Векторная плазмидная днк ртк 1261, предназначенная для интеграции чужеродного фрагмента в геном вируса осповакцины, и способ ее конструирования

 

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой рекомбинантную плазмиду, обеспечивающую интеграцию чужеродного генетического материала в геном вируса осповакцины (ВОВ) штамма ЛИВП. Целью изобретения является расширение выбора стратегии клонирования чужеродного генетического материала в составе ТК-гена вируса осповакцины штамма ЛИВП. Новая плазмидная ДНК рТК 1261 состоит из фрагментов генома ВОВ штамма ЛИВП, расположенных на расстоянии 142-736 н.п. и 769- 1379 н.п. от HindIII-сайта рестршсции К-фрагмента генома ВОВ, слитого полилинкера плазмид 1285 и pUC 18 длиной 56 н.п., содержащего уникальные сайты рестрикции Clal, HindIII, SphI, PstI, Sal GI, Xbal, Barn HI, Smal, Kpnl, SacI, Eco RI и векторной части в виде Clal-PvuII фрагмента ДНК плазмиды pBR 322 Д . Предложенная векторная конструкция позволяет расширить стратегию клонирования чужеродного генетического материала в составе ТК-гена ВОВ штамма ЛИВП. Полученная генно-инженерная субстанция характеризуется на способность интегрировать в геном ВОВ чужеродный генетический материал, например ген VPI вируса гепатита А штамма HAS 15 с поздним промотором ВОВ Р . 2 с.п. ф-лы. § (Л с о Ј

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

PECflVSllHH (51)5 С 12 N 15/79

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬП ИЯМ

APH ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4499300/13 (22) 25 ° 10.88 (46) 07 ° 04.91. Бюл. Р 13 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной бислогии (72) Г. Г.Приходько, И. Х.Урманов, О.И.Серпинский, Н.Н.Микрюков и В.Е.Чижиков (53) 575.224.2:577.2(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

11 1354709, кл. С 12 N 15/00, 1985. (54) ВЕКТОРНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рТК

1261, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ИНТЕГРАЦИИ

ЧУЖЕРОДНОГО ФРАГМЕНТА В ГЕНОМ ВИРУСА

ОСПОВАКЦИНЫ, И СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ (57) Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой рекомбинантную плазмиду, обеспечивающую интеграцию чужеродного генетического материала в геном вируса осповакцины (ВОВ) штамма ЛИВП. Целью изобретения является расширение выбора стратегии клонирования чужеродного генетического матеИзо бре тение о тно сит ся к гене тической инженерии и биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантов вируса осповакцины (ВОВ).

Целью изобретения является расширение выбора стратегии клонирования чужеродного генетического материала в составе ТК-гена ВОВ штамма ЛИВП.

Сконструирована рекомбинантная плазмида рТК 1261, содержащая векторную часть, а также нуклеотидную пос-..Я0„„1640163 A 1

2 риала в составе ТК-гена вируса осповакцины штамма ЛИВП. Новая плазмидная

ДНК рТК 1261 состоит из фрагментов генома ВОВ штамма ЛИВП, расположенных на расстоянии 142-736 н.п. и 7691379 н. п. от HindIII-сайта рестрикции К-фрагмента генома ВОВ, слитого полилинкера плазмид 1285 и pUC 18 длиной 56 н. п., содержащего уникальные сайты рестрикции ClaI, HindIII, SphI, PstI, Sal GI, ХЬаЕ, Bam HI, SmaI, KpnI, SacI, Есо RI и векторной части в виде ClaI-PvuII фрагмента ДНК плазмиды рВК 322 ц . Предложенная векторная конструкция позволяет расширить стратегию клонирования чужеродного генетическоro материала в составе ТК-гена ВОВ штамма ЛИВП. Полученная генно-инженерная субстанция характеризуется на способность интегрировать в геном ВОВ чужеродный генетический материал, напр мер ген VPI вируса гепатита А штамма HAS 15 с поздним промотором ВОВ Р, 2 с.п. ф лы ° ледовательность ТК-гена ВОВ штамма

ЛИВП с полилинкером внутри него.

