Фаговый вектор @ к9 для конструирования геномных библиотек

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к генетической инженерии. Целью изобретения является упрощение способа конструирования геномных библиотек при использовании вектора ASK9. Вектор ASK9 получен на основе фага AEMBL3 и фазмиды. Он позволяет получать репрезентативные геномные библиотеки с использованием рестриктаз BamHI, SauSAI. MBOI и других, имеющих такие же липкие концы. ASK9 дает возможность перевода вставки в плазмидную и одноцепочечную форму, а также используя коммерческие препараты праймеров, специфически метить 5 и Звонцы вставки, что удобно для целей прогулки по хромосоме.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л С 12 N 15/63

l3CEi,ОЮЗА.. -.Я,,„,д;,. л,, ., !l!„I.":Л

ГОСУДАРСТВЕ ННЫ И КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4466372/13 (22) 28.07,88 (46) 23.05.91, Бюл, М 19 (71) Институт молекулярной биологии. им. В.А.Энгельгардта (72) Е.P.Çàáîðîâñêèé, О.В.Турина и Л.Л.Киселев (53) 575.224-2.577,2(048)(088.8) (56) Нап F.H„Rutter W,F. Nucl, Acids Res., 1987, ч, 15, р. 6304.

Нап F.Н., Stratowa С., Runer W.F„

Biochemistry, 1987, ч. 26, р. 1617-1625. (54) ФАГОВЫЙ ВЕКТОР ЯЯК9 ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ГЕНОМНЫХ БИБЛИОТЕК

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии.

Целью изобретения является упрощение способа конструирования геномных библиотек при использовании вектораЯЯК9, ВекторiLSK9 получен íà основеХЕМВ1 3 и фазмиды SK2 МВ, Он характеризуется следующими признаками: размер-48 т.п.н., емкость встраиваемой ДНК 4,5 — 19,0 т.п.н.

Состоит из ВСЕМВ 3, соединенного с фазмидой SK2 ASR. Фазмида SK2 hSR представляет собой фазмиду SK2A, в которой удалены Sall u EcoRI участки. Спектр хозяев для ЯЯК9: LE392 = F hsd R 514 (гк, гпк ), sup

Е 44, sup F 58, Iac Y 1/OZ (lac I ZY)6, gal К2, gal Т 22, met В1, trp R 55; j М 109 = rec А1, hlac pro, end А1, gyr A 96. thi-1, hsd R 17. sup

Е 44, rel А1, F; tra D36,рго АВ . Iac Р25M15, 0359 = hsd Rl > hsd Мк, sup Рф 80, р 2.

Полученный вектор позволяет получать репрезентативные геномные библиотеки с

„„5U ÄÄ 1650698 А1 (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, Целью изобретения является упрощение способа конструирования геномных библиотек при использовании вектора АЯК9, Вектор ilSK9 получен на основе фага ВСЕМВ 3 и фазмиды. Он позволяет получать репрезентативные геномные библиотеки с использованием рестриктаз BamHI, ЯаоЗА!, MBOI u других, имеющих такие же липкие концы.

ЛЯК9 дает возможность перевода вставки в плазмидную и одноцепочечную форму, а также используя коммерческие препараты праймеров, специфически метить 5 и 3 -концы вставки, что удОбно для целей "и рогулки" по хромосоме.

t . использованием рестриктаз Baml, Sau 3AI, MbOI и других, имеющих такие же липкие концы. ЯЯК9 дает возможность перевода вставки в плазмидную и одноцепочечную формы, при этом используется способ, принципиально отличный от запатентован- 0 ного фирмой "Stratagene". Ql

Применение этого метода позволяет С быстро, эффективно и стабильно осущест- Оь вить перевод вставки в плазмидную форму. сО

Для библиотек вМЯК9 гарантированы невоз- р можность суперинфекции фагом М13 и неконтролируемый перевод вставки ДНК в фаге 1 в одноцепочечную форму. ЯЯК9 дает возможность, используя коммерческие препараты праймеров, специфически метить 5и 3-концы вставки, что удобно для целей

"прогулки по хромосоме".

Таким образом, применение АЯК9 для конструирования геномных библиотек дает значительный выигрыш во времени.

