Способ выделения циклоспорина а

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа выделения антибиотика циклоспорина А, который может быть применен в медицине в качестве иммунодепрессанта при пересадке органов и тканей, а также при ряде других заболеваний, таких, как диабет, шистоматозы и др. Цель изобретения - упрощение способа. Предлагается более технологический способ выделения циклоспорина А, состоящий из экстракции антибиотика из высушенного мицелия петролейным эфиром, сорбции из экстракта на силикагель и очистки на силикагеле из смеси петролейного эфира с 20-30% ацетона.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа выделения антибиотика циклоспорина А, обладающего иммуносупрессивным действием, который может быть применен при пересадке органов в хирургической практике. Целью изобретения является упрощение способа. Способ включает сушку отделенного от культуральной жидкости мицелия и экстракцию антибиотика из сухого мицелия петролейным эфиром, сорбцию антибиотика из неконцентрированного экстракта на силикагель и элюцию смесью петролейного эфира и 20-30% ацетона. Обычно отделенный мицелий высушивают в сушке с псевдоожиженным слоем при 50^оС или в вакуум-сушильном шкафу при 50^оС и двухкратно экстрагируют антибиотик петролейным эфиром с температурой кипения 70-100^оС (трехкратным и двухкратным объемами к массе сухого мицелия), проводят сорбцию антибиотика на силикагель в колоночных условиях и элюцию указанной смесью растворителей. Элюат собирают фракционно. Фракции анализируют с помощью ТСХ на пластинках "Силуфол" (ЧССР, Кавальер) в системе растворителей бензол-ацетон (2:1) при двухкратном прогоне, антибиотик обнаруживают проявлением йодом и закреплением окраски 0,1%-ным водным раствором перманганата. Фракции, содержащие циклоспорин А, объединяют, растворитель удаляют в вакууме и антибиотик осаждают гексаном. Фракции, содержащие кроме циклоспорина А примеси в виде компонентов циклоспоринового комплекса, подвергают повторной хроматографической очистке в тех же условия. Выход составляет 50-60% от содержания антибиотика в мицелии. Существенным является экстракция антибиотика из сухого мицелия петролейным эфиром, что устраняет возможность образования эмульсии, осложняющей процесс выделения, обеспечивает наиболее избирательную экстракцию целевого продукта без окрашенных примесей и сорбцию антибиотика из неконцентрированного экстракта, упрощает процесс хроматографической очистки и сокращает набор растворителей и сорбентов, используемых для очистки антибиотика. Использование петролейного эфира для экстракции циклоспорина из мицелия продуцента является особенностью описываемого способа, поскольку этот антибиотик не растворяется в петролейном эфире, а экстракцию его этим растворителем осуществляют за счет жирных веществ, содержащихся в мицелии. В отличие от других экстрагентов петролейный эфир не экстрагирует окрашенных веществ, а жирные примеси легко удаляются при сорбции антибиотика из неконцентрированного петролейно-эфирного экстракта на силикагель, при этой операции антибиотик сорбируется на силикагель в верхней части колонны, а примеси проходят в маточный раствор. Пожароопасность петролейного эфира с температурой кипения 70-100^оС не отличается от такого ацетона, широко применяемого в производстве (температура вспышки 20^оС), а предельная допустимая концентрация высока (ПДК 300 мг/см³ воздуха IV кл. опасности). 20-30% -ная добавка ацетона к петролейному эфиру в элюенте обеспечивает наиболее рациональную элюцию антибиотика с силикагеля. Количество ацетона более 30% в элюенте приводит к снижению качества препарат, снижение ацетона ниже 20% приводит к более растянутой элюции, т.е. к большим затратам элюента. Способ обеспечивает 50-60% -ный выход циклоспорина А, отвечающего ТУ, содержащего менее 2,5% родственных примесей других компонентов циклоспоринового комплекса. П р и м е р 1. От 1 л культуральной жидкости, содержащей 800 мкг/мл циклоспорина А (ВЭЖХ), отделяют мицелии центрифугированием или фильтрованием и высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 50^оС в течение 3 ч. Получают 150 г сухого мицелия. Сухой мицелий заливают 3-кратным объемом (к массе мицелия) петролейного эфира с температурой кипения 70-100^оС (450 мл) и перемешивают в течение 3 ч, после чего оставляют на ночь при комнатной температуре. Затем взвесь мицелия в экстракте вносят в колонну и экстракт пропускают через столб мицелия со скоростью 2 мл/мин, после чего мицелий еще промывают двумя объемами (300 мл) экстрагента петролейного эфира. Экстракт и промывку объединяют и пропускают через