Плазмидная ДНК рТК 1261 размером

3574 н.п. состоит из: векторной части в виде ClaI-PvuII фрагмента ДНК плазмиды pBR 322 длиной 2313 н.rr. содержащего ген устойчивостИ к ампициллину в качестве гене тиче ско го маркера;, фрагмента генома ВОВ штамма ЛИВП, кодирующего последовательность ТК-гена от 142 до 1379 н. и содержащего слитый полилинкер, плазмид рТК 1285 и pUC 18, имеющего ATG-кодон и три уникальных сайта с постферментативным „ с 5 формированием 3 -концевых участков

ДНК (GCATG C, GGTAC C и GAGCT C).

Способ конструирования рекомбинантяой плазмидной ДНК рТК 1261 включает в себя:

10 гидролиз плазмидной ДНК рТК 1285 рестриктазами HindIII и Бсо RI с целью частичного удаления полилинкера плазмиды; гидролиз плазмидной ДНК pUC 18 рестриктазамин HindIXI и Есо RI c целью выделения полилинкерной ДНК; лигиров ание линеаризованной плазмщ с целью получении целевой плазмидной ДНК рТК 1261.

Способ конструирования позволяет ввести полилинкер с уникальными сайтаки расщеплечия ферментов ClaI

HindIII, SphI, Sal GI, ХЬаХ, Bam НХ, ЯшаХ, KpnI, SacI и Есо RI внутри

ТК- гена.

Сущность изобретения заключается в том, что для интеграции чужеродного гене тиче ско го материала в геном ВОВ конструируют плазмидный вектор, содержащий ТК-ген с прилегающими районами HindIII —. К-фрагмента ДНК ВОВ и уникальные сайты рестрикции HindIII и Eco RI по которым клояируют полилинкер. Искусственно введение 10 уникальных сайтов рестрикции используют для клонирования чужеродных генов, которые методом котрансфекции интегрируют в ДНК ВОВ, Пример 1. Конструирование векторной плазмидной ДНК рТК 1261.

5 мкг плазмидной ДНК рТК 1285 подвергают совместному гидролизу эндонуклеазами рестрикции HindXII (5 е.а.) и Есо RI (5 е.а.) в 10 мИ трис-НСХ, (рН 7,5) и 10 мИ 2-меркаптоэтанола; 50 Им NaCX, 10 мИ MgC1 при 37 С 60 мин, как описано. После

0 тепловой денатурации белков при 65 С в течение 20 мин продукты ДНК разделяют электрофоре зом в 47-ном полиакриламидном геле (ПААГ) и выделяют больший фрагмент ДНК.

20 мкг плазмидной ДНК pUC 18 расщепляют ферментами HindIII и.Есо RI, 55 как описано, и выделяют HindlIIEco RI-полилинкер из 87-ного ПААГ.

Линеаризованную плазмидную ДНК рТК 1285 Hind III Eco RI u HindIII4

Есо RI-полилинкер сшивают ДНК-лигазой фага Т4 (1 е.а.) в 50 мИ трис

НС1, рН 7,5; 0,5 мИ АТР, 10 мИ 2-меро каптоэтанола, 5 мИ MgC1< при 8 С

12 ч. Препарат ДНК осаждают спиртом.

1/10 часть ДНК трансформируют в компетентные клетки штам а Е.ñîli

НВ 1 01. Ппазмидную ДНК (рТК 1261) выделяют щелочным методом из положительно гибридизующейся in situ колонии Е.coli и подвергают рестрикционному анализу. Структуру полилинкера подтверждают секвенированием ДНК от

ClaI-сайта рестрикции методом ИаксамаГилбе рта.

Пример 2. Получение рекомбин ант но го ВОВ, соде ржаще го re í VP I вируса гепатита А штам«а HAS 15.

Плазмидяую ДНК рТК 1285-Ps) -ЧРХHAV расщепляют рестриктазами Bam НХ и Есо Р.I в стандартных условиях. Сконцевую часть гена VPI ВГА выделяют из 47-ного ПААГ и сшивают с Bam НХЕсо RI линеаризованной плазмидой рТК 1261 с помощью ДНК-лигазы фага

Т4. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма """.coli

НБ 101 и отбирают колонии ДНК-ДНКгибридизацией. Рекомбияаятные молекулы ДНК (рТК 1261-СЧРХ-HAV) анализируют рестриктазами Bam HI PvuIX u

Есо RI.

