Способ получения сукралозы

 

Изобретение относится к биотехнологии . Цель изобретения - упрощение процесса за счет минимизации образования побочных продуктов. Хлорзамещенный сахар 0-й(Ч)-6-хлор-6-дезоксигалактопиранозил- (1 -. 6} -oЈ-D-i -хлор- 4-дезоксигалактопираиозил-(1 2) D-1,6-дихлор-1,6-дидезоксифруктофуранозид (ТХР) используют для получения сукралозы в результате инкубирования ТХР в растворе в присутствии oL-ra- лактозидазы, служащей для удаления 6-хлор-6-дезоксигалактозильного остатка из положения 6, в частности энзима , получаемого из Mortierella vi- nacea, Circtnella muscae. ТХР получают в результате обработки рафиноэы хлористым тионилом в присутствии окиси трифенилфосфина. Раствор представляет собой водную систему или несмешиваемый с водой гидрофобный растворитель . 1 з.п. ф-лы, 2 табл. Ј (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„,80„„1635905

«»

М 4, (1ДЯ ,1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К IlATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4028456/13 (22) 20. 10.86 (31) 8525871 (32) 21. 10. 85 (33) ГВ (46) 15.03.91 ° Бюл. 44- 10 (71) Тейт энд Лайл Паблик Лимитед (GB) (72) Элнер Брин Ратбоун, Кхизар Султан Мафти, Риаз Ахмед Кхан, Петер Самюэл Джеймс Читхэм, Эндрю Джон Хэкинг и Джонатан Сег Дордик (GB) (53) 547.813 (088.8) (56) Патент Великобритании Р 2079749, кл. С 07 Н 3/04, опублик. 1982. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУКРАЛОЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии. Цель изобретения — упрощение процесса эа счет минимизации образоИзобретение относится к биотехнологии, представляет собой получение сахаристого продукта с высоким,подслащивавшим действием — сукралозы

4,4,1 -6 -трихлор-4-1,6 -тридеоксигалактогахароза, известная под обозначением ТГС (ТОК)), которая примерно в 600 раз слаще сахарозы.

Цель изобретения — упрощение процесса путем минимизации образования побочных продуктов, Способ заключается в инкубировании хлорированного производного сахарозы ТХР (раствор 0-ф(-D-6-хлор-6-дезоксигалактопиранозил-(1-6)-К-D-4хлор-4-дезоксилактопиранозил-(1-2)г

Р -D-1, 6-дихл ор-1, 6-дид е з ок сифрук тофуранозида) в присутствии фермента, (1) С 12 Р 19/20, С 07 Н 3/04//А 23 G 3/00

2 вания побочных продуктов. Хлорзамеценный сахар 0-Я;П-6-хлор-6-дезоксигалактопираноэил-(1 — ъ-6)-в -D-- . õëîð4-дезоксигалактопирапоэил-(1 2)-PD-1,6-дихлор-1,6-дидеэоксифруктофуранозид (TXP) используют для получения сукралозы в результате инкубирования

ТХР в растворе в присутствии 44(-галактоэидаэы, служащей для удаления

6-хлор-6-дезоксигалактозильного остатка из положения 6, в частности энзима, получаемого из Mortierella vinacea, Circinella muscae. ТХР получают в результате обработки рафиноэы хлористым тионилом в присутствии окиси трифенилфосфина. Раствор представляет собой водную систему или несмешиваемый с водой гидрофобный растворитель. 1 э.п. ф-лы, 2 табл. служащего для удаления 6-хлор-дезок сигалактоэильного остатка из положения 6.

Особый интерес представляют галактозидазы. Мелибиозы представляют гораздо меньший интерес вследствие того, что хотя мелибиоза (О-1-D-галактопиранозил-(1 — ъ 6)-44(-D-глюкопираноза) представляет собой компонент рафинозы, но хлорированная ТХР имеет обращенную конфигурацию. Найдено, что многие иэ указанных энзимов не обладают. какой-либо полезной активностью в отношении ТХР даже в тех случаях, когда они способны высвобождать сахарозу из рафиноэы. Исследовано около

20 энзимов ряда k-галактозидаз, полученных из бактериальных, грибковых, 1635905 и растительных источников, однако только 8 из них обладали активностью в отношении гидролиза ТХР, причем все они происходили из грибковых источников. Активными энзимами были полученные из штаммов Иог iеге11а vinacea, Circinella muscae. Наиболее активным является >Iortierella vinacea,ðàçíîвидно сти raf i ino s cut il ize r (АТСС

1 20034), поставляемой фирмой "Хоккайдо Шугар Компани". Скорость реакции с участием ТХР в этом случае составляет лишь несколько процентов от скорости реакции с участием самой рафинозы. Однако, принимая во внимание значительные конформационные и конфигурационные различия между рафинозой и ТХР, даже эта скорость (или активность) является неожиданной и приводит к практически полному гидролизу ТХР в сукралозу.

