Фаговый вектор замещения @ к15 для конструирования библиотек структурных генов к днк

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к генетической инженерии Целью изобретения является создание вектора на основе фагаА-i, сочетающего свойства как экспрессирующих, так и неэкспрессирующих векторов, а также повышение эффективности перевода вс-тзвки в плазмидную и одноцепочечную формы. Способ заключается в том. что в вектор ASK 9 встраивают sal 1 фрагмент плазмиды риС4К, в которую встроен Hind III - фрагмент фага А

союз соВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ.

РЕСПУБЛИК (я)s С 12 N 15/63

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4478259/13 (22) 31,08.88 (46) 23,05.91. Бюл. ¹ 19 (71) Институт молекулярной биологии им. B.A,Ýíãåëüãàðäòà (72) Е.P.Çàáàðoâñêèé, Е.Г.Загорская и Л.fl. Киселев (53) 575.224.2:577.2(048) (088.8) (56) Нап Т,Н., Rutter W.Т. Nucl. Acids. Res.

1987, V.15, р. 6304.

Нап Т,Н., Stratowa С, Rutter W.T.

giochemIstry, 1987, V.26, р. 1617-1625. ф4) ФАГОВЫИ ВЕКТОР ЗАМЕЩЕНИЯ АЯК

If5 ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ БИБЛИОТЕК

СТРУКТУРНЫХ ГЕНОВ кДНК

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии.

Целью изобретения является уменьшение затрат труда и ускорение генноинженерных процедур для получения репрезентативных библиотек структурных генов (кДНК) и их дальнейшего использования.

ЖК15 — фаговый вектор для конструирования библиотек структурных генов (кДНК) по участкам узнавания рестриктаз Ham 1 и

EcoR 1. Вектор можно также использовать для специального клонирования генов. Размер ЖК15 около 51,2 т.п. н. Емкость вектора от 0,2 до 15,4 т,п.н. АЯК15 состоит из ДНК фага АЯК9, s который введен инактивированный ген устойчивости к канамицину, выщепленный рестриктазой sal 1 из плазмиды

pNC4K(VIrIra I„Messing I., Gene, 1982, ч. 19, р. 259 — 268) размер 1,5 т.п.н., со встроенным в него участком ДНК фага il размером

„„ЯЦ ÄÄ 1650699 А1 (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, Целью изобретения является создание вектора на основе фага А, сочетающего свойства как экспрессирующих, так и неэкспрессирующих векторов, а также повышение эффективности перевода вставки в плазмидную и одноцепочечную формы. Способ заключается в том, что в вектор ASK 9 встраивают sal 1 -- фрагмент плазмиды риС4К, в которую встроен Hind III — фрагмент фага А.

2,0т.п.н. выщепляемый рестриктазой Hind

Ill (23130 н. — 25157 н.„).

Хозяевами могут служить штаммы Е.

coli, используемые при работе с Agt 11, XEMBL 3; AZAP, рИС 18, mp 18 и др., в том числе: LE 392 = F, hsdR 514 (г,, m, ), sup Е

44, sup F58, lac Y 10Z(lac 1 Z.Y) 6, gal К2 gaI

Т22, met. Â1, trp R55; R 359 = hsd R», hsd М», sup F, Ф80, Р2. Этот вектор обладает максимальной, известной для векторов этого класса емкостью и позволяет получать библиотеки кДНК как по стандартному методу, так и с использованием частичной достройки липких концов без применения метилаз.

АЯК15 дает возможность перевода вставки в плазмидную и одноцепочечную формы, при этом используется способ, принципиально отличный от i2AP. Применение этого метода позволяет перевести вставку в плазмидную форму быстрее (3 — 4ч), и кроме того, перевод происходит значительно эффективнее и стабильнее, Для библиотек в

1650699

ЯБК15 гарантированы невозможность неконтролируемого перевода вставки кДНК в фаге А в одноцепочечную форму. Вектор дает воэможность проводить селекцию в пользу истинно рекомбинантных фэгов перед исходными и "фальшивыми" рекомбинантами, В библиотеках, полученных skSK15, легко оценить процент рекомбинантных фагов по фенотипу. Селективное давление при конструировании в нем библиотек кДНК направлено в отличие от других векторов не в сторону маленьких вставок, а, наоборот, в сторону крупных (2 — 8 т.п.н,). кДНК в этом векторе может быть экспрессирована, причем трансляция может проходить в строго контролируемых условиях при наличии в штамме Е. coll мутации sup С или sup G, sup

Ч, sup В.

