N,n-дизамещенные 5-аминонафталин-1-сульфамиды в качестве детектируемых групп для аиса-анализа протеаз

 

Изобретение относится к арилсульфамидам, в частности к N, N-дизамещенным 5-аминонафталин-1-сульфамидам ф-лы, где группа NR₁, R₂ - (CH₃)C₂H₅: N(CH₃)C₃H₇; N(CH₃)C₃H₇, N(CH₃)C₄H₉, N(C₂H₅) - цикло C₆H₁₁, которые могут быть использованы в качестве детектируемых групп для АИСА-анализа протеаз. Цель - выявление соединений, позволяющих увеличить количество анализируемых ферментов. Получение ведут реакцией 5-нитронафталин-1-сульфохлорида с первичными аминами, алкилированием полученного соединения и восстановлением нитропроизводного на Ni - содержащем катализаторе. Использование новых соединений дает лучшие результаты, чем известные АИСА. 5 табл., 2 ил.

Изобретение относится к производным аминонафталинсульфамидов, а именно к новым N,N-дизамещенным 5-аминонафталин-1-сульфамидам формулы , где группа NR₁R₂-N(CH₃)C₂H₅; N(CH₃)C₃H₇; N(CH₃)-изо-С₃Н₇; N(CH₃)C₄H₉; N(C₂H₅) в качестве детектируемых групп для АИСА-анализа протеаз, которые могут найти применение в химической промышленности. Целью изобретения является изыскание в ряду замещенных аминонафталинсульфамидов новых соединений, позволяющих при использовании их в качестве детектируемых групп для АИСА-анализа увеличить количество анализируемых ферментов. П р и м е р 1. 5-Нитронафталин-1-(N-циклогексил)сульфамид. Смешивают 2 мл (0,02 моль) циклогексиламина, 50 мл толуола, 100 мл воды и 26,5 г двузамещенного карбоната натрия. При перемешивании и охлаждении ледяной водой добавляют 2,7 г (0,01 моль) 5-нитронафталин-1-сульфохлорида. Смесь выдерживают 3 ч при комнатной температуре, нейтрализуют концентрированной НСl до рН 5, отделяют толуольный слой, водный слой экстрагируют хлороформом. Оба органических раствора соединяют, упаривают и остаток перекристаллизовывают из бензола. Получают 2,7 г (выход 82%) целевого продукта с т. пл. 125-127^оС. П р и м е р 2. 5-Нитронафталин-1-(N-метил)сульфамид. 15 г (0,055 моль) 1-нитронафталин-5-сульфохлорида растворяют в 300 мл абсолютного хлороформа. При охлаждении ледяной водой через раствор в течение 2 ч пропускают метиламин. Реакционную смесь фильтруют, промывают водой, сушат, упаривают и перекристаллизовывают из бензола. Получают 12,4 г продукта (выход 84%) с т.пл. 145-147^оС. П р и м е р 3. 5-Нитронафталин-1-(N-этил)сульфамид. Получают аналогично примеру 1 из 2,5 г хлоргидрата этиламина с выходом 75% П р и м е р 4. 5-Нитронафталин-1-(N-метил-N-этил) сульфамид. К смеси 3,4 г (0,012 моль) 5-нитронафталин 1- (N-этил) сульфамида, 200 мл бензола. 9,9 мл 50%-ного раствора NaOH и 5,12 г тетрабутиламмония бромида при перемешивании приливают 1,5 мл (0,02 моль) метилйодида. Смесь нагревают до 60^оС 0,5 ч, охлаждают, бензольный слой промывают разбавленной НСl до нейтральной реакции. Продукт сушат, упаривают и перекристаллизовывают из четыреххлористого углерода. Получают 3,1 г целевого продукта (выход 89%) с т.пл. 60-62^оС. П р и м е р 5. 5-Нитронафталин-1-(N-метил-N-этил)сульфамид. К смеси 2,7 г (0,01 моль) 5-нитронафталин-1-(N-метил)сульфамида, 200 мл бензола, 8,5 мл 50%-ного раствора NaOH и 0,8 г тетрабутиламмония бромида при перемешивании приливают 1,5 мл (0,02 моль этилбромида). Смесь нагревают при 60^оС в течение 2 ч. Реакционную массу охлаждают, бензольный слой отделяют и промывают разбавленной HСl до нейтральной реакции, сушат и упаривают, остаток перекристаллизовывают из четыреххлористого углерода. Получают 2,5 г целевого продукта (выход 88%) с т.