Способ определения @ -амилазы поджелудочной железы

 

Изобретение относится к иммунологической диагностике Ы.-амилазы поджелудочной железы наряду, с определенным «(-амилазы слюны. Цель - повышение точности определения 0(-амилазы поджелудочной железы. Для этого к исследуемому материалу добавляют моноклональные антитела штаммов САСС № 84122003 или САСС № 8412204 в концентрации 5-20 мкг/мл с активностью связывания flt-амилазы слюны более 97%. Далее добавляют дополнительно вторые моноклональные антитела против с -амилазы слюны штаммов САСС № 84111301 или № 84111302 в равном объеме и концентрации 1 - 5 мкг/мл с активностью связывания фермента более 10%. Смесь инкубируют 0,5 - 10 мин при 20 - и рН 7,1. Точность определения возрастает до 100,2%, по прототипу 90%. 2 табл. i (Л

СОО3 СООЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

КСПУ ЛИН

SU„„163 (gg)g G О1 N 33/577

g q/- + / i Ùÿ 1 (.. Я Е; с;. р

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К AATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET

flo иэОбРетениям и (лнРытиям

Я И ГННТ СССР (21) 4027915/14 (22) 18.07.86 (31) P 3525926.4 (32} 19.07.85 (33) DE (46) 23.03.91. Бюп. Ф 11 (71) Берингер Мзннхайм ГмбХ (DE) (72) Хельмут Ленц, Иартин Гербер (DE) и Винфрид Альберт (АТ) (53) 615, 475 (088. Я) (56) Заявка ФРГ Ф 13500526.2, KJI С 01 N 33/53 ° 1985 ° (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ < (.-АИИЛАЗЫ

ПОДЖЕЛУДОЧНО11 ЖЕЛЕЗЫ (57) Изобретение относится к иммунологической диагностике th(-амилаэы поджелудочной железы наряду. с определенИзобретение касается способа определения О(-амилазы поджелудочной железы наряду с 0(-амилазой слюны для диагностических целей.

Целью.изобретения является повышение точности определения 0(-амилаэы поджелудочной железы.

Способ осуществляют следующим образом.

Ингибируемая эффективность моноклонального антитела, которое не полностью удовлетворительно подавляет фермент слюны, синергически усиливается с помощью лишь связующего, но практически не подавляющего или не полностью подавляющего моноклонального антитела, и количественное подавление фермента слюны может быть дос2 ным bL-амилазы слюны. Цель — повышение точности определения 0(-амнлаэы поджелудочной железы. Для этого к иссл ед уе мому ма т ери а л у д оба вл я ют мо ноклональные антитела штаммов САСС

Ф 84122003 или CACC h" 8412204 в концентрации 5 — 20 мкг/мл с активностью связывания К-амилазы слюны более 97Х

Далее добавляют дополнительно вторые моноклональные антитела против (-ами" лазы слюны штаммов САСС Ф 84 111301 или В 84 111302 в равном объеме и концентрации 1 — 5 мкг/мл с активностью связывания фермента более 10Z. Смесь инкубируют 0,5 — 10 мин при 20 — 37 С и рН 7,1. Точность определения возрастает до 100,2%, по прототипу 90Х.

2 табл ° тигнуто при получении 1ООХ-ной активности фермента поджелудочной железы. Таким образом удается существенно сократить время инкубации.

Для предлагаемого способа в качестве первого моноклонального антитела используют предпочтительно полу- . ченные из зарегистрированных в NCACC под номерами (99D12) 84122003 и (89Е2) 84122004 (Национальная коллекция животных клеточных культур, Нортон Даун, Великобритания) клеточных культур антитела. В качестве второго моноклонального антитела предпочтительно используются опубликованные в европейской заявке В S4114 172.4 связующие антитела, пар<-.гистрированные в NCACC под номерами 84 111301 и. 1637670

84111302 клеточных культур (предпочтительно NCACC h 84111301).

Необходимое всякий раэ количество первого и второго антитела для Определенных препаратов антител можно легко определить с помощью небольшого количества предварительных опытов.

Предпочтительно используют по меньшей мере 5 мкг/ип, бопее предпочтительно по меньшей мере 20 мкг/мп первого моноклонального антитела и по меньшей мере 1 мкг/мл, более предпочтительно по меньшей мере 5 мкг/мл второго моноклонального антитела. 15

Применяемые моноклональные антитела могут быть получены путем иммунизации подопытных животных с помощью естественной или модифицированной

К-амилазы слюны, слия ния В-лимфоцитон gp полученных таким образом иммунизированных животных с трансформируемыми реактивами, клонирования и культивирования образованных таким Образом гибридных клеток, которые производят 25 моноклональные антитела, и путем изолирования последних. Пригодными животными для производства антител

0(-амилазы слюны являются крысы и мыши.

itOt»

Иммунизация oróùåñòâëÿåòñÿ или г. помощью естественной чедонечегкои

»к-амилазы слюны или с помощью модифицированной амилазы слюны. Если используют естественный фермент, го для этого пригодны стандартные, электро- 35 форетические гомогенныс 11реtl lpаты.