Способ конструирования вектора НК15 заключается во введении в фаг ЖК9 фрагмента ДНК размером 3,5 т,п.н., состоящего из инактивированного гена устойчивости к канамицину из pUC 4К со встроенным в него участком ДНК фага А (участок 23130 — 25157 н.).

Стадия 1. Получение плаэмиды р4К4-1

ДНК плазмиды pUC 4К гидролизуют рестриктаэой Hind ill и останавливают реакцию прогреванием 15 мин при 65 С, Затем

ДНК фага il расщепляют также Hind Н1 и фрагмент размером 2,0 т,п.н. очищают гель-электрофорезом в 0,7%-ной легкоплавкой агарозе (sigma). Очищенный фрагмент смешивают в эквимолярных концентрациях

pUC 4К, разрезанной Hind ill, и лигируют.

Лигированной ДНК трансформируют клетки E. coll штамм J.Ì.109, которые высевают на L-агар с антибиотиком — ампициллином.

С выросших колоний снимают отпечаток на нитроцеллюлозный фильтр и проводят гибридизацию с меченой P ДНК фага Я. Из шести гибридизующихся колоний клетки наращивают в 10 мл L-среды с ампициллином и выделяют ДНК щелочным лизисом.

0,5 мкг ДНК расщепляют рестриктазами

EcoR 1, Ват 1, sal 1, Hind И) и анализируют электрофорезом в 1%-ном агароэном геле, Одна из плазмид обладает прогнозируемой рестриктазной картой, одну из них, названную p4KL-1, используют на следующей стадии.

Стадия 2. Конструирование фага Я95К5.

ДНК плазмиды р4К -1 гидролизуют рестриктаэами EcoR 1 и sat 1 и реакцию останавливают прогреванием 15 мин, при 65 C.

ДНК фага А9Е$7 расщепляют рестриктазой ва11 и фермент инактивируют прогреванием

15 мин при 65 С. Оба препарата смешивают в эквимолярных соотношениях и лигируют.

Лигированную ДНК упаковывают в белки

20 фага in vitro и полученные фэговые частицы рассевэют нэ газон клеток Е.coli штамм

LE392. С чашки Петри снимают отпечаток нэ нитроцеллюлозный фильтр и проводят гибридизацию с меченым P фрагментом ДНК зг

pUC4K, содержащим ген устойчивости к канамицину и выщепленным иэ плазмиды рестриктазой sal 1. Из шести гибридизующихся бляшек нэращивают фаг, выделяют ДНК и анализируют с помощью рестриктаз EcoR 1, Bam 1 и sal 1. Все фэги содержат инэктивировэнный ген устойчивости к канамицину и один из них (QSK5) используют для конструирования XSK15.

Стадия 3. Конструирование фага-вектора iLSK15, ДНК фага АЕМВ1 3 гидролизуют рестриктазой Bam 1 и встэвочный фрагмент размером около 13,7 т.п.н. очищают гельэлектрофорезом в 0,7%-ной легкоплавкой агарозе. ДНК фага ESK5 гидролизуют рестриктазой Bam 1 и фермент инэктивируют прогреванием 15 мин при 65ОC. Оба препарата смешивают в эквимолярных соотношениях и лигируют. Лигировэнную ДНК упаковывают ln vitro в белки фага и полученные фаговые частицы рассевают на газон клеток Е. coli штамм LE392. Выросшие бляшки перекэлывают нэ газон клеток 0

30 359, лизогенных по фэгу Р2. Вставочный фрагмент из 3. EMBL 3 обеспечивает spl фенотип, т.е. невозможность размножаться на клеткахЕ, cali, лизогенных по фагу Р2, Поэтому из шести бляшек, не выросших на