пл. 60-62^оС. П р и м е р 6. Нитронафталин-1-(N-метил-N-пропил)сульфамид. Аналогично примеру 4 из 5,4 г (0,02 моль) 1-нитронафталин-5-(N-метил)сульфамида получают 4,9 г (выход 80%) целевого продукта с т.пл. 95-97^оС. Другие примеры получения нитронафталинсульфамидов приведены в табл.1. П р и м е р 7. 5-Аминонафталин-1-(N-метил-N-этил)сульфамид. 12,9 г (0,04 моль) 5-нитронафталин-1-(N-метил-N-этил)сульфамида растворяют в 400 мл метанола, добавляют никель Ренея и гидрируют водородом при р=1 ат, t=20^oC. После поглощения рассчитанного количества водорода катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха и получают 10,5 г (выход 81%) целевого продукта с т.пл. 83-85^оС (метанол). Другие примеры синтеза аминонафталинсульфамидов и их физико-химические свойства приведены в табл.2 и 3. АИСА-анализ метод анализа смесей протеаз и пептидаз, в том числе близкой специфичности. Основа метода состоит в использовании в одном анализе смеси нескольких субстратов с определением продуктов протеолиза каждого из них. Метод АИСА-анализа применяют к протеазам и пептидазам, способным разрывать амидную связь, образованную карбоксильной группой аминокислоты или пептида и аминогруппой АИСА, т.е. к тем же ферментам, для которых используются обычные пептидные хромогенные субстраты. Метод применяют и для описания побочных ферментативных активностей, например выявления аминопептидазной активности у экзопротеаз. Идентификация соответствующих ферментативных активностей основана на детекции продуктов протеолиза, образующихся при действии фермента на смесь нескольких субстратов, причем смесь составляется так, что детектируемые группы, входящие в состав субстратов, различны и могут определяться хроматографией. Получаемую хроматограмму АИСА-спектра используют и саму по себе для идентификации фермента. Спектры снимают на хроматографе ВЭЖХ фирмы "Дюпон" (США) с использованием колонки "Zorbax" C-18 (4,6х250 мм) при 40^оС и скорости потока 1 мл/мин с детекцией по поглощению λ=255 нм и элюацией 38%-ным СН₃СN с добавкой 0,1 М ацетата аммония. Времена удерживания пиков приведены в табл.4. Кроме того, протеазу можно характеризовать отношением кинетических констант расщепления двух субстратов, выбранным из всего множества подобных отношений по принципу максимального отклонения от средних для нескольких протеаз значений. П р и м е р 8. К раствору 3,5 г карбобензоксиаргинина в 20 мл диметилформамида приливают при -10^оС полученный при -30^оС и выдержанный при 20^оС в течение 40 мин раствор 1 мл SOCl₂ в 10 мл диметилформамида, перемешивают 30 мин при 4^оС, охлаждают до -20^оС, добавляют раствор смеси аминонафталин-5-сульфамидов в 10 мл диметилформамида (по 1 ммоль каждого из пяти или эквимолярные количества каждого из серии, в сумме 5 ммоль), вливают 1,5 мл триэтиламина, перемешивают 4 ч при 4^оС и 12 ч при 20^оС, добавляют триэтиламин до слабощелочной реакции. Приливают 150 мл этилацетата и 200 мл гексана, осадок промывают смесью этилацетат гексан, растворяют в смеси бутанол вода, верхний слой отделяют, водный экстрагируют бутанолом. Бутанольные вытяжки промывают 5% -ным NaHCO₃, 10%-ным КHSO₄, упаривают досуха, заливают 40 мл 2,5 М НВr в СН₃СООН. Через 1,5 ч добавляют 600 мл диэтилового эфира. Осадок растворяют в воде, экстрагируют этилацетатом. Водный слой подщелачивают NaOH до рН 7,5, экстрагируют бутанолом, упаривают, растворяют в воде до концентрации 300 о. е. в мл. Экстрагируют смесью этилацетат-гексан 4:1. Экстракт отбрасывают, водный слой упаривают в вакууме до удаления этилацетата и используют для приготовления субстратных смесей, растворяя аликвоту в буферном растворе (например, 0,05 М трис-НСl+0,005 М дитиотреита, рН 7,4) и разбавляют водой до концентрации 7 о.