Химически модифициров:IH}IHfl t»l-ëìèJ}àç t

cëþHü может быть также 11оti jp <1«Hа н г О

oTBeTr Tâèè с известными и< т< дами модификации ферм< тон (

I J. Biul, Chem. 238 (1963) 3307),;1 гак}ке диа 1OTHpo Bo fit»

Fnzymul. (25 /1972) 11 .— t ) . Г!!111 этом наиболее подхо }яш»й и 111

НИИ ПОЛЕHHIX (Jlf. 1П IX),, «И I II 11 <

Te

Иммунизация осуществляется путеМ обычного введения естественного или модифициронанного фермента в комбинации со стимулятором. В качестве стимулятора используется гидроокись алюминия в сочетании с бактерией (возбудителем коклюша Борде — Жангу) . Если для иммунизации ис пользуется естественная k-амил 13а слюны в домовых мышах или TNM-модифицированная К-амилаза в полевых (лесных) мьннах, то иммунизация ос уществля ется преимущественно в течение 9 мес, с помощью по меньшей мере семи иммунизаций (и}гъекций I.P.).

После проведенной иммунизации происходящие из костного мозга лимфоциты иммунизированных животных соединяются обычными методами с трансформирующими агентами, например клетки миеломы, трансформирующие вирусы, например вирус Э}}штейна-Барра или Описанные в вьц»оженнс)й заявке ФРГ

3245665 агенты. Соединение Осуществляется в соответствии г известными спо<.обами Келера и 11ильште»»на (NHtu} e 256 (1975) 495-497) . Образованные при этом гибридные клетки клонир уютс я Обыч ным образ Ом, на11ри мер с применением стандартной клеточной породы, и полученные клоны, которые образуют желаемые моноклональные антнтела, выращиваются. ПО причине напоминающего рак роста гибридных клеToK последние можно продолжать культивировать в течение неопределенного времени и производить желаемое моноклональное антитело в любом количестве.

Д<}н 1<редлагаемого способа о1»ределенин могут 11рименятьгя Описанные моноклональнь»е антитела или имеющие их гоотнетс тв) ющие иммунологичес кие с войг Tâ}I фрагменты (фаб-фрагменты) . Поэтому 1<од понятием моноклональные антитела" н данном случае понимаются и фрагменты, Как комплексное антитело, так и его фрагменты, могут ис1»ольэоватьс я в иммобилизированной форме.

01»редел ение !}<-амила эы ос ущегтвляетгя в соответствии с иэвестнымн для этих целей методами. Так как комбинация моноклональных антител гелекп» вно подан.<н T b(-à мин а эу r JIK)f»}»

oIIptJJteJlH.гь актинность фермента, не

1<ричинян ущерба ферменту додж< лудоч7670

15

5 163 ной железы, полученные прн определении 0(-амилаэы в присутствии моноклонального антитела величины соответстI вуют подобающей только ферменту под( желудочной железы активности.

Предлагаемый способ реализуется предпочтительно с помощью системы для обнаружения 0(-амилазы, которая содержит мальтополиозу с 4-7 остатками глюкозы в молекуле, мальтофосфорилаэу, fb-фосфоглюкомутаэу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу и дифосфопиридиннуклеотид, Другая предпочтительная система обнаружения b(-амилазы состоит из модифицированного с помощью определяемых групп крахмала. Понятие "модифицированный крахмал" охватывает, например, крахмал, который модифицирован с помощью определяемых групп, например, стандартный продукт под названием "Phadebas" фирмы "Фармациа" (Швеция), или описанный в выложенной заявке ФРГ 11(2812154 продукт, или изменившийся в процессе распада крахмал, например карбоксиметилкрахмал и предельные декстраны (все эти системы известны).