Плазмидную ДНК рТК t285-Рц -VPI—

HAU гидролизуют эндонуклеазами рестрикции ClaI и Ваш HI. Выделяют меньший фрагмент ДНК, содержащий поздний промотор Р ВОВ и N-концевую часть гена

ЧРХ ВГА„ и сшивают с ClaI-Bam HI линеаризованной плазмндой рТК 1261CVPI-HAV. Отбирают рекомбинантные молекулы ДНК (рТК 1261-Р -ЧРХ-HAU) и анализируют рестриктазами Есо RI, PstI,, Bam НХ и ClaI.

ДНК плазмиды рТК 1261-Р„ -ЧРХ-HAV используют для трансформации клеток почки зеленой мартьшпи CVI, заражен" ных ВОВ штамма ЛИВП. Урожай вируса после трансформации высевают на монослой перевиваемой линии клеток

Н143. В присутствии 25 мкг/мл бром-. дезоксиуридина отбирают вирусные ТКклоны. Методом ДНК-ДНК-гибридизации проверяют наличие гена VPI ВГА в клонах. Вирусную рекомбинантную ДНК выделяют, как описано, и подвергают анализу рестриктазой HindXII.

Таким образом, сконструирован новый плазмидный вектор рТК 1261, име-

; r=,4

Предлагаемое техническое решение может найти применение при создании генно-инженерных живых вакцин на основе ВОВ.

Формула изо бре тения

Составитель E. Кузнецова

Редактор И.Дербак Техред Л,Олийнык

Корректор C.éåêìàð

Заказ 997 Тираж 386 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина,101 ющий расширенный состав сайтов рестрикции внутри ТК-гена ВОВ (ClaI, Hind III, SphI, Рз tI, Sal GI, ХЬаХ „

8am HI, SmaI, Kpnl) что поэволяе т клонировать чужеродную ДНК без ATGкодона с помощью коннекторного способа (в отличие от известного). На примере гена VPI вируса гепатита А продемонстрирована возможность использования плазмиды рТК 1261 для получения вирусных рекомбинантов.

Векторная плазмидная ДНК рТК

t26i, предназначенная для интеграции чужеродного фрагмента в геном вируса осповакцины размером 3574 н.п., содержащая: фрагменты ДНК pBR 322, жчеющие госледовательности, соответствующие координатам 3-28 н.п. и 2968-4357 н.п., последний из которых с геном устойчивости к ампициллину; фрагменты ДНК вируса осповакцины, расположенные на расстоянии 142736 н.п. и 769-13?9 н.п. от HindIIIсайта рестрикции К-фрагмента генома

ВОВ штамма ЛИВП, кодирующие N- u

0163 6

С-концевые части ТК-гена соответственно;

ClaI — HindIII- u HindIIE — Есо RI— фрагменты ДНК плаэмид рТК 1285 и рПС 18 длиной 6 и 50 н.п. соответственно " участкамп узнавания рестриктаз СlaI, HindIIE, ЯрЬХ, PstI, Sal Сl, XbaI, Ваш Hl, SmaI, Крг,l, SacI, Есо RI; участок инциации трансляции: ATGкодон в последовательности GCATGC; сайты рестр :кции с постферментативным формированием 3 -выступающих конI цов: SphI, Pstl, KpnI, Sacl; уникальные сайты рестрикции ClaI, НхМ111, SphI, Sal GI, Xbal, Bam Нl, SmaE, Крпl, SacI и Есо RI; генетические маркеры плазмиды:

20 amp " — устойчиво сть к ампициллину емкость от 100 до 1,4 тыс. н.п.; штамы-хозяева: штгммы Е.со1

d am -фено типа.

2. Способ конструирования вектор25 ной плазмидной ДНК рТК 1261 для получения рекомбинантов вируса осповакцины, заключающийся в том, что совместным гидролизом рестриктаэ HindIII и Есо RI голучают линеризованную плазмиду рТК 1285 HindIII Eco RI и полилинкерную ДНК плазмиды pUC 18 размером 50 н.п., которые сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4, и получают целевую векторную плазмиду рТК

1261.