Способ получения аффинного сорбента для фракционирования нуклеиновых кислот

 

Изобретение относится к сорбентам для аффинной хроматографии и позволяет повысить селективность разделения нуклеиновых кислот. Микрогранулированную Изобретение относится к сорбентам для аффинной хроматографии и может быть использовано для фракционирования ДНК и РНК. Цель изобретения - повышение селективности сорбента к нуклеиновым кислотам . П р и м е р 1. 100 см3 микрогранулированной целлюлозы смешивают с 100 см дистиллированной воды, добавляют 10 см 40%-ного едкого натра и 10 см3эпихлоргидрина. Соотношения реагентов, мас.%: целлюлоза 45; едкий натр 1,8; эпихлоргидрин 4,5. Суспензию перемешивают 2 ч при 40°С, целлюлозу (100 см смешивают с 100 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл 40%-ного едкого натра и эпихлоргидрин в количестве 4,5-15% от массы реакционной смеси. Суспензию перемешивают 2 ч при 40°С, промывают водой и суспендируют с водным раствором диэминодекана (0,06- 0,35% от массы смеси). Перемешивают 20 ч при 35°С и промывают водой и диметилформамидом, добавляют 0,8-1,9 мас.% азида М-(2-нитро-3-окси-4-хлорбензоил)-5-аминокапроновой кислоты в этилацетате с триэтиламином и перемешивают при 4°С 18ч. Промывают диметилформамидом, метанолом и добавляют 7-12 мас.% дитионита натрия, перемешивают 3 ч при 20°С. Промывают водой, 50%-ной СНзСООН и этиловым спиртом . Добавляют пара-хинон (1,3-3,4 мас.%) и гидрохлорид ЩЗ-диметиламинопропил}- 2-амино-3-окси-4-метилбензамид (0,27-0,51 мас.%) в этиловом спирте. Перемешивают 24 ч при 22°С и промывают спиртом и водой. Сорбент используют для разделения нуклеиновых кислот. 1 табл. а затем эпоксицеллюлозу отмывают дистиллированной водой (3000 см3) и суспендируют в водном растворе 150 мг диаминодекана (концентрация диаминодекана 0,06%) в течение 20 ч при 35°С. После этого аминодецил-целлюлозу отмывают дистиллированной водой (4000 см ) и диметилформамидом (500 . К 10 см аминодецил-целлюлозы добавляют 10см3диметилформамида, 0,5см триэтиламинна и раствор 0,3 г азида М-(2-нитро-3-окси-4- хлорбензоил)-5-аминокапроновой кислоты в 20 см3 этилацетата. Содержание М-(2-нитро-3-окси-4-хлорбен (Л с о ел ел ел ы Јь

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4726470/26 (22) 20,06.89 (46) 15.06.91. Бюл. М 22 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов и Ленинградский технологический институт им.

Ленсовета (72) Ю.П. еров, С.В.Мартюхин, О.Ф,Гинзбург, Е.Н,Глибин и 3,И,Коршунова (53) 543.544 (088.8) (56) Митрофанов Е.В.. Зеров Ю.П,Хроматографическое выделение плазмидной ДНК.

В кн.: Ill Всесоюзный симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии. Рига, 1984, с. 156 — 157.

Bunemann H„Muller W, — Nucleic Acids

Res. 1978, v 5, р.1059 — 1074. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АФФИННОГО

СОР6ЕНТА ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ

НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ (57) Изобретение относится к сорбентам для аффинной хроматографии и позволяет повысить селективность разделения нуклеиновых кислот. Микрогранулированную

Изобретение относится к сорбентам для аффинной хроматографии и может быть использовано для фракционирования ДНК и РНК.

Цель изобретения —. повышение селективности сорбента к нуклеиновым кислотам.