35 0 359, наращивают фэг, выделяют ДНК и анализируют с помощью рестриктэз EcoR 1, 8am 1 и sal 1, Два из них имеют ожидаемую структуру и названы ЛЯК15А и ЛЯК15В, Применение ASK15. Фаг вектор АЯК15

"0 используют для получения библиотек кДНК по стандартной методике с использованием

EcoR 1 — участка. Для элиминации нерекомбинэнтных и "фальшивых" рекомбинантов рассевэют фаги на газон Е, coli 0 359, по45 скольку ни исходные, ни фаги, содержащие вставку, соединенную с линкером, не будут размножаться на этих клетках. Фаги, образованные соединением "плечей" iLSK15 с линкером(ами), нежизнеспособны из-за ма50 лой длины ДНК на любых штаммах Е. coli.

Минимальный ргэмер ДНК, способной давать жизнеспособнь е частицы фага, 37,7 т.п,н., а размер плечей ЯЯК15 37,5, т.е. меньше минимального на 0,2 т.п.н., причем яс55 но, что встраивание даже многих копий линкеров не приведет к существенному изменению длины ДН К и образованию жизнеспособных "фальшивых" рекомбинантов.

При этом будет также практически исключе1б50б99 но образование частичных рекомбинан roe, т.е, фагов, содержащих как исходную вставку, так и вставку кДНК, так как размер

ЛЗК15(около 51,2 т.п.н.) близок к максимальному для фага Л (аколо 52,9 т.п.н,). Эффективность этого метода повышается, если предварительно очистить "плечи" ЛЯК15 электрофорезом или центрифугираванием от вставочного фрагмента, Для конструирования библиотек кДНК no EcoR 1 участку используют iLSK15 не в виде Л фага, а в виде дифазмиды, содержащей только "плечи"

ЛЯК15 и поэтому не способной к эффективной упаковке в белки фага Л из-за недостаточной длины. Для получения дифазмиды расщепляют ДНКЛ. >К15 рестриктазай EcoR

1 и проводят самолигиравание при низкой концентрации ДНК, обеспечивающей образование в основном кольцевых, а не конкатемерных форм. Этой ДНК трансформируют клетки Е. coll, не дающие вазможности проходить полный лиг»ческий цикл фагу

Л(например, штамм HB101). Очевидна. чта при конструировании библиотеки генов в этой дифазмиде все жизнеспособные фаги будут рекомбинантными. В этой форме

ЛЗК15 напоминает векторы-фазмиды

Л pMYF131 и Л pSL51.

Однако более удобно использовать

iLSK15 для конструирования библиотек кДНК с использованием Bam 1 участка. Двуцепочечную ДНК синтезируют по обычной методике, однако обрабатывают не ЕсоР 1, а Ват 1 метилазай (или dam-метилазай), Затек к ней пришивают Багп 1-линкеры и обрабатывают рестриктазой Bam 1 (или

Mbo l). ДНК iLSK15 гидролизуют одновременно рестриктазами Вагл 1 и EcoR 1, После остановки реакции прогреванием 15 мин при 65 С проводят очистку от олигануклеатидных линкеров Bam 1 — EcoR 1 оса>кдением ПЭГ-6000. В результате "плечи" содержат липкие концы Bam 1, а вставачный фрагмент — EcoR 1 и, таким образом, образование исходного фага при лигиравании возможно только за счет остаточных линкеров Bam 1 — EcoR 1, причем эта реакция более высокого порядка, чем образование рекомбинантного фага. Поэтому при получении библиотеки кДН К па этому методу опускают пассирование библистеки на Е. соИ Q 359. Ясно, что и в этом случае "фальшивые" рекомбинанты нежизнеспособны.

