Способ получения иммобилизованных пекарских дрожжей sасснаrомyсеs cereviciae

 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения биокатализаторов с иммобилизованными клетками путем включения их в гель. Целью изобретения является удешевление способа при сохранении высокой ферментной активности целевого продукта. Способ заключается в ионном сшивании водного раствора карбоксиметилцеллюлозы с суспендированным иммобилизуемым материалом (пекарскими дрожжами SACCHAROMYCES CEREOISIAE) многовалентными катионами металлов, применяемых в виде отдельно приготовленного водного раствора соли. В способе используют натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (NA - КМЦ) и сшивают катионами алюминия или трехвалентного железа, а процесс выполняют при обычных температурах. Соотношение сухих масс иммобилизуемого материала и NA - КМЦ составляет от 0,3 до 4,5. Используют NA - КМЦ со степенью замещения от 0,5 до 1,2 и степенью полимеризации от 300 до 3000. Способ позволяет удешевить процесс иммобилизации при сохранении высокой ферментативной активности целевого продукта. 1 табл.

(1) С 12 N !1/00, 11/12

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ и *ВТОРСНОММ СВИДЕТВЪСТВУ (Q ! (л . Сд

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

llO H306PETEHNRM И 07HPbrrHAM

ПРИ fHHT СССР (21) 4681869/13 (22) 07.02.89 (46) 30.07.91. Бюл. У 28 (71) Таллиннский политехнический институт и Институт микробиологии им. Августа Кирхенштейна (72) А.И.Кестнер, Г.Г.Калбин, N.Е.Бекер, Я.Э.Блумберго, А,Ф.Данилевич, М.Г.Лайвениекс, Я.Я,Лаукевиц и Ю.Е.Посметный (53) 577. 15 (088.8)

{56) Scott Ch.0. Immobilized cells. а review of recent literature.—

Enzyme Microb. Technol., 1987, v.9, В 2, р. 66 "73.

Иммобилизованные клетки и фермен ты. Методы/ Под ред. Дж.Вудворда, М.:

И р, 1988, с. 155 157. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАН"

ИЫХ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES.

CRREVISIAR (57) Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения биокатализаторов с иммобили зованными клетками путем включения их

Изобретение относится к биотехно логик, конкретно к способам получе ния биокатализаторов с иммобилизо ванными клетками путем включения их. в гель, и может быть использовано для инвертирования сахарозы.

Цель изобретения удешевление способа xrpH сохранении высокой фер ментативиой активности целевого про дукта °

2 в гель. Целью изобретения является удешевление способа при сохранении высокой ферментной активности целе= вого продукта. Способ заключается в ионном сшивании водного раствора карбоксиметилцеллюлозы с суспендиро ванным иммобилизуемым материалом (пекарскими дрожжами Saccharomyces

cerevisiae) многовалентными катиона ми металлов, применяемых в виде от дельно приготовленного водного раствора соли. В способе используют нат= риевую соль карбоксиметилцеллюпозы (Na-КИЦ) и сшивают катионами алюми= ния или трехвалентного железа, а процесс выполняют при обычных темпе= ратурах. Соотношение сухих масс иммо билизуемого материала и Na-КМЦ сос тавляет от 0,3 до 4,5. Используют

Яа-КМЦ со степенью замещения от 0,5 до 1,2 и степенью олимеризации от

300 до 3000. Способ позволяет удешевить процесс иммобилизации при сохранении высокой ферментативной ак тивности целевого продукта.

Способ заключается в иммобнлиза ции пекарских дрожжей Saccharomyces

cerevisiae в геле на основе карбоксиметилцеллюлозы. Клетки микроорганиз мов вносят в водный раствор кислого полисахарида и сшивают с ним много валентны я ионами металлов, при этом в качестве полисахарида используют соль карбоксиметилцеллюпозы (КМЦ), например натриевую, со степенью sake

3 1666536 4 щения по карбоксиметнльным группам

О, 5 " 1,2 и со степенью полимериэации 300 3000 и иммобилизуемый ма териал суспендируют в растворе соли карбоксиметилцеллюпоэы в соотношении по абсолютно сухой массе 0,3 - 4,5.

