Способ получения полимерного реагента для ковалентной иммобилизации биологически активных соединений
Изобретение относится к области химии полимеров и позволяет получить полимерные реагенты для ковалентной иммобилизации биологически активных соединений с высокой (135-265 мг/r) связывающей способностью экологически чистым способом. Это достигается радиальной эмульсионной сопо/шмеризяцией смеси 1 мае.ч. бутилметакрилата с 5,8-8 4 мае.ч. диметзкрилата диэтил енгл и кол я и 1,2-7,2 мае.ч глищ)дилметакрилага или аллплглицидилового эфира в присугстпии органического растворителя - порообразовагеля ипооерхиостно-активного вещества г растворенным в смеси 1-10 мас.% Фосфата щелочного металла на первой стадии и добавлением 75- 80% глицидилметакрилата или аллилглицидилового эфира через 0,25-1.0 ч на второй стадии синтеза 1 табл со С
СО>ОЭ СОГ>ЕТСКИХ
СОЦИ4ЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСГ1УЬЛИК
ГООУ/14РстГ>е>>116»Л комитет
Г1О ИЗОБРЕТЕ»ИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
Г1РИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ! о
«4 (Л
СлЗ
iC) (К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4633553/05 (22) 05.01.89 (46) 07.09.91. Б>ол. М. 33 (71) Научно-производственное обьединение
"Биолар" АН СССР (72) М.К.Клявиньш, Р.Ç.Расса, Л.Л.Штеймане, Л,C.Ðoñêà и Л,Х.Зицманис (53) 541.6.69 (088.8) (56) Патснт ФРГ
N 3427441, кл. С 08 F 2/20, опублик. 1986.
Европейский пагент
>1" 58767, кл. С 08 Г 220/54, опублик. 1982. (5 1) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНОГО
РЕЛГЕНТЛДЛЯ КОВАЛЕН1 НО!4 ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
СОЕДИНЕНИЙ (57) Изобретение относится к области химии полимеров и позволяет получить полимерИзобретение от»осится к химии полимеров, а именно к способу получения полимерно>о реагента для ковалептной иглмобилизации биологически активных соединений, и может быть использовано в би.отехнологии и инженерной энзимологии для создания препаратов с иммобилированными биологически активными соединениями.
Целью изобр>.>ения являегс» повы>пение связыва>ощеи способности полиме> ого реагента по отноц>еник> к биологически активнь>м соедине»иям и повышение экологической чистоты процесса.
Пример 1. Il 800 мл деминерализованной воды при перегле»>ива>сии и 50 С растворяк>г 20 г поливинилпирролидона (мол,гласса 20000 .0Г10). Г>»олученный раствор поверх>II!с I но-, > T I>3>IOI вещества вноеят 82 г ф. ., ;; »".I l!ия (10 маС.% к раствору П. . ) >1::;: г;л>пер-.гуре г.ри
„„5lU„„1675304 А1 (ч> С 08 F 2/20 220 10, С 12 N 11/08 ные реагенты для ковалентной иммобилизации биологически активны . соединений с высокой (135-265 глг/г) связ»ва>ощей способностью экологически чистым способом.
Это дости ается радиальной эмульсионной сополимеризацией сл>еси 1 мас,ч. бутилметакрилата с 5 8-8.4 мас,ч. диметакрилата диэтиленгликоля и 1,2-7,2 мас.ч. глиц>1д>ллметакрила га или аллплглицидилоного эфира в присугстг>ии opr;»ivческо>о рас > ворителя — порообразова геля и поверхностно-активного вещества с растворенным в смеси 1-10 мас. /, Фосфага щело Illo>0 металла >Ia первой ст,>дии и доб;>вле»ием 7580% глицидилл>eтакрилата или аллил>лицидилового эфира через 0,25-1.0 ч на второй стадии г:интеза. 1 табл. перемешивании сп скоростью 170-200 об/,IT>i прибавляют ис;og>I>yio сглесь мономет1 ов, состоящую из 94 мл хлорбе»зола, 29,i г (0,30 моль) диметакрилэта диэтиленгликоля, 3,55 r (0,025 моль) бутилметакрилата и 5,32 г (0,125 моль) глицидилглетакрилата.