Гранулированные клетки М.viracea разновидности raffinoseutilizer используются при производстве свекловичного сахара с 1968 г.

Энзиматическую обработку удобно осуществлять в водном растворе. Однако, хотя для осуществления реакции требуется присутствие воды, обнаружено, что, -галактозидаза может интенсивно гидролизовать ТХР в сукралозу и в ряде органических растворителей.

Установлено, что энзим является наиболее стабильным и активным в несмешивающихся с водой органических растворителях, тогда как TXP хорошо растворяется только в гидрофильных растворителях, Таким образом, наиболее подходящими растворителями для гидролиза ТХР являются гидрофильные несме1 шивающиеся с водой органические растворители, например этилацетат, н-бутанол и метилизобутилкетон. Так, например, скорость гидролиза ТХР, определенная по числу обращения катализатора (К щ -, ) в этилацетате, предварительно насыщенном водным буфером (который дает достаточное количество воды для гидролиза), аналогична скорости гидролиза в водном буфере.

Предполагается что энзим сохраняет полную каталитическую активность и в том случае, когда он суспендирован в органическом растворителе. Каждый из укаэанных органических растворителей, будучи предварительно насыщенным водным буфером, остается в виде единой органической фазы. Энзим функциониру10

55 ет в органической фазе ° Гидрофильные несмешивающиеся с водой растворители (например этилацетат, н-бутанол и метилизобутилкетон) оказались способными поддерживать высокую каталитическую активность и высокую растворимость ТХР.

В табл. 1, п1;иведены данные раст воримости при 55 С ТХР и сукралоэы в ( различных растворителях (все они предварительно насыщались водным буфером) по сравнению с водным буфером.

Совершенно ясно, что растворимость

TXP становится максимальной в случае использования гидрофильных несмешивающихся с водой растворителей.

К числу прочих преимуществ проведения процесса гидролиза в органической среде относится также увеличение термической стабильности (стабильность <-галактозидазы при 55 С в

0 этилацетате примерно на 50ã. выше, чем в водном растворе) и растворимости субстрата (растворимость ТХР в указанных выше растворителях составляет свыше 50Х (мас/объем), тогда как в водном буфере растворимость ТХР составляет только 15Х (мас/объем)) .

В случае использования как водных, так и органических систем обработку следует проводить при оптимальных значениях температуры и рН для данного энзима, которые в случае использования О(-галактозидазы М.vinacea составляют примерно 55 С и pH = 4,5-5,5.

В органических растворителях, насыщенных водным буфером, эти значения рН относятся к рН водного буфера. При указачной температуре и рН = 5,0 обнаружено, что получаемая сукралоза не подвергается распаду.

Энзим можно растворить или диспергировать в водной системе в виде экстракта, не содержащего клеток, получаемого, например, в результате обработки гранул ультразвуком, или же можно использовать его в иммобилизованном виде, например в виде гранул, помещенных в колонны или расположенных слоями. В органических системах энзим остается в нерастворимой форме и может быть повторно использован в слоях или колоннах.

Отделение получаемой в качестве продукта сукралозы осуществляют любым известным способом, например путем испарения и экстракции в органи5 16359 ,чес ком ра ств орителе, применения хроматографических методов, селективной кристаллизации из водных или неводных систем.

Пример 1. Получение сукралозы в водном растворе (в микроколичествах) .

Тетрахлоргалакторафинозу в количестве 20 мг помещают в завинчивающий10 ся сверху сосуд, содержащий 2 мл

0,1 М цитрат-фосфатного буфера (рН

= 5,0). Получают раствор концентрацией 1 X (мас/объем) . Указанное количество воды поддерживается постоянным

15 в процессе последующего инкубирования путем добавления необходимого ее количества тогда, когда это потребуется.

К смеси добавляют 10 мг О(-галак- 20 тозидазы в форме гранулированных клеток Nortierella vinacea разновидности

raff inoseutilizer АТСС Р 20034 (поставляется фирмой "Хоккайдо Шугар

Компани, Япония), и инкубируют полу- 25 ченную смесь в течение 100 ч при 55 С.