силикагель водную кремневую кислоту, загруженную в колонну (Н= 30 см, D=4 см) из петролейного эфира. Комплекс циклоспоринов A-D сорбируется на кремневую кислоту, а жирные примеси вымываются с вытекающим раствором. Для полного удаления неактивных примесей колонну промывают двумя объемами (к объему сорбента) петролейного эфира. Отгон петролейного эфира из маточного раствора используется повторно для экстракции следующих порций мицелия. Элюцию антибиотика осуществляют смесью петролейного эфира с 20% ацетона со скоростью 10 мл/ч. Анализ фракций проводят методом ТСХ на пластинках "Силуфол" размером 20 х 20 см (ЧССР, Кавальер) в системе растворителей бензол-ацетон (2:1) при двухкратном прогоне. Одновременно с исследуемыми фракциями наносят в качестве свидетелей смесь циклоспоринов и циклоспорин А в количестве 5 и 10 мкг. Антибиотики обнаруживают выдерживанием пластинок в парах йода в течение 10 мин и закреплением образовавшейся окраски погружением пластинок в 0,001%-ный раствор перманганата калия. Циклоспорины А-Д обнаруживаются в виде фиолетовых пятен. Циклоспорин А идентифицируют по совпадению R_f с R_f циклоспорина А-стандарта. Фракции, содержащие циклоспорин А по совпадению хроматографической подвижности с таковой циклоспорина А стандарта, объединяют, концентрируют в вакууме и осаждают 20-кратным объемом гексана. Образовавшийся белый осадок отфильтровывают на стеклянном фильтре, промывают гексаном и высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 50^оС в течение 1 ч. Фракции, содержащие кроме циклоспорина А примеси в виде других компонентов циклоспоринового комплекса, объединяют, концентрируют упариванием в вакууме и подвергают повторной хроматографической очистке в тех же условиях. Осажденные гексаном препараты объединяют. Выход циклоспорина А составляет 50% чистота 98,3% по ВЭЖХ. Согласно ТУ на препарат содержание близкородственных примесей менее 2,5% П р и м е р 2. От 1 л культуральной жидкости, содержащей 800 мкг/мл циклоспорина А, отделяют и высушивают мицелий и антибиотик экстрагируют, как в примере 1. Антибиотик сорбируют из экстракта на кремневую кислоту, как описано выше, а элюцию проводит смесью петролейного эфира с 25% ацетона. Концентрирование элюата, осаждение и рехроматографию смешанных фракций проводя, как в примере 1. Получают 0,43 г циклоспорина А. Выход составляет 53,8% чистота 98,9% по ВЭЖХ. П р и м е р 3. От 1 л культуральной жидкости, содержащей 750 мкг/мл циклоспорина А, отделяют и высушивают мицелий и антибиотик экстрагируют из мицелия, как в примере 1. Антибиотик сорбируют из экстракта на кремневую кислоту, а элюцию циклоспорина осуществляют смесью петролейного эфира с 30% ацетона. Концентрирование элюата, осаждение и рехроматографию смешанных фракций проводят, как в примере 1. Получают 0,41 циклоспорина А. Выход 55% чистота 99,5% по ВЭЖХ. П р и м е р 4. От 1 л культуральной жидкости, содержащей 700 мкг/мл циклоспорина А, отделяют и высушивают мицелий и антибиотик экстрагируют, как в примере 1. Антибиотик сорбируют из экстракта на силперл (ЧССР, Кавальер) в условиях, описанных в примере 1, элюцию антибиотика, концентрирование элюата, осаждение и рехроматографию смешанных фракций осуществляют, как в примере 1. Получают 0,35 г циклоспорина А. Выход 50% чистота 99,8 по ВЭЖХ. П р и м е р 5. От 1 л культуральной жидкости, содержащей 800 мкг/мл циклоспорина А, отделяют и высушивают мицелий и антибиотик экстрагируют, как в примере 1. Антибиотик сорбируют их экстракта на кизильгель 60 (ФРГ, Мерк, D= 0,043-0,053 мкм) в условиях, описанных в примере 1, элюцию антибиотика, концентрирование элюата и рехромаграфию смешенных фракций проводят, как в примере 1. Получают 0,40 г циклоспорина А. Выход 60% чистота 99,7% по ВЭЖХ. П р и м е р 6. От 140 л культуральной жидкости, содержащей 750 мкг/мл циклоспорина А, отделяют на рамном фильтр-прессе мицелий и высушивают в сушке с псевдоожиженным слоем СП-30. Полученные 7,7 кг сухого мицелия экстрагируют и антибиотик сорбируют на кремневую кислоту, как в примере 1. Концентрирование элюата, осаждение и рехроматографию смешанных фракций проводят, как в примере 1. Получают 52,5 г циклоспорина А. Выход 50% чистота 98,1% по ВЭЖХ.

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦИКЛОСПОРИНА А, включающий экстракцию органическим растворителем и хроматографическую очистку, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, экстракции подвергают высушенный мицелий, в качестве экстрагента используют петролейный эфир, а полученный экстракт хроматографируют на силикагеле и элюируют смесью петролейного эфира с 20-30% ацетона.