Добавляют 0,5 г инициатора — 2,2-азобис(изо-бутиронитрила) (ДАК) и перемешивают при 80>С, набл>одая за процессом полимеризации путегл отбора проб реакционной смеси. Гlосл» 25 I»I (образуются твепдые частицы) nI>l!;II!I >nT 15,97 г (0,36
)Ion>, глицидилметакоичл>а Реакцио»ну>О смес> перегле»>ива>от 6 . Полимер отфильтровывают, пром>, ваюг. про>лывают водой, ац> . го»огл, экс > Г>а». >!7>>» 6c>>зn чaгл. Сушат при 75 С и течен>«. 8 ч. 11Т;;>у >лют 54,20 г
>>ро >укта (выход 98
Г1ол учен»ый п1ч;дукч х;>рак геризуется с,:,, н.>цими г, . «;„-: >;.л ->л, C.одзржанис
:> .-, -.,;. рупп. 2 45 л I ic;I./ã „„->роделено по1675304
55 тенциометрическим титрованием хлористоводородной кислотой в диоксане), элементный анализ: С 60,22 ф,, Н 7,09, удельный обьем в воде 2,0 см /г. диметилформамиде
4,1 см /г, бензоле 3,0 см /г. В ИК-спектрах з имеется максимум сорбции при 1210 см
-1 (сорбция эпоксигрупп). Продукт получен в виде регулярных частиц с размером 0,0500,160 мм. Содержание основной фракции (по весу) 68оь (100-140 мкм).
Данные по примерам 2-8 приведены в таблице, где показан синтез полимерных реагентов для иммобилизации биологически активных веществ.
Пример 9, Иммобилизация белков на полученных носителях.
1,00 г носителя, полученного согласно примеру 1, суспендируют в 10 мл 0,1 н, ацетатного буфера (рН 7,5), который содержит
32 мг пеннициллинацилазы. Смесь перемешивают при 4 С в течение 24 ч. Полимер отфильтровывают, промывают, промывают
0,1 н. хлоридом натрия, водой. Хранят при+
4 С в 0,1 н. фосфатном буфере (рН 2,5). Активность иммобилизованной ацилазы 340 ед./г.
Пример 10. 1,00 г носителя, полученного согласно примеру 2, суспендируют в 10 мл 0,05 н. ацетатного буфера (рН 6,6), прибавляют 350 мг трипсина с удельной активностью 36 ед. акт./мг и перемешивают при
+ 4 С в течение 6 ч. Затем продукт отфильтровывают и на фильтре промывают водой.
На носителе связан трипсин с активностью
10672 ед. акт.
Пример 11. Иммобилизация низкомолакулярных биологически активных веществ.
К раствору 0,61 r L-фенилаланил-L-аспаргиламида в 30 мл воды добавляют 1,0 г носителя, полученного по примеру 3. Перемешивают при 20 С в течение 10 ч. Продукт фильтруют, промывают водой, ацетоном.
Сушат на воздухе. На носителе связано 0,58
r пептида (определено по аминокислотному анализу), Пример 12 (сравнительный). 2,00 г бромцианактивированной сефарозы выдерживают в 0,05 н. хлориде натрия в течение
3 ч, Затем раствор хлористого натрия отмывают 0,01 м дикарбонатом натрия и гель переносят в 50 мл 0,05 н. дикарбонатного буфера (рН 8,5), прибавляют 700 мг трипсина с уд. акт. 40 ед. акт./мг и перемешивают при +4 С в течение 6 ч, Затем продукт отфильтровывают и на фильтре промывают водой. На носителе связан трипсин 3,5 мг/г.
Пример 13 (сравнительный), 1,00 r эпоксиактивированного сферона суспендируют в 50 мл 0,05 н. бикарбонатного буфера (рН 8,5), прибавляют 350 мг трипсина с уд. акт. 40 ед. акт./мг и перемешивают при +
4 С в течение 6 ч, Затем продукт отфильтровывают и на фильтре промывают водой. На носителе связано 12 мг трипсина.
Пример ы 14 (сравнительный. известный). В 6 л колбе с термометром, насадкой
Дина — Штарка, отточным холодильником, трубкой для ввода азота, помещают 1740 г гексана, 1100 г перхлорэтилена, 9 г эмульгатора и 5 r сухого льда. При перемешивании и продувании азотом при 50 С прибавляют смесь, состоящую из 640 г метанола, 160 г воды, 240 г метиленбисакриламида, 30 r аллилглицидного эфира, 30 r глицидилметакрилата, 6 г 4,4-аэобис(4-циановалериановой) кислоты. Смесь перемешивают при 6570"С в течение 6ч. После этого реакционная смесь выдерживается при указанных условиях еще 4 ч, после чего охлаждается до комнатной температуры. Полученные частицы полимера отфильтровываются в течение
12 ч, высушиваются в вакууме при 40 С.
Активность иммобилизованной ацилозы достигает 122 ед./г.