Периодическое наблюдение за степенью

1 гидролиза осуществляют, используя метод тонкослойной хроматографии, для чего из реакционной смеси отбирают аликвоты по 250 мкл, которые элюируют смесью этилацетат. этанол:вода (45:5:

:1), или метод жидкостной хроматографии под высоким давлением на колонке

"Уотерс Декстропак С 18" с обратной фазой, применяя для элюирования 20".— ный ацетонитрил (объем/объем). Содержание продуктов измеряют с помощью детектора, основанного на определении показателя преломления. Полученные результаты приведены на фиг.1. Так, было найдено, что примерно 537 продукта прогидролизовано спустя 48 ч и примерно 707 — спустя 90 ч. Продукты разде:яют хроматографическим способом, причем помимо сукралозы обнаружены б-хлоргалактоза и ТХР. В этой системе

ТХР можно использовать в количестве до 157 (мас/объем). В водном растворе данный энзим имеет константу Михаэлиса (K ) равную 5,8 мм, и константу

K q, равную 52,5 мг на г энзима в час.

05 6 и заполняют смесью колонку размерами

11"0,9 см с объемом слоя 7 см, обо. рудованную водяной рубашкой, В указанной колонке поддерживают температуру, равную 55 С, с помощью циркуляционного водяного насоса. При использовании указанной колонки для гидро-. лиза TXP в сукралозу было найдено, что время полупревращения (до 50Х конверсии) составляет 13 суток °

Пример 3. Микроорганизмы, пригодные для осуществления гидролиза

ТХР в сукралозу.

Микроорганизмы, обладающие активностью в качестве о(-галактозидаз, получены из коллекции культур АТСС.

Их выращивали в колбах емкостью

100 мл, содержащих среду на основе минеральных солей 1 г/л экстракта дрожжей и 5 г/л рафинозы, встряхивая при температуре 30 С.

Клетки отбирают посредством центрифугирования (5000 об/мин при центрифугировании в течение 10 мин) в поздней экспоненциальной стадии роста, повторно суспендируют в пятикратном количестве от объема цитрат-фосфатного буфера при рН = 5,0 и выдерживают при 0 С на бане со льдом, после чего разрушают посредством 3 прогонов по 20 с в ультразвуковом устройстве (" Дэйв Сонипросб", тип 1130А) при MBKcHMBJI QH мощности. Полученную при этом суспензию центрифугируют при 17000 об/мин в течение 30 мин и исследуют на наличие активности в качестве -галактозидазы (как осадок, так и верхний слой), определяя указанную активность в единицах на 1 г сухой массы клеточного остатка и применяя для этой цели и-нитрофенил-фD-галактопиранозид (фирмы Сигма").

В поверхностном слое не обнаружено практически никакой энэиматической

1 активности. Для культур, которые дают положительные результаты при испытании на гидролиз TXP согласно способу, описанному в примере 1, получаемые результаты (см. табл. 2) приводятся в мг сукралозы, полученной на 1 r сухой массы клеточного остатка в час (для 70 -ной конверсии).

Пример 2. Гранулы Nortierella vinacea разновидности raffinoseutilizer (АТСС N - 20034) в количестве

3 г гидратируют в 0,1 М растворе цитрат-фосфатного буфера (рН = 5,0), содержащего 57 (мас/объем) рафинозы, Пример 4. Получение сукралозы в органической среде.

ТХР в количестве 23 мг помещают в пробирку 5 мл с завинчивающейся пробкой и добавляют 2 мл органического

1635905

Пример 5.

Концентрация ТХР а начале реакции, I 1О

5 2,5

1 0,S

Концентрация аиаима, I

2>5 1 2S 0 5 0 25

I наличной сукралоти череа, ч:

О 3 О 2 О 08

0>6 0,4 1, 17

О,OS 0,025

0>11 0 065

0,22 0,135

0,38 0,22

0,33

1,2 0,75 0,33

1,55 0,85 0,58

0,88

Пример 6.

Концентрация TIP в >1ачале реакции, 2

1О 10 5 5

5 0,5 2,5 0,5

Концентрация аианма, Х

I наличной сукралоам чеpcs, ч:

0>29 0 1

0>О8

0,2

018 065 012

1,4

2,4

0,4

1>55 0>37

2>7

2 15

0,54

0,8

0>50

0,74 растворителя, предварительно насыщенного водным буфером (ацетат натрия

50 мИ, pH = 5,0), получая в результате. 20 ьИ (1, 15Х мас/объем) раствор.

В каждую из пробирок добавляют по

100 мг .-галактозидаэы в форме гранулированньм клеток M.vinacea разновидности raffinoseutil izer АТСС

8 20034, после чего инициируют проте- 10 кание реакции путем введения 17 (объем/объем) водного буфера, интенсивного перемешивания в течение 30 с и помещения пробирки в водяную баню