Использование участка Bam 1 в ЛЗК15 для получения библиотек кДНК позволяет объединить преимущества двух методик — с использованием техники частичной достройки липких концов и конструирование библиотек без применения метилаз. К кДНК

55 пришиваются линкеpt>f sаl 1 (или Х1fа l) б(.3 предварительной обработки мет»лазай. Г1аскольку рестриктаза sa11 щепит эукар»атическую flHK редко (один участок узнавания на 50 т.п.н.) и преимущественна в регуляторных областях, которые не представлены в кДНК, то последующий гидрол»з кДНК рестриктазой sal 1 f;e приведет к существенному изменению размеров кДНК. После инактивации фермента проводят в соответствующей инкубационной среде части гную достройку липких концов ДНК фрагментом

Кленова (или ревертазай) в присутствии d

CTP u d TTP. ДНК )SK15 гидрализуют рестриктазами EcoR 1 и Bam 1» затем проводят частичную достройку л»пких концов

ДНК с помощью фрагмeíòà Кленова или ревертазы в присутстви» d ЛТР и а CTP. Оба препарата смешиваю » л»г»руют, причем лигиравание в данком случае ма>кег талька в одном направлении: кДНК л»г»руется с векторной ДНК, так как самал»гиравапие» векторной, » кДНК невозможна. Исгальзуя стандартные методы, лигираванную Д lK упакавыва ат 1п Фсга а белки фага Л и полученными фагавым» частицами заражают клетки Е. col! штамм 1..E392. Сравнение этой методики с KolfcTpуираванием библиотек кДНК с»спальз(>ванием частичной дагтрайк» липких концов в других векторах („SK11, ЛВК12, )а 18/19 л9(22, )ZAP) пазваляет сделать вывод, чта . .SK15 наиболее удобен из них.

Синтез специального л»нкера позволяет обойтись без мет»л»рован»я кДН К» ее дальнейше-а г»драл»за рестр»ктазай, чта еще больше облегчает конструирование библиатекл. Особенно эта удобно пp» использовании последней схемы, поскольку отпадает необходимость: астичнай достройки липких концов.

В ЛВК 15 можно конструировать» "направленные" библиотеки кДНК с использованием двух рестриктаз (пары Есай 1 — ХЬа

I sac 1 — Bam 1 и др.

Экспрессию кДНК в ЬК15 осуществляют также, как и в других векторах с использованием lac-промотара (Лу 11, Ы К11, л.(ЛР ит.д,), однако эффективная трансляция этой мРНК может асуществлятьсч толька в строго контролируемых условиях при наличии (или введении плазмиды, несущей соответствующий ген) в клетках Е, cali мутации вар

С и/или sup G, sup В, sup V, Эта связано с тем, что через 6 триплетав после инициирующего кодона AYG встроен терминирующий кодон YAA (охра), действие ко араго еупрессируется мутациями sup С, sup G, sup

Ч, sup В. Таким образом, конструирование

1650699 библиотеки кДНК в ESK15 позволяет избежать неконтролируемой экспрессии кДНК, что приводит к повышению репрезентативности этой библиотеки. СледовательноЛК15 представляет собой в этом отношении новый тип векторов для получения библиотек структурных генов(кДНК, поскольку в зависимости от используемого штамма Е. соИ он может быть как экспрессирующим,так и не экспрессирующим и поэтому обьединяет достоинства обоих видов векторов.

При конструировании библиотеки кДНК в i5K15 можно осуществлять и неконтролируемую экспрессию, как в других экспрессирующих векторах. Для этого достаточно в линкер, присоединяемый к кДНК, ввести кодон АТ6. При этом транслируемый белок практически лишен дополнительных, чужеродных аминокислот.

Вставка кДНК вЯЯК15 может быть легко переведена в плазмидную форму. При этом используется иной принцип, чем в )ZAP.

ДН К рекомбинанта ЯЯ К12 частично гидролизуют рестриктазой за! 1 (можно применять также С!а 1) и инактивируют фермент ,трехкратным замораживанием/оттаиванием. Обе рестриктазы достаточно редко расщепляют эукариотическую ДНК, причем эти участки сосредоточены в основном в регуляторных областях, которые отсутствуют в кДНК. Затем ДНК разбавляют и самолигируют. Лигированную ДНК вводят в компетентные клетки Е, соИ, которые высевают на

1=агар с ампициллином. Выросшие колонии содержат вставку кДНК в плазмидной форме, причем плазмида либо вовсе не содер>кит нуклеотидных последовательностей фага iL (B случае sal 1), либо небольшую их часть (e случае Оа 1). Процесс перевода в плазмидную форму быстр (3 — 4 ч) и эффективен, 0,1 мкг ДНК рекомбинанта дает много сотен и тысяч колоний, При необходимости для специальных экспериментов как фаг