1650898

Пример 1, Способ заключается во введении в фаг АЕМВ З фаэмиды SK2 ASR.

Стадия 1, ДНКфазмиды SK2A, гидролиэуют рестриктазой Sall и останавлйвают реакцию прогреванием 15 мин при 65ОC. С помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 из Е,coll в присутствии всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов "затупляют" липкие концы. Затем раствор ДНК разводят в три раза и проводят самолигирование. Лигированную ДНК вводят в клетки Е.coli штамм I.M,109, Рассев бактерий производят на чашки Петри с 2%-ным L-агаром, содержащим 25 мкг/мл ампициллина, 0,1ь IPTG и 0,1%, X-gal. Из десяти белых колоний llo стандартным методикам выделяют ДНК и анализируют рестриктазами

EcoRI, Hami, $ай. Фазмиду, содержащую

EcoRl, Baml, но не содержащую Sall-участков узнавания рестриктазами и названную

SK2 AS, используют на следующей стадии.

Стадия 2. Удаление участка узнавания рестриктазы EcoRI в фазмиде SK2 М. ДНК фазмиды SK2 AS гидролизуют рестриктазой

EcoRl и останавливают реакцию прогреванием 15 мин при 65 С. С помощью фрагмента Кленова в присутствии всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов затупляют липкие концы. Затем ДНК разводят в три раза и проводят самолигирование. Лигированную ДНК расщепляют рестриктазой

Есой! и вводят в клетки Е.coll штамм

J.M.109. Рассев бактерий производят на 1= агар с 25 мкгlмл ампициллином. Из десяти колоний по стандартным методикам выделяют ДНК и анализируют рестриктазами

EcoRI, BamI u Sall. Фазмиду, содержащую

8aml, но не содержащую EcoRI u Sall участков (названа SK2 Мй), используют на следующей стадии.

Стадия 3, Конструирование рекомбинантной фазмиды gSR. ДНК фага Qt И гидролизуют рестриктазой Baml и фермент инактивируют прогреванием, Затем проводят отжиг липких концов фага А инкубацией раствора ДНК при 42 С в течение 1 ч, и центральный Baml — фрагмент размером около 6,5 тыс. пар нукл. очищают гель-электрофорезом в 0,7 (,-ной легкоплавкой агароэе (препарат А), ДНК фазмиды SK2 Мй гридролиэуют рестриктазой Hami и после инактивации фермента прогреванием лигируют с препаратом А. Лигированную ДНК вводят в клетки E,coll штамм J.M. 109 и рассевают на L-агар с ампициллином (25 мкг/мл). С выросших колоний снимают отпечатки на нитроцеллюлоэные фильтры и проводят гибридизацию с препаратом А, ДНК которого метят Р с помощью никтрансляции. Клетки иэ пяти колоний, гибридиэующихся с препаратом А, наращивают в

10 мл 1=среды с ампициллином (100 мкг/мл) и выделяют плазмидную ДНК стандартным

5 методом. Анализ полученной ДНК рестриктазами EcoRI, Hami, $ай подтверждает клонирование в фазмиде SK2 ASR участка Lgtll.

Эту фазмиду, названную gSR, используют в следующей стадии.

10 Стадия 4. Конструирование фага-вектора itgEs7. ДНК фазмиды gSR гидролизуют рестриктазой Вцй и фермент инактивируют прогреванием. ДНК фага лЕМВ1 3 гидролизуют рестриктаэой Baml и фермент

15 инактивируют. Оба препарата ДНК в эквимоля рных соотношениях смешивают и лигируют. Лигированную ДНК упаковывают в белки фага il in vitro и полученные фаговые частицы рассевают на газон клеток E.coll

20 штамм LE392, содержащий 0,1% Х-ga;. Иэ десяти голубых бляшек наращивают фаг, выделяют ДНК и анализируют с помощью рестриктаз EcoRI, Hami, $аЦ. Один из фагов, названный А g ES7, имеет ожидаемую струк25 туру. Его используют на следующей стадии.