Пример 1. 100 см микрогранулироз ванной целлюлозы смешивают с 100 см диз стиллированной воды, добавляют 10 см з

40 "ного едкого натра и 10 см эпихлоргидрина. Соотношения реагентов, мас.%: целIll0llo33 45; едкий натр 1,8; эпихлоргидрин

4,5. Суспензию перемешивают 2 ч при 40 С, „„5U „„1655534 А1 (51)s В 01 0 15/08, С 12 N 11/10

2 целлюлозу (100 см . смешивают с 100 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл

407,-ного едкого натра и эпихлоргидрин в количестве 4,5 — 157ь от массы реакционной смеси, Суспензию перемешивают 2 ч при

400С, промывают водой и суспендируют с водным раствором диаминодекана (0,060,35 от массы смеси), Перемешивают 20 ч при 35 С и промывают водой и диметилформамидом, добавляют 0,8-1,9 мас, азида

N-(2-нитро-3-окси-4-хлорбензоил)-5-аминокапроновой кислоты в этилацетате с тризтиламином и перемешивают при 4 С 18 ч. Промывают диметилформамидом, метанолом и Я добавляют 7 — 12 мас. дитионита натрия, перемешивают 3 ч при 200С. Промывают водой, 50 -ной СНзСООН и этиловым спиртом. Добавляют пара-хинон (1,3 —,3,4 мас.g) и гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)2-амино-3-окси-4-метилбензамид (0,27 — 0 51 мас. ) в этиловом спирте. Перемешивают

24 ч при 22 С и промывают спиртом и водой.

Сорбент используют для разделения нукле- О иновых кислот. 1 табл. (л а затем эпоксицеллюлозу отмывают дистиллированной водой (3000 см ) и суспендируют в водном растворе I50 мг диаминодекана (концентрация диаминодекана 0,067) в течение 20 ч при 35 С, После этого аминодецил-целлюлозу отмывают дистиллированной водой (4000 см ) з . и диметилформамидом (500 смз).

К 10 см аминодецил-целлюлозы добавз ляют 10 см диметилформамида. 0,5 см триз этиламинна и раствор 0,3 г азида

N-(2-нитро-3-окси-4- хлорбензоил)-5-аминокапроновой кислоты в 20 см этилацетата.

Содержание N-(2-нитро-3-окси-4-хлорбен1655534 зоил)-5-аминокапроновой кислоты в реакционной смеси 0,8 мас. . Суспензию перемешивают при температуре 4 С в течение

18 ч, а затем промывают диметилформамидом (1000 смз) полученный полупродукт.

С целью восстановления нитрогрупп в нем промывают полупродукт метанолом (50 смз), добавляют 100 см 10 -ного водного раствора дитионита Натрия и перемешивают 3 ч при 20 С. Содержание дитионита натрия 7 . Затем сорбент промывают водой (500 смз), 50 -ной уксусной кислотой (200 см ), дистиллированной водой (300 см, з) этиловым спиртом (200 cM ).

Формирование иммобилизованных производных актиноцина ведут непосредственно на целлюлозе путем пеоемешивания суспензии сорбента в 30 см этилового спирта, содержащего 0,1 г гидрохлорида N(3-диметиламиноп ропил)-2-амино-3-окси-4метилбензамида и 0,5 г парахинона втечение

24 ч при 22 С. Содержание гидрохлорида N(3-диметиламинопропил)-2-амина-3-окси-4метилбензамида и пара-хинона соответственно равно 0,27 и 1,3%.

Полученный сорбент отмывают этиловым спиртом 300 см ) и дистиллированной водой (500 см ).

В ходе получения сорбента используют азид N-(2-нитро-3-окси-4-хлорбензоил)-5аминокапроновой кислоты, который получают по следующей методике.

Синтез азида N-(2-нитро-3-окси-4-хлорбензоил}-5-аминокапроновой кислоты. 0,5 г

N-(5-это кос и ка рбо н ил пе нтил)-2-нитро-3-о кси-4-хлорбензамида растворяют в 15 см з метилового спирта, добавляют 3 см гидраз зин-гидрата, упаривают в два приема и добавляют еще 3 сМ гидразин-гидрата, Выдерживают 12 ч при 18 — 20 С, защищая от прямого света, и упаривают в вакууме досуха, Остаток от упаривания растворяют в 7 см воды, а затем подкисляют уксусной кислотой до рН 6,0 и охлаждают до 5 — 7 С, После выдерживания в течение 10 ч отфильтровывают образовавшийся осадок, промывают его водой и сушат, Выход хроматографически однородного в системах бутанол-2:3 -ный аммиак (5:2) на пластинках