ЯЯК15, так и его рекомбинанты, могут быть переведены в плазмидную форму и по другому методу, В этом случае достаточно адсорбировать фаг на клетках- Е.coil, резистентных к размножению фага А(например, Н8101, j.М.109, Q 359) в течение

5 — 10 мин при 0 — 37"С и рассеять клетки на газон с ампициллином. В этом случае, однако, плазмида содержит и все нуклеотидные последовательности фага i5 присутствующие в SK12. С другой стороны, такая плазмида может быть легко переведена в форму фага А, что может быть полезно для специальных целей.

При суперинфекции клеток Е cplj co держащих плазмиду, фагом M 13 ДНК плазмиды упаковывают в белки фага в одноцепочечной форме, удобной для секвенирования по известному методу Сэнгера.

Другое преимущество DK15, связанное с тем, что это вектор замещения, заключается в том, что при конструировании в нем библиотек кДНК давление отбора направлено на клонирование более крупных вставок кДНК (2 — 8 т,п.н.), а не мелких, как во всех других векторах этого класса, являющихся векторами включения. Емкость i5K15 — до

15,4т.п.н„что достаточно для клонирования полных копий мРГК практически всех генов.

Процент рекомбинантов в библиотеке, полученной в ЯЯК15, легко определить по фенотипу, перекалывая бляшки на газон Q

359 или используя двойной газон

ЕЕ392И359. При перекалывании на газон Q

359 не рекомбинан1ные фаги не размножаются, а рекомбинантные размножаются.

Однако перекалывание довольно трудоемкий процесс, а прямой посев фагов на газон

О 359 может привести к артефактным результатам, Разработанная нами техника двойного газона позволяет преодолеть эти недостатки. В этом случае анализируемые фаги инкубируют с клетками E. coti штамм

LE392 и после добавления 0,6 -ного L-агара высевают на чашки Петри. Поверх этого газона высевают газон клеток О 359 также в

0,6 -ном 1-агаре. При этом рекомбинантные фаги дают прозрачные бляшки, а не рекомбинантные — мутные, что легко детектируется визуально, Таким образом, фаг i5K14 — единственный вектор замещения, который можно использовать для конструирования библиотек кдн К.

Основные достоинства этого вектора заключаются в возмо>кности получения библиотек как по стандартным, так и по новым методикам, в том числе, с использованием частичной достройки липких концов и без применения метилаз, возможности испольэовать для клонирования рестриктазу Ham

1, обьединяет достоинства экспрессирующих и не экспрессирующих векторов и может быть использован в зависимости от штамма Е. c0ll как в виде экспрессирующего, так и в виде не экспрессирующего, фенотипическом определении доли рекомбинантных фагов, минимальной (до

15,4 т.п.н.) емкости среди векторов этого класса; возможности биохимической и генетической селекции против исходных, не рекомбинантных фагов, наличии эффективного механизма элиминации как "фальшивых".

1650699

Составитель С.Бандрин

Техред М.Моргентал Корректор Т.Малец

Редактор Н.Гунько

Заказ 1584 Тираж 385 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 так и частичных рекомбинантов, воэможности быстрого, эффективного и контролируемого перевода в плазмидную форму, свободную от "плечей" фага, воэможности перевода в одноцепочечную форму для определения первичной структуры по методу Сэнгера, гарантированности невозможности неконтролируемого перевода вставки кДНК в фагеЯЯК15 в одноцепочечную форму, возможности специфического мечения как 5 -, так и 3 -концов вставки кДНК с использованием стандартных, коммерчески доступных препаратов затравок, Пример 2. Клонирование в ЯЗК15 фрагментов геномной ДНК человека.