Стадия 5, Конструирование фага-вектора ЛЗК9. ДНК фага EMBL3 гидролизуют рестриктазой Baml и вставочный фрагмент размером около 13,7 тыс,пар нуклеотидов

30 очищают гель-злектрофорезом в 0,7 -ной легкоплавкой агарозе (препарат А). ДНК фага i ES7 гидролизуют рестриктазой Baml v

"плечи" очищают гель-электрофореэом в легкоплавкой агарозе (препарат Б). Препараты А и Б в эквимолярных соотношениях смешивают и лигируют. Лигированную ДН К упаковывают в белки фага А ln vitro и полученные фаговые частицы рассевают на газон клеток Е.coll; штамм LE392. Из шести

40 бляшек наращивают фаг, выделяют ДНК и анализируют с помощью рестриктаз EcoRI, Baml u Sall. Один из фагов, названный АЯК9, имеет ожидаемую структуру и используется для конструирования репрезентативных ге45 номных библиотек.

Применение АЯК9. Фаг ЯЯК9 удобен для получения репрезентативных геномных библиотек по "классической" методике.

ДНК фага ЬК9 гидролизуют 10-кратными избытками рестриктаэ EcoRI u Baml. Затем ДН К осаждают изопропанолом, причем значительная часть олигонуклеотидных фрагментов ЕсоЮ вЂ” Baml остается в супернатанте и после растворения осадка ДНК получают концевые фрагменты ("плечи"

НК9 с липкими концами Baml и внутренний фрагмент с липкими концами EcoRI.

Геномную ДНК не полностью гидролизуют рестриктазой sau ЗА1 (или МВ0 1) и

1650698 выделяют фрагменты размером 15-20 т.п.н. (с помощью гель-электрофореза или центрифугирования). Эти фрагменты лигируют с фаговой ДНК, обработанной, как описано выше, лигированную ДНК упаковывают в белки фага А in vitro и образовавшимися фаговыми частицами заражают клетки

Е.coll. При этом обычно около 70 выросших фагов — рекомбинанты, Следует отметить, что в ЯЯК9 сохранена селекция в пользу рекомбинантных фагов и исходные, не рекомбинантные ASK9 не способны размножаться на клетках E.ñot1, лизогенных по фагу Р2 (spt-фенотип) — штаммы

Q 359, NM 539.

Вставка ДНК в LSK9 может быть легко переведена в плазмидную форму. При этом используют другой принцип, чем в )2АР.

ДНК рекомбинанта АЯК9 гидролизуют рестриктазой Sall (можно применять также

Clal) и инактивируют фермент 3-кратным замораживанием/оттаиванием. Обе рестриктазы достаточно редко расщепляют эукариотическую ДНК (Яайимеет в среднем один участок узнавания на примерно 50тыс, пар нуклеотидов, à Clal — около 20 тыс, пар нуклеотидов). Затем ДНК разбавляют и самолигируют. Лигированную ДНК вводят в компетентные клетки Е,coll, которые высевают на 1=агар с ампициллином. Выросшие колонии содержат вставку ДНК в плазмидной форме, причем плазмида либо вовсе не содержит нуклеотидных последовательностей фага А (в случае Sail), либо небольшую их часть (в случае Оа!). Процесс перевода в плазмидную форму быстр (3 — 4 ч) и эффективен (0,1 мкг/мл ДНК рекомбинанта дает много сотен колоний). Так же как для АЯК12, для ЛЯК9 и его рекомбинантов существует и другой путь перевода в плазмидную форму — путь прямой инфекции фагом клеток

Е.coll, резистентных к литическому размножению фага А, однако этот путь менее удобен и может быть полезен только для специальных опытов.

При суперинфекции клеток Е.coll, содержащих плазмиду, фагом М13 ДНК плазмиды упаковываются в белки фага в одноцепочечной форме, удобной для секвенирования ДНК вставки по известному методу Сэнгера, Емкость ЛЯК9 до 19 тыс. пар нуклеотидов, что вполне достаточно для получения репрезентативных геномных библиотек, поскольку при расчетах репрезентативности. библиотеки обычно исходят иэ средней вставки в 15 тыс. нуклеотидов.