Силуфол UV-254 N-(5-гидразокарбонил)-2нитро-3-окси-4-хлорбензамида с т.пл. 180—

182 С, 0,46 г (77 ), т.пл, 183,5 — 185, 0 С (после кристаллизации из метанола). Найдено, ; N 15,80; 16,17. CigHii CINqOg. Вычислено, : N 16,25. К раствору 0,69 r (2 ммоль)

Гк-тб-гидрааокарбониа-пантин .2-натри:З-о. кси-4-хлорбензамида в 40 см смеси уксусной и 15 соляной кислот при 0-5 С и перемешивании добавляют раствор 0,27 r (4 ммоль) нитрита натрия в 1 см воды. Пере10

15 мешивание ведут 15 мин, добавляют 40 см з воды и экстрагируют этилацетатом двумя порциями по 20 смз Экстракт ввиду нестабильности продукта немедленно используют для дериватизации аминодецил-целлюлозы

Пример 2 — 5, Проводили по методике примера 1. Соотношения использованных реагентов представлены в таблице.

Пример 6. Хроматография ДНК, На колонку размером 10 х 30 мм, содержащую

4 см аффинного сорбента, полученного в соответствии с примером 1, наносят 0,2 см раствора ДНК из молоки лосося (фирма

SIgma, CLLIA) в 0,1 M натрий-фосфатном буфере рН 7,8 (содержание нативной ДНК 7,7

О,Е. или 380 мкг ДНК), Несвязавшийся материал смывают тем >ке буфером (50 см ).

ДНК элюируют буферным раствором, содержащим. 0,5 додецилсульфата натрия, 20 0,5 лаурилсаркозината натрия (150 см ).

Собирают фракции объемом по 4 cM . Измеряют УФ вЂ” поглощение каждой фракции при

260 нм. фракции, содержащее УФ-поглощающий материал, объединяют и осаждают

25 добавлением 2,5 объемом этанола на холоде, Осадок отделяют центрифугированием, растворяют и снимают спектр поглощения в области 220 — 310 нм.

Промывные фракции содержат неболь30 шое количество УФ-поглощающего материала, осаждаемого этанолом. Спектр поглощения осадка характерен для полисахаридов и представляет собой плавно спадающую от 220 к 310 нм кривую. Элюат

35 содержит чистую ДНК с характерным спектром ((макс = 258 нм, Е260/,2зд = 2,5;

E260/Е28о = 2,2). Выход ДНК составил-7,5

О.Е. или 98,7 /о, Пример 7. Хроматография ДНК. На

40 колонку 10 х 30 мм, содержащую 4,0 см сорбента, полученного в соответствии с примером 2, наносят 7.6 О.Е. нативной ДН К из молоки лосося. Нанесение ДН К, промывку, регистрацию УФ-поглощения, сбор и

45 анализ фракций выполняют в условиях примера 6. Элюцию ДНК выполняют линейным градиентом 0,0 — 0,5% додецилсульфата натрия в 0,1 M натрийфосфатном буфере рН

7,8. На хроматограмме отчетливо выделяют50 ся две фракции ДНК. Фракция I (элюируется от 30 до 40 градиента, содержит 6,2 О.E

ДНК или 81 / нанесенного материала) соответствует основной массе хромосомной

ДНК из молоки лосося, Фракция il (элюиру55 ется от 50 до 70% градиента, содержит 1,3

О,Е. ДНК или 17 ) соответствует ГЦ-богатой сателлитной ДНК.

П р:и м е р 8, Хроматография ДНК. В условиях примера 7 проводят разделение

1655534

50 препарата ДН К (4,0 О, Е. zoo) из молоки лосося, денатури рован ной нагреванием. В ыход ДН К в элюенте (додецилсульфат натрия и саркозилат натрия) составляет 3,8 О.Е, или 95%.