3 мкг ДНК человека расщепляют рестриктазой Bam 1 в стандартных условиях и инактивируют фермент прогреванием 15 мин при 65 С, 3 мкг ДНКЯЗК9 гидролизуют рестриктазами Barn 1 и EcoR 1 и инактивируют ферменты прогреванием и очищают от олигонуклеотидных лин керов осаждением

ПЭ Г-6000. °

Оба препарата смешивают (весовое соотношение ДНК вектора и геномной ДНК

2:1) и проводят лигирование при суммарной концентрации ДНК 250 мкг/мл, 1.10 мкг лигированной ДНК упаковывают в белки фага in vitro и 1/500 полученных фаговых частиц рассевают на газон Е, coll штамм ЕЕЗ29.

При переколе 50 бляшек на газон 0 359 только одна иэ них не выросла, таким образом, рекомбинантные фаги составляют свыше 95;ь.

Из шести случайно отобранных бляшек с газона Е392 в 10 мл L-среды с LE392 были выращены фаги и выделена из них ДНК.

Электрофоретический анализ ДН К показал, что все они рекомбинанты и содержат вставку ДНК от 4 до 7 т.п.н. 0,5 мкг ДНК одного иэ них (N 1) гидролиэуют в течение 30 мин

1 ед, рестриктаэы sal 1, Фермент инактивируют трехкратным замораживанием/оттаиванием. ДНК разводят и лигируют при

5 комнатной температуре в течение 1 ч.

0,1 мкг лигированной ДНК добавляют к компетентным клеткам Е. coli штамм J.М,109, инкубируют 10 мин, при 0 С, затем 5 мин при 38 С и.после добавления 1 мл L-среды

10 еще 45 мин при 37 С. Затем 0,2 мл клеток рассевают íà L-агар с ампициллином (25 мкгlмл). Из трех колоний в 10 мл

l:cðåäû с ампициллином (50 мкгlмл) наращивают клетки и выделяют ДНК щелочным

15 лизисом. Электрофоретический анализ ДНК показывает, что плазмиды содержат ту же вставку ДНК, что и исходный фаг N 1, Формула изобретения

20 Фаговый вектор замещения ЯЗК15 для конструирования библиотек структурных генов кДН К размером 51,2 т.п.н., содержащий

ДНК фага iLSK9 размером 47,7 т.п.н.; sal 1— фрагмент плазмиды рИС4К размером

25 1,5 т.п.н.; встроенный в sal 1 участок размером 20,3 т.п.н. ДНК фагаЛЯК9; Hind !Ив фрагмент фага А размером 2,023 т.п.н. (23130 н. — 25157 н.); встроенный в Hind ill участок sal 1 — фрагмент плазмиды рИС4К;

30 места вставки чужеродного фрагмента

EcoR 1 и Bam Н 1; емкость вектора 0,215,4 т.п.н„ спектр хозяев; хозяевами могут служить штаммы E. coll, используемые при работе с ilgt 11ЯЕМВ1 3, Ж."АР, рИС 18, 35 mp 18 и др., в том числе;

LE 392 = F, hsd R 514 (г», m»). skp Е 44.

sup F 58, lac Y 1 OZ (1ас 1Z Y) 6, gat К 2, gal

Т 22, met В 1, trp R 55. 0 359 = hsd R», hsd

М», skp F, Ф30, Р 2.

Фаговый вектор замещения @ к15 для конструирования библиотек структурных генов к днк Фаговый вектор замещения @ к15 для конструирования библиотек структурных генов к днк Фаговый вектор замещения @ к15 для конструирования библиотек структурных генов к днк Фаговый вектор замещения @ к15 для конструирования библиотек структурных генов к днк Фаговый вектор замещения @ к15 для конструирования библиотек структурных генов к днк 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к генетической инженерии

Изобретение относится к микробиологии, в частности к генетике возбудителя чумы

Изобретение относится к генной инженерии, а именно к технологии получения высокопродуктивных штаммов Eserichia coli - продуцентов рекомбинантных белков человека, используемых в современной медицине в качестве тромболитических агентов

Изобретение относится к полипептидэкспрессирующим системам, требующим расщепления продукта-предшественника, к новому полипептиду, способному к восстановлению дихлориндофенола и окисленного глутатиона, к ДНК, кодирующей этот полипетид, фармкомпозициям, включающим данный полипептид, моноклональным антителам против указанного полипептида
Наверх