Сшиванне выполняют растворами солей алюминия: алюминиевых квасцов, сульфата алюминия, нитрата алюминия, 10 ацетата алюминия, " а также растворами солей трехвалентного железа.

Варьируя указанными параметрами носителя, можно в определенных пре делах регулировать свойства геля,и, соответственно, менять физические, физикохимические и технологические свойства самого,биокатализатора, де лая его наиболее пригодным для того, или иного вида применяемого обору= дования.

Степень полимеризации КМЦ и соот ношение сухих масс иммобилизуемых клеток и KMLl, существенно влияют на диффузионное сопротивление гелевой g5 матрицы, что позволяет получить био катализаторы с различной активностью.

Пример 1, Готовят следующие водные растворы.

А. 5 - ый -КИЦ марки 70/740 (первая цифра означает, что в моле куле Na-КИЦ средняя степень замещения по карбоксиметильным группам равна 0 7, а вторая указывает степень полимериэацьш в молекуле Na-КИЦ}.3

Б. 5Х*"ный раствор алюмоаммонийвва квасцов tNHIA1{$0а)а 12$20). Оба раствора стерилизуют 15 мин йри

120 С. В 2 мл раствора А суспенди. Руют протиранием в ступке 0,2 r cy 40 хих дрожжей S. cerevisiae (paca Р 21, выделенная в Институте микробиологии им. A.Кирхенштейна) с инвертазной активностью 8100 ед. на 1 r абсолют но сухих дрожжей. Суспензию продав - 45 ливают через капилляр диаметром

1,5 мм, конец которого находится и передвигается непосредственно над поверхностью раствора Б. Полученный жгут выдерживают в растворе Б в тече ние получаса. Жгут вынимают из раст вора и протирают через сито иэ прово-. лочной ткани с квадратными ячейками размером стороны в свету 0,63 мм. При растирании сито промывают дистилли рованной водой и на другом подобном сите с размером стороны ячейки в свету 0,25 мм отбирают фракцию с разме ром частиц 0,25 0,63 мм. Частицы биокатализатора промывают на сите

1,0 л. 0,05 M ацетатного буфера (РН 4,8), после чего внешнюю влагу удаляют на фильтровальной бумаге.

Содержание сухого вещества в ката» лиэаторе 18,9Х, инвертазная активность 864 ед. на 1 r влажного катализатора. Показатель загрузки геля клетками (т.е. соотношение сухой мас . сы клеток и сухой массы Na-ИЩ) 2,4.

Степень сохранения инвертазной активности 80Х.

Инвертазную активность определяют инкубированием навески образца в

7 -ном растворе сахарозы в 0,05 М ацетатном буфере (рН 4,8) при 30ф.

+0,5 С. Ионосахара после инкубации определяют комплексометрически по восстановлению двухвалентной меди.

За единицу активности принята способность 1 r дрожжей (или биокаФалиэатора) инвертировать 1 мкмоль са ! харозы sa 1 мин в укаэанных условиях.

Пример 2. Аналогично приме ру 1 готовят биокатализатор из той же партии дрожжей S. cerevisiae. Загрузка матрицы 0,3. У полученного инвертаэного биокатапиэатора содерв» жанне сухого вещества 18,1 . Инвер. тазная активность 306 ед. на 1 г влаж ного катализатора.

Пример 3. Аналогично примеру 1 готовят биокатализатор их сухих дрожжей S. cerevisiae, которые имеют инвертазную активность 5710 ед. на

1 r сухого веса. Используется другая марка Na-ИЩ - 70/450"О", а показатепь загрузки геля равен 3. При протирке используют набор сит с размерами сторон ячеек 0,5 и 1,0 мм.

Степень выживания клеток после иммобилизации 93,2 „

12,4 г влажного биокатализатора (содержащего 22,5 сухого вещества и имеющего инвертазную активность

2890 ед. на 1 г сухого вещества) помещают в стеклянную хроматографическую колонку с внутренним диамет ром 26 мм. Колонку помещают в камеру воздушного термостата, в котором поддерживают температуру на уровне

55+2 C. Колонку соединяют с перистальтическим насосом и сборниками растворов. В колонку подают 60Х -ный раствор сахарозы, приготовленный из сахара песка для промышпенной пе реработки. Проток раствора в течение всего опыта составляет 1,45 0,5 об.