Пример 9, Хроматография РНК, На колонку 10 х 30 мм, содержащую 4,0 см сорбента, полученного в соответствии с примером 5, наносят 2,6 О.Е, раствора дрожжевой PHK (Fluka. Швейцария). Нанесение РНК, промывку, регистрацию УФ-поглощения, сбор и анализ фракций выполняю в условиях примера 6. Элюцию

РНК выполняютлинейным градиентом 0-1 M перхлората натрия в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 7,8. РНК элюируется в 30—

40% градиента (0,3 — 0,4 М перхлората натрия), Выход РНК составляет 2,4 О.Е, или

92%

Пример 10, Хроматография ДНК. В условиях примера 9 проводят разделение препарата нативной ДНК (8,0 О.Е.) из Мопоки лосося. Ни в одной из фракций элюата не обнаруживается заметных количеств ДНК.

В то же время ДНК количественно элюируется (выход 96%) в условиях регенерации колонки; при элюции 0,5% додецилсульфата натрия; 0,5% саркозилата натрия в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 7,8.

Пример 11. Хроматография ДНК и

РНК, На колонку 10 х 30 мм, содержащую

4,0 см сорбента, полученного в соответствии с примером 1, наносят искусственную смесь P HК (4,0 О,Е.) и ДН К (7,0 О,Е.). Нанесение пробы, промывку, регистрацию УФпоглощения, сбор и анализ фракций выполняют в условиях примера 6. Элюцию

РНК и ДНК ведут ступенчатым градиентом, На первой ступени — 0,5 М перхлората натрия в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН

7,8 — количественно элюируется РГК (выход

95%), на второй ступени — 0,5% додецилсульфата натрия, 0.5% саркозилата натрия в 0,1 M натрий-фосфатном буфере рН 7,8 — количественно элюируется ДНК (выход

97 / )

Пример 12. Хроматография ДНК. В условиях примера 6 проводят разделение препарата нативной ДНК(8,0 О.Е.) из молоки лосося на сорбенте, полученном в соответствии с примером 3. Ни в одной из фракций элюата не обнаружено заметных количеств ДНК.. Регенерация колонки при элюции 0,5% саркозилатом натрия, 0,5% додецилсульфатом натрия в 0,1 M натрийфосфатном буфере рН 7,8 не позволяет десорбировать связавшуюся ДНК.

Пример 13, Хроматография ДНК. В условиях примера 6 проводят разделение препарата нативной ДНК (8,0 О,Е.) из молоки лосося на сорбенте, полученном в соответствии с примером 4. ДНК количественно (95%, или 7,6 О.Е.) обнаруживается в проскоке с уравновешивающим буфером, То есть отсутствует связывание с сорбентом.

B условиях примеров 6 — 11 проводят 20 циклов фракционирования препаратов нуклеиновых кислот на колонке 10 х 30 мм с сорбентом, полученным по примерам 1, 2, 5, После каждого цикла колонку регенерируют, промывая последовательно 0,5% додецилсульфатом натрия, 0,5% саркозилатом натрия (20 см, а затем уравновешивали 0,1

М натрий-фосфатным буферным раствором рН 7,8.

Сферическая форма микрогранулированной целлюлозы позволяет провести 20 циклов фракционирования без ухудшения гидродинамических свойств. Использованный в качестве лиганда аналог актиноцина позволяет селективно сорбировать нуклеиновые кислоты и отделять ДНК от РНК без уменьшения емкости сорбента. что не достигается на сорбенте, полученном в соответствии с прототипом.

Формула изобретения

Способ получения аффинного сорбента для фракционирования нуклеиновых кислот, включающий иммобилизацию.комплексона ДНК на поверхности полимерного носителя, отличающийся тем, что, с целью повышения селективности сорбента к нуклеиновым кислотам, в качестве полимерного носителя используют микрогранулированную целлюлозу, которую последовательно обрабатывают эпихлоргидрином в концентрации 4,5-15% от массы реакционной смеси, диаминодеканом

0,06 — 0,035 мас.%, N-(5-азидокарбонилпентил)-2-н итра-3-о кси-4-хлорбе нзам идам 0,8. 1,9 мас.%, дитионитом натрия 7-12 мас.% и пара-хиноном 1,3 — 3,4 мас. t, в присутствии

N-(3-диметиламинопропил)-2-амино-3-окси-4- метилбензамида гидрохлорида в концентрации 0,27-0,51 % от массы реакционной смеси.

1655534

Составитель Т.Чиликина

Редактор Н.Сильнягина Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор З.Лончакова

Заказ 2302 Тираж 454 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и от«рытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101