Способ определения антикоагулянта протеина с в плазме крови животных

 

Изобретение относится к способам определения биологически активных препаратов и может быть применено в физиологии, биохимии, гематологии, токсикологии, медицинской промышленности. Цель изобретения - повышение экономичности и надежности способа определения протеина С в плазме крови животных. Согласно предлагаемому способу протеин С в плазме крови животных определяют путем смешения пробы , содержащей протеин С, и активатора с последующей регистрацией удлинения времени свертывания в тесте АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время). Отличительными чертами способа являются получение протромбинового комплекса из исследуемой плазмы, полное его растворение в растворе цитрата натрия, использование активатора из яда щитомордника вида Agklstrodon halys и применение обычной человеческой плазмы в качестве тестирующей в тесте АЧТВ.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)э С 12 0 1/37

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

О

Q С

4h

О

О (21) 4658385/ l3 (22) 02.03.89 (46) 30.06.91; Бюл. ЬЬ 24 (71) МГУ им. М.В. Ломоносова (72)С.M. Струкова, А.Е. Коган, А.А. . Тара и А.А. Аавиксаар (53) 612.115 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N. 1565889, кл. С 12 N 9/50, 1989. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИКОАГУЛЯНТА ПРОТЕИНА С В ПЛАЗМЕ КРОВИ

ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к способам определения биологически активных препаратов и может быть применено в физиологии, биохимии, гематологии, токсикологии, медицинской промышленности. Цель изобреИзобретение относится к способам определй ия биологически активных препаратов и может быть применено в физиологии, биохимии, гематологии, токсикологии, ме, дицинской промышленности.

Цель изобретения — повышение экономичности и надежности способа определе,ния антикоагулянта протеина С в плазме крови животных.

Для этого берут осадок протромбинового комплекса, полученный иэ плазмы крови животных, растворяют в 1/3-1/4 объема от количества исходной плазмы 0,19-0,22 М раствора цитрата натрия, добавляют 1/101/17 объема (140-160 мкгlмл) активатора из яда щитомордника Agklstrodon halys и инкубируют 7-15 мин при 36-38"С. Смесь разбавляют в 14-21 раэ физиологическим Ж 1659486 А1 тения — повышение экономичности и надежности способа определения протеина С в плазме крови животных. Согласно предлагаемому способу протеин С в плазме крови животных определяют путем смешения пробы, содержащей протеин С, и активатора с последующей регистрацией удлинения времени свертывания в тесте АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время). Отличительными чертами способа являются получение протромбинового комплекса из исследуемой плазмы, полное его растворение в растворе цитрата натрия, использование активатора из яда щитомордника вида Agklstrodon halys и применение обычной человеческой плазмы в качестве тестирующей в тесте АЧТВ. раствором и смешивают ее с равным обьемом тестирующей (обычной человеческой плазмы, добавляют равное количество каолин-кефалинового реактива, инкубируют 12 мин и определяют время свертывания тестирующей плазмы. Количество протеина

С в исходном образце крови определяют по калибровочной кривой. Время свертывания тестирующей плазмы в полулогарифмиче- -. ских координатах прямо пропорционально содержанию протеина С в плазме крови.

Способ осуществляют следующим образом.

Цитратную веноэную кровь нормальных крыс с массой тела 250-280 г, взятую из яремной вены, центрифугируют . при 3000 об/мин в течение 30 мин. Плазму декантируют и используют для определения

1659486 протеина С. К 0,2-0,3 мл плазмы добавляют

20 мкл 1 М рраассттввоорра а хкллооррииссттоогго о ббаарриияя, перемешивают в течение 10 мин и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Осадок растворяют в 0,06 — 0,08 мл 0,19—

0,22 M раствора цитрата натрия, добавляют

15 — 25 мкл (140-160 мкг/мл) активатора из яда щитомордника Agkistrodon halys и инкубируют 7 — 15 мин при 36 — 38 С. К смеси добавляют 1,0 — 1,5 мл физиологического раствора, затем аликвоту ее смешивают с равным количеством тестирующей плазмы, добавляют равное количество каолин-кефалинового реактива, инкубируют 1-2 мин и определяют время свертывания тестирующей плазмы, Пример 1. Берут осадок протромбинового комплекса, полученный из 0,2 мл плазмы крови крысы, растворяют в 0.06мл

0,19 M раствора цитрата натрия, добавляют

15 мкл (140 мкг/мл) активатора из яда щитомордника Agkistrodon halys и инкубируют 7 мин при 36 С. К смеси добавляют 1,0 мл физиологического раствора, затем аликвоту ее смешивают с равным количеством тестирующей плазмы, добавляют равное количество каолин-кефалинового реактива, инкубируют 1 мин и определяют время свертывания тестирующей плазмы. Получают

96% протеина С, содержащегося в плазме крови.

