исходной ацетилхолинэстеразы—

19 мин, иммобилизованной — 39 мин.

В табл.2 приведены свойства полимерного гидрогеля с ковалентно иммобилизованной холинэстеразой.

Пример 13 (контрольный).Все операции проводят аналогично примеру 6, используя те же соотношения Реагентов, но вместо сополимера, полученного по примеру 1, используют сополимер, полученный по примеру 4.

Время полуинактивации иммобилизованной холинэстеразы ДДВФ вЂ” 19,5 мин, исходной — 19 мин, остаточная активность — 977. от исходной.

Пример 14 (контрольный). Все операции проводят аналогично примеру 7, берут те же количества исходных веществ, но при этом используют сополимер, полученный по примеру 5. Время полуинактивации иммобилизованной холинэстеразы фосфаколом 16 мин, исходной — 16 мин, остаточная активность — 987 от исходной.

Пример 15 (контрольный). Все операции проводят аналогично примеру 6, используя те же соотношения реагентов, но при этом берут 0,7 г (0,5 мас.Ж) сополимера, полученного по примеру 1. Период полуинактивации иммобилизованной холинэстеразы ДДВФ—

19,3 мин, исходной — 19 мин, остаточная активность — 98K. от исходной.

Пример 16 (контрольный).Все операции проводят аналогично примеру 7, используя те же соотношения реагентов, но при этом берут 5,9 г (5 мас.7) сополимера, полученного по примеру 2. Время полуинактивации иммобилизованной холинэстеразы фосфаколом=

l6,l мин, исходной — 16 мин. Остаточная активность — 671 от исходной.

П р и и е р 17 (сравнительный).

Все операции проводят аналогично примеру Ь, используя те же соотношения реагентов, но при этом в реакционную смесь не добавляют сополимер указан-(сн,— СН СН2 си — „-(сц,— CH)

С=0 ! !

1Ч ® NH2 (СЦ2ВГ

C=NOH

z = 30-40 мол.7, с мол,м. 50000-100000. где x = 50-55 мол. Х; у = 10-15 мол.Х;

Таблица

Молекулярная мас-.

З са х)0

Количество Количество Состав сопол

ФАБ ГАИ ра, мас.X

Пример,!В

Состав мононериой смеси

4-ВП

Г ОЛЬ Х О одеркаия 4-,ВП сополи мере г моль. от со нас. Х мас.Х дерна ния

4-ВП в сопол ме е

Р

2,8 18

2,1 12

2,8 23

100

l l 2l 52 13 35

0,9 14 50 IO 40 !,О 25 55 15 30

6Э,!

81,0

120,0

7,1 10,1 !

3,8 14,6

8,! 6,3

89,9

85,4

93,7 о

2

4 (контрольяс)

5 (контрольный) 2,(26 О, 8 29 70 20 !О 245

I58 1 99,5 0,8 0,5

0,6 Il 50 5 45 20

59,2 78>I 16,6 21,9 1,6 10

Сополинер 4-вииилпиридина и акриламида до обработки ФЛБ.

П р и м е ч а и и е. Динитрил азобисизомасляной кислоты используется в следукв!нк количествах: пример 2 — 0,2 г; Э вЂ” 0,06 г; 4 - О, 04 ГI 5 О ° 25 r

Сокращения: 4-ВП вЂ” 4-винилпнридин; AA - акриламид; ФАБ - Фенацнларл ; ГАИ вЂ” гидроксиламин солянокнслый, 5 16346 ной структуры. Время полуинактивации иммобилиэованной холинэстераэы

19,2 мин, исходной — 19 мин.

Таким образом, предлагаемый способ

5 позволяет получать препараты иммобилиэованной холинэстераэы, обладающие повышенной устойчивостью иммобилизованного фермента к действию фосфорорганических соединений (в 2,0-3,3 раза), при сохранении ферментативной активности.

Формула и з о б р е т е н и я

Способ получения полимерного гидрогеля с ковалентно иимобилиэованным ферментом — холинзстеразой путем ацилирования водного раствора фермента

72 6 хлорангидридом ненасыщенной кислоты при рН 7,5-9,00 и молярном соотношении фермент:хлорангидрид, равном

1:10-200, и последующей радикальной сополимеризации ацилированного фермента с гидрофильным мономером и бифункциональным сомономером-сшивателем,отличающийся тем, что, с целью повышения устойчивости иммобилизованного фермента к действию фосфорорганических соединений при сохранении общей ферментативной активности, сополимеризацию ацилированного фермента проводят в присутствии

1-47. от массы реакционной смеси линейного водорастворимого сополимера общей формулы

)634672

ССС

« о л сч л

\«\ Ф « С«Ъ

« л иС о

СЧ сп

ЬК ооо о cоо

In

СО

« о

ЮЪ

«.Ф С Ъ»

С 1 сп е

СЧ 4.1

М

СО

С Ъ

СЧ

С 1

С ос о о

СЧ

СО О

С 1 л Д О

c c о о о

СЧ сЧ О

О С СЧ сто лс

«

СО О\ Л CO о

СО

« л

СЧ

« о\ о

D о о оооо оооо о о л л

«

- сч О О

С о

СС

« о

an сч о — о

1хЯ к

133 ъ 4

- о а

О Л СО О сч л со

СЧ Q C«C

vvv м 0 .х

СО СО

СЧ " СЧ

Т

11 «о

- л

ФЗ

СО

Ch

С«С С С

«РС Р

СЧ Н О щ, ° «5®I

CCpl аа0 3

С $5

1 11 у, I -М о

33y3о

Зхок

Ь Ъ4 С 4

5i х2

Ф овхке

Г х

:fg,,6 ю е к ° о

9о х о ь х х е аcc

Н Ы С° «ц х х хо ф

leO в

О С, Х х х х

CC ц

3 оniccK f

КССOW4 м ь о ц а сс ° 4

oeZg

4 УУ g В к ам . Я р е и ака 3