> со встряхиванием при 55 С и 100 об/мин.l15

Периодически из реакционной смеси от- бирают пробы по 25 мкл, которые вводят в систему хроматографического анализа при высоком давлении (система с использованием обратной фазы, колонка "Уотерс Декстропак С 18"), используя для элюирования 207-ный водный раствор ацетонитрила и измеряя количество полученной сукралозы и остаточной ТХР. Эффект наличия органы- 25 ческого растворителя при получении сукралозы в течение 24-часового инкубирования приведен на фиг.2. Зависимость степени гидролиза TXP в сукралозу от времени приведена в виде кривой 1 для водного буфера и для трех растворителей: метилизобутилкетона (кривая 2), этилаце тата (кривая 3) и н-бутанола (кривая 4) . Протекание реакции гидролиза в метилизобутилкетоне и водном буфере одинаково, в случае использования этилацетата и н-бутанола зафиксированы более низкие скорости протекания реакции и конверсии. Во всех случаях наблюдается свыше чем 507-ная конверсия за промежуток времени, равный 24 ч,прн конверсии за тот же промежуток времени,равной 70Х для водного буфера и метил-иэобутилкетона., В отдельном опыте определяли в кинетические параметры энэима по Михаэлису-Иентену как для водного буфера, так и для этилацетата, Ки1 и Карау в этилацетате равны соответственно

16,4 рИ TXP и 56,3 мг сукралозы/г»

7гранул/ч. Причиной того, что временной график для процесса гидролиза ТХР в этилацетате находится ниже, чем соответствующий график в водном буфере (при 20 рИ ТХР), является более высокое значение К14 TXP в этилацетате, а не меньшая каталитическая активность °

При использовании 50 мИ ТХР скорость и степень конверсии при гидролизе ТХР в этилацетате аналогичны соответствующим величинам в водном буфере.

1635905

25

Таблица

Растворитель

ТХР

С украло э а

15

Вода н-Бутанол

Свыше 50

Свыше 50

Метилиэобутил"ч кетон

Свыше 50

Свыше 50

5,7

Этилацетат н-Октанол

Нитробензол

Менее 1

Менее 1

Менее 2

Т а блица 2

Absidia grisiola

35,5

20430 (0,2

18,6

20431

43,7

22618

20,8

Aspergilla awamori

44733

Пример 7. Гранулы Mortierel—

la vinacea var raff inoseutil izer

АТСС 20034 в количестве 12,5 г гидратируют в растворе 0,1 М цитрат-фосфатного буфера, рН 5,0, содержащего рафинозу 2,5% на объем, и заполняют ими колонку 5,7 см с объемом насадки (есч) 27 мл, поддерживая температуру

55 С с помощью водяной рубашки, снабженной циркуляционным насосом. Через колонку пропускают 2,5%-ный на объем водный раствор TXP с начальной скоростью потока 0,11 ecv/÷, которую снижают до 0,09 ecv/÷ через 13 дней и до 0,038 ecv/÷ через 26 дней, что дает около 19 н сукралоэы через 28 дней (65%-ная конверсия). Половинный распад энзима достигается в период между 25 и 30-м днями. формула изобретения

1. Способ получения сукралозы, предусматривающий хлорирование производного сахарозы, замещенного в положении 6, с введением атомов хлора в положение 4, 1 и 61 сахарозы и последующее удаление 6-заместителя, отличающийся тем,что,с целью упрощения процесса эа счет минимизации образования побочных продуктов, в качестве 6-замещенного производного сахароэы используют рафинозу, а удаление 6-заместителя осуществляют путем ферментативного гидролиза 1-15%-ного раствора О-b(-D-6-; хлор-6-дезоксигалактопиранозил-(1-6)М-D-4-хлор-4-дезоксилактопиранозил(1-2)-QD-1,6-дихлор-1,6-дидеоксифруктофуранозида в водной системе или в гидрофобном растворителе с испольI зованием K-галактозидазы из Mortierella vinacea или Circinella muscae, проявляющей степень гидролиза от 1,6 до. 4 3 мг сукралозы на 1 r сухого клеточного остатка в 1 ч при 30

60ОС до достижения 50-70%-ной конверсии.

2. Способ по п.1, о тличаю— шийся тем, что растворитель представляет собой метилизобутилкетон, этилацетат или н-бутанол °

1635905

36220

20,1

0,49

16008

75,4

1,12

20394

28,9

Z0,2

22337

11,3

Mortierella vinacea

20034

18,2

1,09

34195

8,9

1,33

42425

10,6

1,06

42367

1,6

16461 (f,0

21,3

Хоккайдо гранулы

4,3

0 5 Ю б Ю 25 а 11 и и И Ю фЕЫЕ ИЕУЬРайН11<

Рик1 феи иЮУ%1 аланию

Фиг.2

Составитель И.Привалова

Редактор А.Маковская Техред М.Дидык Корректор М,Самборская

Заказ 763 Тираж 361 Подпис ное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Проиэводственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

Aspergilla nig

Circinella muscae

Sac cha romyces ъ1аплп

al a romyc e s the rmoph i l u s

Mortierella vinacea

Продолжение табл. 2

3 4