Способ получения сорбента для аффинной хроматографии

 

Изобретение относится к получению производных целлюлозы, которые могут быть использованы в качестве сорбентов для аффинной хроматографии и биотехнологии. Изобретение позволяет повысить механическую прочность сорбентов за счет того, что целлюлозу осаждают из эмульсии 1%-ного медно-аммиачного раствора целлюлозы в смеси хлороформа и бензола при их объемном соотношении соответственно 1:9, содержащей 0,13 - 0,26 мас.% полиоксиэтиленсорбитанмоноолеата, раствором уксусной кислоты в ацетоне. Выделенный продукт обрабатывают 1,6%-ным раствором боргидрида натрия в пиридине, в течение 4 - 8 ч с последующей обработкой водным щелочным раствором, содержащим 0,01 - 0,05 мас.% эпихлоргидрина и 0,01 - 0,04 мас.% боргидрида натрия, при нагревании. Затем продукт активируют водным раствором перйодата натрия и конъюгируют с белком. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУбЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4689702/05 (22) 25.05.89 (46) 15.08.91.Бюл. ¹ 30 (71) Институт биоорганической химии АН

УЗССР (72) У,К,Иногамов, LLt.Ê.Êàñûìîâ, А.В.Карась, В.Т.Скворцов, Ш.И,Салихов и А.Е.Гурвич (53) 661.728.8(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 968039, кл, С 08 В 15/06, 1981.

Авторское свидетельство СССР

¹ 1512974, кл. С 08 В 15/06. 1987 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ

АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ (57) Изобретение огносится к получению производных целлюлозы, которые могут быть использованы в качестве сорбентов

Изобретение относится к получению производных целлюлозы, которые могут быть использованы в качестве сорбентов для аффинной хроматографии, используемых в биотехнологии.

Цель изобретения — повышение механической прочности сорбента.

Пример 1, 4,1 г свежеприготовленного

Со(ОН)2 растворяют в 50 мл 25%-ного

NH4OH, раствор добавляют к 5 г целлюлозы иэ линта хлопчатника. Через 20 ч объем смеси доводят тем же раствором аммиака до

500 мл. Раствор осветляют центрифугированием в течение 5 мин при 4000 об/мин, 50 мл полученного медно-аммиачного раствора помещают в сосуд емкостью 500 мл, куда налито 200 мл смеси хлороформ:бензол 1:9, содержащей 0,26 мас,% (0,6 мл с d-1,08

«Ы 1669918 А1 (s1is С 08 В 15/06, G 01 N 30/48//

С 12 N 11/12 для аффинной хроматографии в биотехнологии. Изобретение позволяет повысить механическую прочность сорбентов за счет того, что целлюлозу осаждают иэ эмульсии 1%ного медно-аммиачного раствора целлюлозы в смеси хлороформа и бенэола при их обьемном соотношении соответственно 1:9, содержащей 0,13-0,26 мас.% полиоксиэтиленсорбитанмоноолеата. раствором уксусной кислоты в ацетоне. Выделенный продукт обрабатывают 1,6%-ным раствором боргидрида натрия в пиридине в течение 4-8 ч с последующей обработкой водным щелочным раствором, содержащим

0,01-0,05 мас.% эпихлоргидрина и 0,01-0,04 мас.% боргидрида натрия, при нагревании

Затем продукт активируют водным раствором периодата натрия и коныюгирую1 с белком. 1 табл. г!см полиоксиэтиленсорбитанмоноолеата. э

В сосуд опускают мешалку и эмульгируют в течение 4-5 мин при 440 o5/мин. Эмульгированную целлюлозу выпускают через нижний отросток в регенерирую,ций раствор, содержащий 500 мл ацетона и 50 мл ледяной уксусной кислоты. Через 8 мин, выпавшие шарики, отделяют и промывают 10-ю обьемами воды.

Пористые целлюлозные шарики фракционируют на капроновых ситах и отделяют фракции, содержащие частицы целлюлозы размером 70-200 мкм, 1 r (100 мл) пористых целлюлоэных шариков (П ЦШ) помещают в круглодон ную колбу емхостью 500 мл, снабженную обратным холодкльнихом, добавляют 100 мл пиридина, содержащего 1,6 мас.% боргидрида на1669918 трия, и нагревают на водяной бане в течение 8 ч. После этого сорбент промывают на воронке Бюхнера сначала ацетоном, а затем дистиллированной водой до исчезновения следов ацетона. 5

1 г (100 мл) ПЦШ промывают еще раз на стеклянном фильтре дистиллированной водой, переносят в стакан, суспендируют в 70 мл дистиллированной воды и добавляют 20 мл 12 -ного раствора NaOH, 0,016 мас,7, 10 (0,2 мл, d=1,18 г/см ) эпихлоргидрина и 0,01

3 мас.7 (20 Mr) NaBH4. Стакан помещают в водяную баню и нагревают смесь до 60 С в течение 2 ч, постоянно перемешивая посредством механической мешалки, Через 2 15 ч продукт промывают дистиллированной водой до нейтрального значения рН.