Для реализации предлагаемого способа исследуемая жидкость или вначале инкубируется с помощью использованных в способе антител и затем используется непосредственно в обычном испытании амилазы, или добавляется в смесь антител с реактивом обнаружения амилазы и затем после инкубации начинается определение путем добавки субстрата, Продолжительность периода инкубации зависит от активности использованных антител и составляет от 0 5 до 10 мин, в частности примерно 5 мин, Поскольку отделение М-амилазы слюны оказывается желательной, то одно иэ моноклональных антител, как в комплексной форме, так и в ф-рме фрагментов, может существовать эафикси рованным на твердом носителе, например на иммуносорбционной бумаге или на поверхности трубочек из синтетического материала или гибких трубочек, Таким образом (-амилаза слюнного типа привязывается к носителю (т.е. твердая фаза) °

Моноклональные антитела, которые удельно подавляют человеческую b(-амилазу слюны максимум до 93Х, очищаются путем осаждения (NHy)< БОч и с помощью DEAE-хроматографии в соответствии с обычными методами, Также очищается моноклональное антитело, которое удельно связывает человеческую

-амилаэу слюны. Моноклональное антитело или моноклональные антитела смешиваются в растворе с человеческой амилазой и эта смесь инкубируется в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем эта смесь добавляется к реактиву амилаэы H измеряется активность амилаэы. В качестве контроля служит амилаза, которая смешана с буфером .без моноклонального антитела. Альтернативное моноклональное антитело или моноклональные антитела добавляются в часть реактива амилаэы, раствор глюкозидазы, Затем добавляется раствор амилазы и смесь инкубиру- ется в течение 5 мнн. Начинается реф акция с субстратом — GgPNP (P — нитрофенилмальтогептаоэид), В качестве контроля служит раствор глюкозидаэы без моноклонального антитела, В табл.l представлены результаты метода сывороточного начала, (смешаны моноклонапьное антитело и амилаза): подавление человеческой (-амилазы слюе ны и поджелудочной железы с помощью подавляющих моноклональных антител

NCACC 84 122003 (MAK I) или 84 122004, (MAK II) и/или связующего моноклонального антитела NCACC 84 111301 (МАК

Ш) (в качестве субстрата GyPNP, GA — общая активность, А — активность с моноклональнымн антителами, RA — остаточная активность).. Из табл. l видно, что комбинация подавляющего удельного моноклонального антитела, а также удельно свя- ° зующего человеческую 0(-амилаэу моноклонального антитела воздействует на синергическое увеличение подавления.

Этот эффект не зависит от субстрата.

Это обнаруживается как при высокомолекулярном субстрате (окрашенный крахмал), так и при субстратах с короткой цепью, например СрРИР (Р нитрофенилмальтопентаоэид). Эффект наблюдается также при субстрате G PNP.

Слюнная амилаза также подавляется в человеческом организме синергически с помощью двух моноклональных антител.

Реактив для удельного определения

Ы-амилазы поджелудочной железы наряду с ((-амилазой слюны в жидкостях

1637670 организма, в частности в сыворотке, соке двенадцатиперстной кишки, плазме или моче, содержит систему для обнаружения К-амилаэы и моноклональ5 ное антитело против 0(;-амилазы слюны, которая отличается тем, что содержит первое моноклональное антитело, которое подавляет фермент слюны менее чем до 97Х, и используется в комби- 10 нации с вторым моноклональным антителом против М-амилазы слюны, кото.рое подавляет этот фермент менее чем до 10%. Итак, в предлагаемом реактиве содержится система для обнаружения

Ы-амилазы.

Изобретение способствует просто- му, быстрому и точному определению

К-амилазы поджелудочной железы (h-PA) наряду с Ot-амилазой слюнного типа 20 (h-SA) в жидкостях организма и су. щественно улучшает тем самым возмож» ности клинической диагностики.

Пример 1. Подавление человеческой К-амилазы поджелудочной железы и слюны с помощью первого МАК (NCAOC 84122004) и в комбинации со вторым МАК (NCAAC 84 111301)„ метод сывороточного начала.

Реактив (буфер) 100 млмоль РО 30 и 150 млмоль NaC1, 6%:: сывороточного .альбумина крупного рогатого скота, .рН 7,1.

Реактив амилазы: GyPNP (Берингер, Мангейм, номер заказа по каталогу

568569, 37 С).

МАК 1: 0,63 мг/мл первого МАК в буфере.

МАК 2: 0,63 мг/мл первого МАК и 0,105 мг/мл второго МАК в буфере. 40

МАК 3: 0 105 мг/мл второго MAK в буфере.

При этом, h-SA — 3000 мочевины/л (G PNP) в буфере, h-PA — 3000 мочевины!л (G PNP) в буфере. . 45

100 мкл че...веческой ю&амилазы слюны или поджелудочной железы смешивают со 100 мкл буфера или различных растворов моноклональных антител и в течение 5 мин инкубируют при ком- 50 натной температуре. Затем 25 мкл этих смесей добавляют к 1000 мкл поддерживаемого при постоянной температуре

37 С реактива амилазы и в соответствии с инструкцией определяют активность амилазы, Остаточную активность рассчитывают по формуле.RA %.