Формула изобретения
Способ получения полимерного реагента для ковалентной иммобилизации биологически активных соединений путем радикальной эмульсионной сополимеризации глицилидметакрилата или аллилглицидилового эфира с моновиниловым сомономером и сшивающим агентом в присутствии органического растворителя — порообразователя в среде водного раствора поверхностно-активного вещества, о т л и ча ю шийся тем, что, с целью повышения связывающей способности полимерного реагента по отношению к биологически активным соединениям и повышения экологической чистоты процесса. в качестве моновинилового сомономера используют бутилметакрилат, в качестве сшивающего агента — диметакрилат диэтиленгликоля, к водному раствору поверхностно-активного вещества добавляют 1-10;/, фосфатов щелочных металлов от массы раствора, причем в начале сополимеризации в реакционную смесь вводят 20-25 мас. глицидилметакрилата или аллилглицидилового эфира от их общего количества при массовом соотношении бутилметакрилат: диметакрилат диэтиленгликоля: глицидилметакрилат или аллилглицидиловый эфир, равном 1;5,88,4;1,2-7,2, и через 0,25-1,0 ч вводят остальное количество глидицилметакрилата или аллилглицидилового эфира. и (и
CO (Г) и
-:т
Х .0 х Ф
Ц о
<О а
О О
О»
r ю
Й Л
lO
О о» о
О) D
Ю
<" ! сп (-.
О)
С» с! (Э
I l. г: (; г-. и гJ (и м с»
Г (\ (:)
Г 4
Ю а ь
rd Ю о х
Х 4)
Ц о л а о г -т
Ю
Cl
Ц о
Ql
IO
О о
CO
in in со
П <О
in
in ((о
ГЧ
<т) ) (L
Г (Ю о с»! (Г\
-т с»
ГГ) (0
Г(Г\ а. и
Г \
L с«0 о а г
О. о д т а
Э
Х а
C)
c J
< (т
CJ
СГ) (» г(1 (l»
О, »<(;
Ю
Ю
СО
Х
e o
Ц о
Х
Э а о
ln
О(in
Г 1 с
О
<и (и г» и.е и с
О»
Г!
_#_ 0.т
Г )
ГС)
Ю
0О ) сч
СГ
C) и
<и (<и
0 П
< 4 сп,О <1 J
)C 3
О) П а=о
Ql и <о с
° О
n (-;
in 3
E.:г- о
in
I I
С)
C. .СО
c( (В.1 (и о
О» <
<О
01 Т и и
< 4 и о <и (1 с
О\ х
Э
IO а о
Г4
-т
< l
-с
rI
c-- 0l
CG и и
О0 -0
Ю
Ю
00 а т Х о
-т о о (и
«Ю с; ( о п а (О (Х и с4
C)
Ю,О
< J о
Х с о
Х J
Х х
Э (» о
О о
Ю о
) .) л
О
Э (1 а
О)
I
Г, Ef
X Э (- Ф J о э
Х х а <0
<О О) Х
CQ О»= о о х
Х) Ю <О
Х
cQ o
Х Х <»4
Х К
Ф о а О= о xr г. и
C)
4о а
О) Г4
Е 00
О4 с
C) <а г 4
О!
<О
ОС
0 ю с-1 г(<Ч
P (y) ОС
Ю т
Ю
l1 <
Г1 (I
3 о
< о а3
Н г е о
С Э
5 а о
Ос <Ч in С) <4 )» ° С 1 < х Х С (О <- сч 5 Г) < \ g и х а )с <» Cd 0 Ql X г1 01 о а Ql Е о X о X ( г! QI I;— о с E (( г, г( г) Ф (О ! Э i ). Г; Ii) г, и in с <О Хn (I (- Ю 00 и Х » г! 1I 3 о lr4 <о :.) а о О) Г () Э 5. Х к а о г а Э
<<О л 5 Г) I< I Г <4 О С Х э с. с» (C Х K г Э 4 lc о J 1ь/5304 Г t; 7 г с, s r с7 гс7 i с t С7 :C л .7 J. 7; 1 I.7 7. 7 CO г t Г с - t С 7 гс Г Г 7 ) и г; t г 7. 7 о о сс7 .7 .7 г7 Г7 С г с с - Г С> С.Г С! i .Ю С7 Г; С7 о О. Г с! г!..Г 7 i !.З 1 7 г t г; С7 У. Г! Сс 7 г7 с с 77 -.Г г I i Ci C. и с! t гс гс Ct ГГ СГ 17 7, с,й t ,7 r, t: t: с; г Г гг7 с 7 77 2 .СГ 7 F 7; - С 7 