Затем сорбент активируют обработкой

0,015 М раствором Ма./04 в течение 18 ч в темноте и снова промывают водой. 20

Далее сорбент обрабатывают 0,1 М карбонат-бикарбонатным буферным рас1вором с рН 9,2 и для получения иммуносорбента добавляют предварительно отдиализованный против буфера белок (raMMa- лобулин 25 лошади). Смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре и инкубируют

1 сут при 4ОС. Полученный иммуносорбент промывают поочередно 0,01 M раствором

HCI в 0,15 M растворе NaCI и затем 0,1 M 30 борно-боратным буфером с рН 8,6. Свободные альдегидные группы восстанавливают обработкой иммуносорбента 0,1 М NaBH4 в

0,15 М NaCI, а затем отмывают его 0,15 М раствором NaCI. Количество присоединившегося белка. отделяют по окрашиванию бромфеноловым синим.

Условия получения и свойства сорбента при различных параметрах способа предс1авлены в таблице.

Формула изобретения

Способ получения сорбента для аффинной хроматографии, включающий осаждение целлюлозы из эмульсии 1 -ного медно-аммиачного раствора целлюлозы в смеси хлороформа и бензола при объемном соотношении их соответственно 1:9, содержащей 0,13-0,26 мас. Д полиоксиэтиленсорбитанмоноолеата, раствором уксусной кислоты в ацетоне и обработку выделенного продукта 1,67о,-ным раствором боргидрида натрия в пиридине в течение 4-8 ч с последующей активацией водным раствором периодата натрия и коньюгацией с белком, отличающийся тем, что, с целью повышения механической прочности сорбента, перед активацией продукт обрабатывают водным щелочным раствором, содержащим 0,01-0,05 мас. эпихлоргидрина и 0,01-0,04 мас. $ боргидрида натрия при нагревании, 1669918

t о ф

Ц о

И о х а А

Ц о

Ф И J J х х

R3 а Ф х ф Э сб х х ал е ф О Ц с1

X (U

Е» о4 ф ф г (» J л о

»» с6

° с»

X x о Ф

o o, о

II J.4=

В:(х о

И J С0

:) о

i» (1

Й л л л л О» ° л л

А

E о о J л с

М М о л оi о

М С \ и о

М а л С1

М М) М л

М М

A J о ф

Е» о

;.> о о

СЧ О с 4 М о л о

М М М

o o о

М с 1 о о и о о - — о

М М М М о о

М М о о о

М М л

4 а1(б ф

Е» о

) » о ф .>

I»a

О 1 о с о л л

o o

N Л о о о л л °

o o o х о

О а о о л л о о

o o

° л

o o

o o л л о о о о л л о о х

Х

E о

Щ а о у с а» х р

Ц о

И сс о сл о о о о л л а л о о о о н:> о а о

Ю О о о л л о о О о л л о о

Ю О о о л а о о О Ю о о

° л о о

Ч0 о л о х о

ы х

td Х

X о о о с

СЧ СЧ

1 f о о л о о

o o

N N о о

o o

СЧ С 4 о о

o o

С 4 N

Х о о л о о о о о о

N СЧ СЧ о о о о

С4 N о о о о .С 4 СЧ (l о с л

ЬЬЬ

6d ÜÜÜ о

Ю х ф P а ю

С0 О ( х с4 о J х

С ( х и х о о х

Ц о

i и х о л с6

6 ом о ° х J о е

Е 3 О

N л ь О 0

N л а о о

О О

СЧ СЧ л л о о О

С 4 л ь О uD

СЧ СЧ а л о о сО О О

СЧ СЧ N л л а о о о о

° N л л о о О О

СЧ СЧ л л о о а

tJ а а J J

Л О Л ао

00 С0 CO СО СО 00 СО СО 00 О W CO 00 ( J

Щ

Ф

Х Ю х о5 х х а ( х х о

cd х у ю а а р J а о (б 1о х х

Ю Й

Ц Щ о а J х

Э о

С» о о

Ц о

Щ л

E о ц

44 О

И и ф х о ю

° °

И о .(3 а ц о а а)с и о в х

cd Х °

E» Q B х Н M в со ю х ( а » ч0

О OOO о о охф х е ф

Ф од э а.ю о

e o