Активность с МАКр

Активность беэ МАК

Соответствующие остаточные активности человеческой Ы-амилазы слюны составляют с первым MAK 8,6Х, со вто" рым MAK 96,9%.и с обоими МАК 2,7Х, остаточные активности человеческой

К-амилазы поджелудочной железы соответственно составляют 100,1, 99,6 и 99,7Х.

Пример 2. Подавление амилаэы с помощью первого МАК (NCACC

84 122003) и/или второго МАК (NCACC

84 111301); вариант сывороточного начала, Реактивы аналогичны используемым в примере 1, только изменены MAK 1 и МАК 2, МАК 1 : 0,525 мг/мл первого МАК в буфере, MAK 2 : 0,525 мг/мл первого МАК и 0,105 мг/мл второго МАК в буфере, Опыт проводят аналогично примеру 1.

Остаточные. активности человеческой -амилазы слюны составляет с первым

MAK 9,1%, со вторым MAK 96,9Х и с обоими МАК 2,5%, остаточные активности человеческой М-амилазы поджелудочной железы соответственно составляют

99,9, 99,6 и 99,7Х.

П р и м .е р 3. Подавление человеческой К-амилазы слюны и поджелудочной железы с помощью первого МАК (КСАСС 84 122004) со вторым МАК или без него (NCACC 84 111301), метод субстратного начала.

Реактивы: буФер, человеческая 0(амилаэа слюны (h- SA) и человеческая

0(-амилаза поджелудочной железы (Ь-РА) как в примере 1.

МАК 1 : первое МАК в буфере, pasя. личные концентрации.

MAK 2": второе МАК в буфере

0 513 мг/мл.

При этом, 1(-глюкозидаэа из реактива амилазы (Нерингер, Мангейм, номер заказа по каталогу 568569), субстрат

СуРБР иэ реактива амилазы.

К 880 мкл щ-глюкоэидаэы добавляют

Й

100 мкл раствора МАК 1, а также

10 мкл раствора МАК 2" или 10 мкл буфера. К этой смеси подмешивают

25 мкл человеческой 4-амилазы слюны или поджелудочной железы. Эту смесь в течение 5 мин инкубируют при 37 С.

Затем путем добавки 100 мкл раствора субстрата происходит начало и осуществляется в соответствии с инструкцией определение активности амилаэы.

16376 70

Таблнца!

НАК. И/И1 (2 5/ 5 мхг /мл) МАК 1/II (30/5 мхг/мл) A ед/л

МАК 11 (25 мкг/мл) МАК 111 (5 мкг/мл) г

МАК 1 (30 мк г/мл) Амин а эа

А, ел/л RA, I Л, ед/л НА, X

А, ец/л RA, Х

1476 127 8,6 135 9, l 1430 96,9 40 2,7 37 2,5

Саина

Полхелулочнаа хелеэа

1430 1442 100,8 1428 99,9 1424

99,6 140$ 98, 2 1426

99,7

Та бли ца 2

l !

Показатели МАК 1 / MAK I МАК I II МАК III NAK 1/1II МАК I/III !

МАК вЂ” кон центрация в опыте, мг/л

20/ 5

S/1

Остаточная активность 7

Амилаза, ед/л

2,4

2,6

96,9

9,2 96,3

9,3 слюны полжел удочной

99,6

98,1

100,2 99,6 99,4

99,6 железы

Составитель Г. Крюкова

Редактор И..Дербак Техред Л.Олкйньпс КоРРектоР С.Черни. аказ 828 Тираж 411 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

В качег тне контроля служит смесь Кглюкозидазы с 20 мкл буфера, а также

r оответствующей амилазы. Активность с моно клонал ьными а нтит елами, поделенная на активность без моноклональных антител, дает остаточную активнос гь (в процентах).

Результаты опытов для различных концентраций сведены в табл.2. 10

Данные табл. 2 свидетельствуют о том, что используемые концентрации аHTHTел позволяют с Bblcокой точностью определять 0(.-амилазу поджелудочной 15 железы (по известному rпособу лишь

907).

Ф и р и у л а и з и б р е т е н и я

Способ определения d-амилазы поджелудочной железы в биологических 0 жидкостях, включающий добавление моноклональных антит.ел против 3/-амила зы слюны к исследуемому материалу с последующей регистрацией (1(-амилазы поджелудочной железы, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве мсноклональных антител используют антитела штаммов САСС 11 84122003 или

САСС 1(84122004 в концентрации 5

20 мкг/мл с активностью связывания е(-амилаэы слюны более 97Х, далее дополнительно добавляют вторые моноклональные антитела против е(-амилаэы слюны штаммов САСС 11/ 84111301 или

)1 84 111302 в равном объеме и концентрации 1 — 5 мкг/мл с активностью связывания фермента более 10Х смесь инкубируют в течение 0 ° 5 - 10 мин.