Пример 2. Берут осадок протромбинового комплекса, полученный из 0,3 мл плазмы крови крысы, растворяют в 0,08 мл

0,22 M раствора цитрата натрия, добавляют

25 мкл (160 мкг/мл) активатора из яда щитомордника Agklstrodon haiys и инкубируют

15 мин при 38 С. К смеси добавляют 1,5 мл физиологического раствора, затем добавляют равное количество каолин-кефалинового реактива, инкубируют 2 мин и определяют время свертывания тестирующей плазмы, Получают 97% протеина С, содержащегося в плазме крови, Пример 3. Берут осадок протромбинового комплекса, полученного из 0,25 мл плазмы крови крысы, растворяют в 0,07 мл

0,2 M раствора цитрата натрия, добавляют

20 мкл (150 мкг/мл) активатора из яда щитомордника Agkistrodon halys и инкубируют

10 мин при 37 С. К смеси добавляют 1,2 мл физиологического раствора, затем аликвоту ее смешивают с равным количеством тестирующей плазмы, добавляют равное количество каолин-кефалинового реактива, инкубируют 1 мин и определяют время свертывания тестирующей плазмы. Получают

100% пnрpоoт tе .и нHа 8 СC, содержащегося в плазме крови.

10 0,23 M раствора цитрата натрия, добавляют

30 мкл (170 мкгl мл) активатора иэ яда щито20

20. мкл (150 мкг/мл) активатора из яда щитомордника Agkistrolon halys и инкубируют 10

30 мин при 37 С. К смеси добавляют 1,2 мл

Пример 4. Берут осадок протромбинового комплекса, полученный из 0,25 мл плазмы крови крысы, добавляют 0,05 мл

0,18 M раствора цитрата натрия. Осадок не растворяется, а следовательно, протеин С определить невозможно.

Пример 5. Берут осадок протромбинового комплекса, полученный из 0,25 мл плазмы крови крысы, растворяют в 0,09 мл мордника Agklstrodon halys и инкубируют

20 мин при 39 С. К смеси добавляют 2,0 мл физиологического раствора, затем аликвоту ее смешивают с равным количеством тестирующей плазмы, добавляют равное количество каолин-кефалинового реактива, инкубируют 3 мин и определяют время свертывания тестирующей плазмы, Получают 80% протеина С, содержащегося в плазме крови, что указывает невозможность определения 20% про вина С, содержащегося в плазме.

Пример 6. Берут осадок протромбинового комплекса, полученный из 0,25 мл плазмы крови быка, растворяют в 0,07 мл

0,2 M раствора цитрата натрия, добавляют физиологического раствора, затем аликвоту ее смешивают с равным количеством тестирующей плазмы, добавляют равное количество каолин-кефалинового реактива, инкубируют 1 мин и определяют время свертывания тестирующей плазмы, Получают 100% протеина С, содержащегося в плазме крови, Пример 7. Берут осадок протромбинового комплекса, полученный из 0,25 мл плазмы крови крысы, растворяют в 0,07 мл

0,2 M раствора цитрата натрия, добавляют

20 мкл (150 мкг/мл) активатора из яда щитомордника Agkistrodon halys и инкубируют

5 мин при 35 С, К смеси добавляют 1,2 мл физиологического раствора, затем аликвоту ее смешивают с равным количеством тестирующей плазмы, добавляют равное количество каолин-кефалинового реактива, инкубируют 45 с и определяют время свертывания тестирующей плазмы. Получают

78% протеоина С, содержащегося в плазме крови, что указывает на невозможность определения 22% протеина С, содержащегося в плазме.

Пример 8. Берут осадок протромбинового комплекса, полученный иэ 0,25 мл плазмы крови крысы, растворяют в 0,07 мл

0,2 M раствора цитрата натрия, добавляют

20 мкл (150 мкг/мл) активатора из яда щито1659486 лиза (пример 8). Разбавление смеси более, чем указано в способе, ведет к разбавлению образовавшегося активирован ного протеина С, вследствие чего результат анализа занижается (пример 5).

Формула изобретения

Составитель M. Малярова

Техред М. Моргентал Корректор И.Муска

Редактор M. Петрова

Заказ 1821 Тираж 372 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101 мордника Agklstrodon halys и инкубируют

10 мин при 37 С. К смеси добавляют 0,8 мл физиологического раствора, затем аликвоту ее смешивают с равным количеством тестирующей плазмы, добавляют равное количе- 5 ство каолин-кефалинового реактива, инкубируют 1 мин и определяют время свертывания тестирующей плазмы, Получают 112 протеина С, содержащего".я в плазме крови, что свидетельствует о завы- 10 шении результата анализа.

Снижение времени инкубации раствора протромбинового комплекса активатором менее 7 мин приводит к неполной. активации протеина С, а удлинениеболее 15

15 мин — к снижению активности образовавшегося активированного протеина С, так как этот белок термолабилен, Аналогично влияет снижение или повышение температуры инкубации. Во всех случаях результат 20 анализа протеина С оказывается заниженным (примеры 5 и 7). Разбавление активационной смеси физиологическим раствором менее, чем указано в способе, ведет к сохранению в растворе высокой ионной силы, что 25 тормозит свертывание тестирующей плазмы и приводит к завышению результата анаСпособ определения антикоагулянта протеина С в плазме крови животных путем смешения с активатором из яда щитомордника, инкубации и определения времени свертывания тестирующей плазмы крови человека, о тл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью повышения воспроизводимости способа. из плазмы крови животных предварительно выделяют протромбиновый комплекс, который растворяют в 0,190,22 М растворе цитрата натрия в.количестве 1/3-1/4 объема от исходной плазмы, смешивают его с активатором иэ яда щитомордника вида Agkistrodon halys, инкуба-. цию проводят в течение 7-15 мин, затем смесь разбавляют в 14 — 21 раэ физиологическим раствором, а в качестве тестирующей плазмы используют нативную плазму крови человека.