6536

5 166 раствора на 1 об. начального слоя биокатализатора (начальная высота слоя равна 60 мм и определяется пос ле установления указанного режима потока).

В первые 2 сут степень инверсии в среднем 97,2 и часовая производи= тельность по инвертированной сахарозе в среднем 1120 r на 1 л насыпного слоя биокатализатора. В течение

12 сут степень инверсии выше 80, и в течение 18 сут степень инверсии выше 50 .

Полученный сироп прозрачен, и дан ные оптической плотности свидетель. ствуют, что дополнительно красящие вещества не образовываются.

Степень инверсии устанавливают по содержанию моносахаров, применяя тот же комплексометрический метод, что при определении инвертазной активности.

Степень выживания клеток опреде ляют подсчетом мертвых клеток и общего числа клеток на люминесцентном микроскопе при окрашивании их приму лином. Гель разрушают раствором цит ратного буфера.

Пример 4. Готовят биокатали затор из той же партии дрожжей, как в примере 3. Загрузка матрицы 1,2.

Активность загружаемого катали:,атора

466 ед. на 1 r влажного катализатора при содержании в нем сухого вещества

21,9Х. Колонну заполняют 12,0 r влажного катализатора. 60 ный раст вор сахарозы подают в течение 2 сут при протоке 1, 1. Средняя степень инверсии 95,6Х, расчетная средняя часовая производительность 840 r инвер-. тированной сахарозы на 1 r насыпного слоя биокатализатора.

Пример 5. Из 60 r Na-КМЦ (содержание сухого вещества 88 ) марки 70/450 "0" готовят 4,5Х-ный раствор в дистиллированной воде„ Стери= лизуют в течение 15 мин при 120 С.

Приемы приготовления частиц био катализатора существенно не отличают "

lcm от описанных в примере 1, а харак= ! ,терные особенности даны ниже, В опытах используют 850 г прессо ванных пекарских дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae (раса ЛК 14) за водского изготовления с инвертазной активностью 1240 ед. на 1 r cyxux дрожжей. Влажность дрожжей 76,6 .

Диспергируют в ступке несколькими порциями. В качестве раствора сшивающей соли используют 5 -ный. раствор алюмокалиевых квасцов (А1 К(804) х

5 х 12H Îj. Нити, полученные из сопла диаметром 1,5 мм, выдерживают в раст= воре в течение 30 мин. Полученный гель протирают через сито с размером ячейки 2,5 мм и собирают фракции частиц 0,63 2,5 мм. Частицы пройы вают дистиллированной водой.

Расчетный коэффициент загрузки геля биокатализатором в этом опыте равен 3,77.

Полученные частицы имеют актйв ность 166 ед. на 1 r влажных частиц при их влажности 77,2 . Соответст венно, степень сохранения активности равна 74,3 ..

20 495 г полученных влажных частиц загружают в цилиндрический сосуд реактор, дно которого образовано из латунной сетки с натянутым материалом из капрона. Реактор имеет рубашку

25 для об огр ева .

Реактор, установленный на лабораторном ферментационном стенде ФС -5Г, соединяют с системой подачи раствора сахарозы, состоящей из обогреваемого сосуда с раствором сахарозы, шпангов и перистальтического насоса„

Раствор сахарозы с концентрацией

65 . подают сверху в реактор с температурой 56+2 С. В рубашку реактора подают горячую воду и температуру в слое биокатализатора поддерживают (по показаниям термометра) на уровне

65+1 С. По достижении указанного тем пературного режима объемную скорость

<О потока устанавливают в пределах

1, 10+0,05 л/ч (в пересчете на нор мальные условия).

Продукт собирают в типовом (для данной установки) конусном фермента " ционном сосуде и BTopblM перистальтическим насосом отводят из установки.

