Штамм бактерий соrynевастеriuм аммоniаgеnеs продуцент тимина

 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и касается микробиологического синтеза тимина. Цель изобретения - получение нового штамма бактерий, продуцирующего тимин. Предлагается штамм Corynebacterium (Вrevibacterium) ammoniagenes МС-13(регистрационный номер ВКПМ В-4765), полученный из типового штамма Вrevibacterium ammoniagenes ATCC6872 генетико-селекционным путем. За 120 ч ферментации производит 3-4 г/л тимина.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 1/20, С 12 P 17/12

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ()Ь

)(Л о (Ь

О (К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (2 1) 4695294/13 (22) 23.05.89 (46) 23.05.91. Бюл. йв 19 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) А.А.Нудлер, А.Г.Гарибян и Г.И.Бурд (53) 579.871.8(088.8) (56) Gohn Wiley, Advanced Org.Chem. N,J.

1985. р.390.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и касается микробиологического синтеза тимина — пиримидиного азотистого основания, применяемого как сырье для синтеза лекарственных препаратов антиконцерогенного и антивирусного действия.

Микробиологический способ производства тимина путем прямой ферментации не . известен. Сведения о штаммах-продуцентах отсутствуют.

Целью изобретения является новый штамм бактерий Corynebacterlum (Brevlbscterlum) аавоп!ацепез — продуцент тимина.

Штамм Corynebacterium (BrevIbactertum) ammonladenes NG-13 получен генетико-селекционным путем с использованием мутагенов (нитрозогуанидин, метилметансульфонат, диэпоксиоктан) и аналогов пиримидинов. Исходным материалом для селекции послужил типовой штамм

Brevlbscterlum smmonlsgenes АТСС 6872.

„„5U„„1650696 А1 (54)Ш Т А M М Б А К Т Е Р И Й CORYNEBACTERIUM AMMONIAGENES — ПРОДУЦЕНТ ТИМИНА (57) Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и каса. ется микробиологического синтеза тимина.

Цель изобретения — получение нового штамма бактерий, продуцирующего тимин. Предлагается штамм Corynebycterlum (Brevibacterium)

ammoniagenes NG-13 (регистрационный номер

ВКПМ В вЂ” 4765), полученный иэ типового штамма Brevibacterium ammoniagenes АТСС6872 генетико-селекционным путем. За 120 ч ферментации производит 3 — 4 г/л тимина, Штамм-и родуцент тимина Corynebacterium

ammoniagenes NG-13 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером

ВКПМ 8-4765.

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительная палочка длиной

1,5-2,0 мкм, шириной 0,6 — 1,0 мкм беэ жгутиков, неподвижная, не образует спор. На полноценной агаризованной среде (L-агар, мясопептонный бульон Хоттингера) через

3-4 сут инкубации при 28 — 34 С образует круглые колонии диаметром 1,0-1,5 мм с ровными краями. бледно-желтого цвета.

Поверхность колоний гладкая. с матовым блеском и слабой концентрической исчерченностью. на 2-3-е сутки инкубации колонии выделяют в среду красно-бурый пигмент. Облигатный аэроб. При инкубации в полноценной жидкой среде без встряхивания при 34 С рост отсутствует, при интенсивной аэрации наблюдается обильный

1 рост. Беэ встряхивания суспензия бактерий флокулирует, образуя осадок бледно-желтого цвета. Для роста на жидкой и агаризованной синтетической среде клетки продуцента требуют витаминов В>, Вз и биотина, а так- 5 же аденина и L-аргинина.

Микроорганизм поддерживают на косяках с плотной питательной средой (L-агар, мясо-пептонный агар или агар Хоттингера).

Выращивают его на синтетической солевой 10 среде следующего состава, г/л:

Глюкоза 20,0

Мочевина (стерилизуется отдельно) 2,0 (NH4)2SO4 3,0 15

КН2Р04 1,0

К2НР04 3,0

Mg S04 7Н20 0,3

Аденин 0,001

СаС!г 2НгО 0,01 20

FeS04 7Н20 0,01

МпС12 4Н20 0,0026

Тиамин 0,005

Пантотенат кальция 0,01

Биотин 0,00003 25

L-Аргинин 0,001

Дистиллированная вода (рН 7,3) До 1л

На основе указанной среды готовят плотную, добавляя 20 г/л агара. С макси- 30 мальной скоростью продуцент растет как на полноценной, так и на синтетической солевой среде при 34 С и рН 7,0 — 7,3, Физиолого-биохимические признаки. .Штамм NG-13 является ауксотрофом по 35 аденину и брадитрофом по аргинину, В качестве источника аденина может использоваться также аденозин, в меньшей степени, адениловые нуклеотиды, Желатину не разжижает, на крахмальном агаре и на обеэжи- 40 ренном молоке роста нет, Клетчатку не разрушает и не усваивает, нитраты не восстанавливает. Усваивает глюкозу, фруктоэу. рибоэу, цитрат, пуриновые и пиримидиновые рибонуклеоэиды, плохо усваивает са- 45 харозу, сорбит, маннит, не потребляет лактозу, галактоэу, фумарат, сукцинат, дезоксирибозу, ксилоэу, арабиноэу. Устойчив к бактериостатическому действию 5-фторурацила, 5-фторуридина, аэаурацила, азау- 50 ридина и 5-фтордезоксиридина, Содержит мутацию по нуклеотиддифосфатредуктазе, приводящую к сверхпродукции тимина. Антагонистических свойств нет, не патогенен, За 120 ч ферментации образует 3-4 г/л 55 тимина.

Пример 1. Посевную среду инокулируют бактериями, выращенными на полноценной агаризованной среде в течение

0,1

0,001

0,01

0,036

Пример 2. Условия выращивания посевного материала и проведения ферментации такие же, как и в примере 1, за исключением того, что для ферментации используют обогащенную среду с кукурузным экстрактом, Состав обогащенной ферментационной среды следующий, г/л:

КН2Р04 10,0

К2НРО4 10,0

MgSO4 7H20 10.0

Кукурузный экстракт 40,0

Глюкоза 100,0

Мочевина (стерилизуется отдельно) 6,0

Водопроводная вода (рН 7.5 — 8,0, доводят

5п, NaOH) До1л

24-28 ч. Посевной материал получают выращиванием в колбах объемом 750 мл, содержащих 75 мл среды, помещенных на термостатируемую круговую качалку (200—

240 об/мин) при 30 — 34 С в течение 24 ч.

Состав посевной среды, г/л:

Глюкоза 20,0

Пептон 10,0

Дрожжевой экстракт 10,0

NaCI 2,0

Водопроводная вода (рН 7,0 — 7,3) До1л

Затем в колбу объемом 750 мл, содержащую 30 мл ферментационной среды, вносят

5 — 10 посевного материала и инкубируют на круговой качалке (300 — 400 об/мин) при

34 С. Ферментацию проводят в синтетической солевой среде следующего состава, г/л:

KHzP04 10,0

KZHPO4 10,0

MgSO4 7Н20 10,0

Пантотенат кальция 0,01

Аденин 0,02

Глюкоза 100,0

Мочевина (стерилизуется отдельно) 6,0

Тимамин 0.005

Биотин 0,003

Аргинин 0,02

Микроэлементы (при использовании водопроводной воды микроэлементы не добавляют):

Сас!2 2Н20

ZnSO4 7H20

FeS04 . 7Н20

MnCI2 4Н20

Дистиллированная вода (рн 7,3-7,4) До 1л

Спустя 120 ч культуральная жидкость содержит 3,0 г/л тимина, 1650696

Составитель О.Скородумова

Техред M.Моргентал Корректор M.Äåì÷èê

Редактор Н.Рогулич

Заказ 1583 Тираж 381 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент"; г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

После ферментации в течение 120 ч культуральная жидкость содержит 4 г/л тимина.

Содержание тимина в культуральной жидкости определяют с помощью бумажной хроматографии в системе растворителей: нбутанол:ледяная уксусная кислота:вода (2:1:1).

Качественный анализ основания проводят несколькими способами: путем тонкослойной хроматографии на силикагелевых пластинках в трех системах растворителей: н-бутанол: ледяная уксусная кислота:вода (2:1:1), н-бутанол:муравьиная кислота:вода (77:10:13) и изомасляная кислота:аммиак>вода (66:1,5:33); путем жидкостной.хроматографии на колонке Llchorosorb RP 8 с обращеннофазным носителем С-8 (хроматограф фирмы Gilson, Франция); путем определения УФ-спектров поглощения (рН 2,0 7.0 и 11,0 в диапазоне длин волн от

200 до 300 нм) элюатов из соответствующего тимину пятна, вырезанного из бумажных

5 хроматограмм; биологическим способом путем добавления элюата из соответствующего тимину пятна, вырезанного из бумажной хроматограммы, к клеткам тимин — зависимого мутанта Escherlchia coll К-12: элюат

10 поддерживает рост этого мутанта, С помощью перечисленных методов установлено, что вещество, накапливающееся в культуральной жидкости, после культиви-:. рования штамма NG-13, аутентично стан15 дартному препарату тимина фирмы Sigma.

Формула изобретения

Штамм бактерий Corynebacterium

ammonlagenes ВКПМ В-4765 — продуцент тимина.