Таким образом, фагА$К9 можно использовать для конструирования репрезентативных геномных библиотек по "классиче-. скому" методу, Основные преимущества предлагаемого вектора по сравнению с известным заключается в возможности получения библиотеки генов беэ предварительной очистки "плечей" фага А, отбора против нерекомбинантных фагов, быстрого, эффективного и контролируемого перевода в плазмидную форму, свободную от "плечей" фага Я. а также возможности перевода в одноцепочечную форму для определения первичной структуры ДН К ro методу Сэнгера, в гарантированности от воэможности суперинфекции библиотеки в LSK9 фагом М13, возможности специфического мечения 5-, 3- и других участков вставки с использованием стандартных, доступных препаратов эатравок.

20

Пример 2. Клонирование в АЯК9 фрагментов геномной ДН К человека.

3 мкг ДНК человека расщепляют рестриктазой Baml в стандартных условиях и

25 инактивируют фермент прогреванием 15 мин при 65 С. 3 мкг ДHK LSK9 гидролизуют рестриктаэами Baml и Есо RI è инактивируют ферменты прогреванием, Оба препарата смешивают (весовое соотношение ДНК век30 тора и геномной ДНК 1:1) и проводят лигирование при суммарной концентрации ДНК -250 мкг/мл.1 10 мкг лигированной ДНК упаковывают в белки фага А in vitro и 1/500 полученных фаговых частиц рассевают на

35 газон Е.саН, штамм Q 359. Иэ шести случайно отобранны", бляшек в 10 мл L-среды с Е192 выращивают фаги и выделяют из них

ДН К. Электрофоретический анализ ДНК показывает, что все они рекомбинанты и со40 держат вставку ДНК 10 — 15 тыс. пар нуклеотидов, 0,5 мкг ДНК одного из них(f41) гидролиэуют в течение 30 мин 1 ед. рестриктазы Sail. Фермент инактивируют 3-кратным замораживанием/оттаиванием. ДНК

45 разводят и лигируют при комнатной температуре в течение 1 ч 0,1 мкг лигированной

ДНК добавляют к компентентным клеткам

E.coll штамм J.Ì. 109, инкубируют 10 мин при 0 С, а затем 5 мин при 38 С и после

50 добавления 1 мл L-среды еще 45 мин при

37 С. Затем 0,2 мл клеток рассевают на

L-агар с ампициллином (25 мкг/мл). Из трех колоний в 10 мл L-среды с ампициллином (25 мкг/мл). Из трех колоний в 10 мл 1 -среды

55 с ампициллином (50 мкг/мл) наращивают клетки и выделяют ДНК щелочным лизисом.

Электрофоретический анализ ДНК показывает, что плазмиды содержат ту же вставку

ДНК, что и исходный фаг М 1.

1650698

Составитель С.бандрин

Редактор Н.Гунько Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор M,Демчик

Заказ 1583 Тираж 385 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Формула изобретения

Фаговый вектор ilSK9 для конструирования геномных библиотек размером 47,7 т.п,н., содержащий Cos — Sall — фрагмент

ДНК фага AEMBL3 — левое плечо размером

20,3 т.п.н„$а! — BglA — фрагмент ДНК фазмиды SK2A размером 3,8 т.п.н., в котором методом достройки уничтожен ЙсоЮ-участок; Baml — Baml фрагмент ДНК фага

itEMBL3 размером 13,7 т.п.н.; Baml—

Hamil — фрагмент ДНК фазмиды SK2A размером 0,7 т.п.н., в котором методом достройки уничтожен $аП-участок; Sall — Соз— фрагмент ДНК фагаАЕМВ З вЂ” правое плечо, размером 9,2 т.п.н.; места возможной вставки чужеродной ДНК по участкам узнавания

5 рестриктаз Baml и EcoRI; емкость вектора

4,4 — 19,0 т,п.н.: спектр хозяйств: штаммы

Escherlchla coll: LE 392 = F hsd R 514(a, mg), sup 44, sup F 58, lac Y 10Z (lac IZYj6. galK 2, gal Т22, met B1, trp R 55; JM109 - rec А1, 10 hlac pro, end А1, gyr А96, thl-1, hsd R 17, sup

Е44, rel А1. F; Q359 = hsdRy, hsdMg, supF, ф 80, Р2.