Опыт продолжают 13,5 ч. Получают

t9 7 кг продукта со средней степенью инверсии 91,6Х. Средняя производи тельность 0,56 кг инвертированной сахарозы на 1 л эффективного объема слоя катализатора за 1 ч.

В нескольких образцах исходного раствора и продукта определяют содер" жанне оксиметилфурфурола (ОМФ). Прирост последнего 1 10 = 2, 7.10 4% максимальное содержание в продукте

7,5.10 ., 1ббб 536

ОМФ определяют после подготовки анализируемого раствора (нейтрализацией, осаждением основным уксусно кислым свинцом) путем измерения опФи5 ческой плотности при 282 нм этил< ацетатного экстракта.

Пример 6. Биокатализатор го товят аналогично примеру 1, íî исполь зуют другую партию сухих дрожжей

S. cerevisiae. Инвертазная активность влажного катализатора равна 487 ед/г.

Полученную партию катализатора де лят на две части: одну помещают в за,крытый сосуд и выдерживают в холодийь 1g ной камере при 4 С, а другую сушат на воздухе при комнатной температуре в течение 16 ч на фильтровальной бу маге.

Операционную стабильность катали заторов в обоих случаях определяют в одинаковых реакторах с барботажным воздушным перемешиванием, в которые непрерывно подают 50Х -ный раствор са харозы при 56+2 С. Среднее время псе 25 бывания субстрата в реакторе 180 мин..

Загрузка реакторов катализаторами в пересчете на сухую массу одинакова.

В случае влажного катализатора степень конверсии снижается ниже 50 30 после 135 ч действия, в случае высу шенного - после 290 ч.

Пример 7. Из Na-КМЦ марки

70/450 "0" готовят 3,75 ный водный раствор, в котором суспендируют прес сованные пекарские дрожжи заводского изготовления S. cerevisiae (раса

ЛК 14) с инвертазной активностью

1675 ед на 1 r сухого вещества. Козф фициент загрузки геня клетками 3,5. 40

Через сопло 1,5 мм выдавливают нити суспензии в 5 -ных растворах различных солей, выдерживают в течение 30 мин. Нити каждого вида отдепь но протирают через сито и собирают 45 фракции 1„0 . 2,5 мм.

Определяют инвертазную активность, содержание сухого вещества и рассчи тывают степень сохранения инвертазной активности.

Получены следующие результаты:

Соль для приготов . Степень сохра ления сшивающего нения активнос раствора ти, от исходной

Aló(8О4)у 18Н О 79,6

СиБО4, 5Н О 61,4

А К(80 ) 12Н,О 57,4

Fey(SOg) 9Н О 32,1

В случае использования сульфата меди в ходе определения инвертазной активности практически все частицы катализатора разрушаются.

Пример 8. В водном растворе

Na-КИЦ марки 70/450 "О" с концентра цией 3,75Х диспергируют в ступке прессованные пекарские дрожжи S. cerevisiae в таком соотношении по сухой массе, чтобы коэффициент загрузки геля был равен 6,10 и 12. Для каждой величины этого коэффициента готовят по 3 повторных смеси. Выдавливают суспензии через сопло диаметром

1,5 мм в 5Х-ный раствор алюмокалйевых квасцов. Нити выдерживают в раст воре 30 мин. Далее нити протирают че= рез сито с размером ячеек 2,5 мм и частицы на сите промывают дистиллированной водой (3 л на 1 г взятого NaКМЦ). Промывные воды собирают отдельно для каждого варианта и повтор ности. После 15 минутной седимента ции верхний слой воды сливают и к осадку присоединяют весь остаток на сите. Еще 3 раза промывают водой с перемешиванием, седиментацией и де кантацией. Затем осадок просушивают на фильтровальной бумаге, взвешивают и определяют содержание сухого ве. щества.

Расчет выхода сухого вещества в собранных осадках показывает, что s геле удерживается только часть взятых дрожжей и в биокаталиэаторе ко эффициент загрузки геля клетками *аходится в пределах 4,35 - 4,5 во всех взятых с повторностями соот*ошениях.