е./мл. Добавляют один из не использованных для приготовления субстратной смеси АИСА в качестве внутреннего стандарта до концентрации 0,1 о.е./мл, аликвоту 0,5 мл помещают в кювету спектрофотометра, термостатируют. Добавляют 10 мкл исследуемого фермента, регистрируют изменение поглощения λ360 нм во времени по возрастании поглощения вдвое от первоначального, останавливают реакцию добавлением, например, ингибитора протеаз данного класса. Смесь экстрагируют 0,5 мл этилацетата, экстракт упаривают, остаток растворяют в 30 мкл 38%-ного ацетонитрила с добавкой 0,1 М ацетата аммония, анализируют ВЭЖХ с элюацией тем же раствором, интегрированием пиков определяют количества образовавшихся АИСА. (Колонка Zorbax C-18, 250-4,6 мм, при 40^оС, скорость потока 1 мл/мин. УФ-детектор λ=255 нм). При определении относительных величин используют высоты пиков (Р) при графической регистрации хроматограммы. Примеры получаемых результатов. Сравнение индексов предпочтительности для коммерческих препаратов панкреатической пептидазы (А) и протеиназы К (Б) приведено на фиг. 1. С известными АИСА: для A /P= 1,06, для Б /P= 1,06 отношение индекс предпочтительности 1,00. С новыми АИСА: для А P /P= 1,37, для Б P /P 0,73 отношение 1,87. Аналогично для А P /P= 0,615, для Б P /P= 1,13, отношение 0,545. Из приведенных данных видно, что использование новых аминонафталинсульфамидов для анализа перечисленных протеаз дает лучшие результаты, чем известные АИСА. Для иллюстрации полезности предлагаемых веществ приводятся АИСА-спектры нескольких ферментов, полученных на смеси 16 субстратов типа Arg-АИСА (см. фиг.2). На фиг. 1 и 2 приведены спектр В-1 и В-2 протеазы III из папаи (пролаза Р-4880 Sigma), B-3 папаин "Спофа"; спектр Г-бактериальная протеаза (Sigma P-0384). Изучают также возможность использования для АИСА-анализа метилбутил- и этилциклогексилзамещенных сульфамидов (соединения 1 и 4 в табл.2). Для них получают объемы удерживания 23,16 и 57,10 соответственно. Это показывает, что метилбутильные и этилциклогексильные производные не удобны для использования в смеси с низшими АИСА в описанных условиях хроматографии, так как объемы удерживания их очень велики по сравнению с приведенными в табл.5. Это ведет к увеличению времени анализа. Для подтверждения полезности этих соединений был снят АИСА-спектр аминопептидазной активности комплекса протеиназ из слизистой оболочки свиньи (Sigma) при ВЭЖХ в градиентном режиме [условия градиента 35% → 58% СН₃СN (0,05 М NH₄CH₃COO) за 20 мин при задержке градиента 6,5 мин, скорость потока 1 мл/мин, t=40^oC, колонка С-С-С-18] При использовании смеси субстратов, синтезированных из пяти несимметрично замещенных АИСА, лучшими (максимальные значения К_кат/К_м) являются именно эти два аналога. Пики, соответствующие метилэтильному, метилизопропильному и метилпропильному производным, меньше 1 мм, пик метилбутильного производного 24 мм и пик этилциклогексильного производного 18 мм. Таким образом, использование предлагаемых соединений в качестве детектируемых групп позволяет увеличить количество анализируемых ферментов.

Формула изобретения

N,N-дизамещенные 5-аминонафталин-1-сульфамиды общей формулы где группа NR₁R₂-N(CH₃)C₂H₅; N(CH₃)C₃H₇; N(CH₃)-изо-C₃H₇; N(CH₃)C₄H₉, в качестве детектируемых групп для АИСА-анализа протеаз.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 8-2000

Извещение опубликовано: 20.03.2000        

---