Пример 9. Из Na-КИЦ марки

55/500 готовят ЗХный водный раствор, в котором суспендируют сухие дрожжи S. cerevisiae (раса P 21) с влажностью 72Х и инвертазной актив ностью 3460 ед на 1 г абсолютно су хих дрожжей. Показатепь загрузки геля клетками 3,0.

Сшитый катализатор получают айалогично примеру 1, только в качестве раствора Б применяют 5Х -ный раствор сульфата алюминия. Образовавшийся гель протирают через сито 2,5 мм и отбирают фракцию частиц 1 2,5 мм.

Инвертаэная активность катализа тора 420 ед/г при влажности 78,3Х, следовательно, расчетная степень сохранения активности 74,6Х.

9 1666536 1О

Формула изобретения

Составитель В.Муронец

Техред М.Моргентал Корректор М.Максимишинец

Редактор Л.Веселовская

Заказ 2498 Тираж 372 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.yæãoðoä, ул. Гагарина,101

Пример 10. Из Na-КМЦ марки

85/350 готовят ЗХ ный раствор и далее действуют аналогично примеру 9, Инвертазная активность каталиэатора 387 ед/г при влажности 79,8Х, 5 степень сохранения активности 73,8Х.

Пример 11. Из Na-КМЦ марки

70/300 готовят ЗХ -ный водный раствор и далее действуют, как в примере 9.

Полученный катализатор с влажнбс тью 80,4Х имеет инвертазную активность 382 ед/г, степень сохранения активности 75,2Х.

Пример 12. Из Na-КМЦ со степенью замещения по карбоксиме= тильным группам 0,838 и средней степенью полимеризации 1196 готовят

ЗХ ный водный раствор. Далее дейст вуют, как в примере 9.

Катализатор имеет инвертазную активность 424 ед/г, влажность

77,5Х. Степень сохранения активности 72,6Х.

Пример 13. Готовят ЗХный 25 раствор Na-КМЦ марки 70/450 "0", используют дрожжи, как в примере 9. б

Для сшивки готовят и используют .отдельно 5Х ные растворы разных солей алюминия.

Результаты опыта:

Соль, использо- Степень сохраванная для сшивки нения инвертаз ной активности дрожжей р Х

Alp(S0p)y 18HgO . 73,4

А1Щ)з 9Н О 70,8 А1С1 6HgO 67,5

Ацетат аммония 76,4

Таким образом, предлагаемый спо соб получения препаратов иммобилизо= ванных дрожжей позволяет получить препараты с высокой степенью сохла нения ферментной активности иммобилизованных клеток ввиду отсутствия 45 в среде иммобилизации биохимнчески сильнодействующих катионов, например кальция, и благодаря возможности им мобилизовывать при оптимальной температуре, достичь в препаратах высокого содержания иммобилиэованных клеток при хорошей операционной и термической стабильности и хороших механических и термомеханических свойствах препаратов, что также со действует высокой их ферментной ак тивности, выполнить весь процесспростыми энергомалоемкими операциями в несложном оборудовании и быстро, что способствует сохранению ферментной активности, применить относительно дешевые и доступные материалы, кроме того, проводимые технологические ойерации и применяемые материалы не вьюзывают трудности в аспектах промса нитарии и экологии, что также с*о собствует удешевлению способа (уде шевление способа прежде всего достигается более низкой стоимостью йс пользуемой вместо альгината КМЦ).

Способ получения иммобилизованных пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae, заключанзцийся в суспенди ровании дрожжей в водном растворе кислого полисахарида с последующим гелеобразованием путем сшивания пайисахарида катионами металлов, применяемых в виде отдельно приготовленных растворов солей, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью удешевления способа при сохранении высокой фЕр ментативной активности целевого про дукта, в качестве кислого полисахарида используют натриевую соль карбокси метилцеллюпозы со степенью замещения по карбоксильным группам 0,5 - 1,2 и степенью полимеризации 300 3000, устанавливая соотношение дрожжи:натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы

0,3 — 4,5 по сухой массе, а в качест ве источника катионов металлов соли алюминия или трехвалентного железа.