Способ определения лизоцима в биологической жидкости

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к медицинской микробиологии . Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Способ заключается в том, что обнаружение лизоцима осуществляют путем диффузии его в гелевой среле, содьржящей 5,2-5.5% трехмерного геля поиизкрмл-эмидз и тес -культуру Miciococcus lyicoef/cicus Концентрацию лизоцимз епредап-.ют п/тем сравнения размеров зон лизиса с. зонами лизиса, попученнмми с испочьзие ЭгЖс М стандартных растворов лизоцимз Чувствительность метода 0,1 мкг/мл пр объеме прсбы 0,003 мл. Л тлбл,

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51>з С 12 0 1/34

ГОСУДАРСТВЕН.ЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕт ЕЛЬСТВУ (21) 4695604/13 (22) 11,04,89 (46) 07.09.91. Бюл. М 33 (») Харьковский научно-исследовательский институт микробиологии; вакцин и сывороток им. Мечникова и Харьковский научно-исследовательский институт эндокринологии и химии гормонов (72) ЕМ. Бабич, Л.П. Пивоваревич, С.А. Деркач, И.Б. Васильева, В.П, Пимченко, В.И. Белозерский и К,B. Божко (53) 577. 15. 08(088,8) (56) Osserman Е,F., Lawior D.P, Serum and

Urinary lysoryme (Могап idasse) 1п Monocytlc

and Monomyeiocytlc llnkemia, — lournal of

Experimental Medicine, 1966, v, 124. М 5, р. 921 — 952.

Мотавкина i-!.С„Ковалев Б.M., Шаронс в

А.С. Микрометод количественного определения лизоцима. — Лаб. дело, 1979, N 12, с. 722-724, Изобретение относится к биотехнологии, а именно к медицинской микробиологии.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Способ заключается в использовании твердой гелевой среды. в состав которой наряду с тест-культурой Mlcrococcus

lysodelktlcus входит 5,2-6,5 гидрогель трехмерного полиакриламида. Указанная среда, сформированная за определенные промежутки времени, имеет хорошие диффузионные свойства, что позволяет выявлять низкие концентрации лизоцима в исследуемых жидкостях.

Оптимальные дозы акриламида, а также временные параметры формирования гидро„.. SU„„1675328 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИЗОЦИМА

В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к медицинской микробио lo гни. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Способ заключается в том, что обнаружение лизоцима осуществляют путем диффузии его в гелевой среде, содержащей 5,2-5,5-,ь трехмерного геля по»изкрил. мидэ и тест-культуру Miciucoccus lys. oem - .:1сиэ. Концентрацию лизоцима определ :ют nyòåì сравнения размеров зон лизиса с зонами лизиса, получен нь ми с испочьэо ° аннам стандартных растворов лизоцима. Чувствительность метода 0,1 мкг/мл при о ьеме пробы 0,003 мл.

4 табл, геля определены экспериментальным путем с г . мощью изучения физико-химических свои" тв смеси и обнаружения пороговых значений активности лизоцима.

Акриламид беру в разведениях от 5,0 до 6,7Q. Время загустевания всех образцов одинаково и составляет не менее двух минут (минимальное время формования смеси).

Оценку оптимальных концентраций полиакриламида проводят по степени прочности консистенции сред, диффузионной способности их и воэможности образования одинаковых по обьему лунок, Эти показатели характеризуют плотность геля, пригодность его в исследовании жидкостей, что относится к обязательн. м условиям постановки данного теста.

1675328

Диффузионная способность гельсреды определена с помощью стандартного раствора лизоцима, взятого е концентрации 8 мкг/мл. Плотность оценена по величине зон лиэиса вокруг лунок, заполненных раствором фермента.

Характеристика гидрогеля с различной конценграцией полиакриламида (время формирования среды 2 — 5 мин) представлена в табл. 1.

Смеси, содержащие 5,0 — 5,17ь полиакриламида (ПААГ) имеют мягкую. непрочную консистенцию. Формирование лунок затруднего и сопровождается разрывами среды. Это придает им неправильную формув виде различных по вытянутости эллипсоидсе. Такое некачественное образование лунок препятствует точному измерению эон лизиса.

Образцы, содержащие полиакрилвмид в количестве 5,2-6,5o имеют достаточно прочную консистенцию, в то же время формирование лунок не вызывает затруднений. а зоны лизиса являются четкими и хорошо выраженными.

Увеличение до излучаемой составной (6,6-6,77) приводит к повышению плотности смеси: эоны лизиса оказались меньшими на 4-5 мм, образование лунок нередко сопровождается разрывом среды.

Следовательно, низкие(5,0 — 5,1 ) и более высокие (6.6 — 6,7ь) концентрации ПААГ не позволяют получить с заданными свойствами гель. Основным физико-химическим требованиям отвечают образцы, содержащие 5,2-6,57ь указанного компонента смеси. Приведенные результаты согласуются с материалами изучения чувствительности теста.

Частота выявления различных концентраций лизомина в стандартных растворов представлена в табл, 2.

Как следует из табл. 2. применение образцов гельсреды, содержащих 5,2-6,5 мас. полиакриламида, позволяет в 96,0100.07, случаев выявить минимальные концентрации фермента (0,1 мкг/мл).

Чувствительность теста при добавлении в смесь 6,67ь ПААГ снижается. С помощью этих образцов гельсреды лизоцим в дозе

0,1 мкг/мл обнаруживается в 25,0 (случаев.

На чувствительность теста влияют как различные концентрации ПААГ, так и время сшивки гельсреды (табл. 3). Минимальная продолжительность (2 мин) и последующие временные интервалы образования геля (до

15 мин) не вызывают снижения разрешающей способности данного теста. Однако более длительное (16-20 мин) загустевание

55 реакционной массы изменяет чувствительность предлагаемого метода — пороговая доза лизоцима увеличивается е 2 раза, а частота положительных результатов при содержании фермента 0,1 — 0,25 мкг/мл оказывается в 3,1 — 5,0 раза ниже.

Таким образом, оптимальным содержанием пслиакриламида г. среде является концентрация его 5,2--6,5, а время формирования еля — от 2-х до 15-;и мин, Способ осуществляют следующим образом.

П рига товление гел ьбактериаль ной среды.

В 1/15 М фосфатный буфер(рН 6,2) вносят акриламид (АА) и N,N -метилен-бис-акриламид (МБА) (0.2 — 0,25%), гтсбы получить

5,2 — 6,5=,ь-ный рас-; Bop суммы эти> комг онентов в конечной реакционнои смеси, и

N,N,N,N -тетраметилэтилендиамин

1 1 (ТМЭД) (0.1-0,3 ).

Навеску сухой культуры M. lysudelktlcus (из расчета 0,1-0,15 к обьему среды) тщательно растирают с несколькими каплями буфера, переносят в предыдущий раствор с помощью небсльшогс количества буфера и перемешивают, Отде,;ьно в небсгьшс. количестве 6уфепа (= /5 его общего обьема) растворяют навеску калия персульфата (ПСК) (0,08 0,15 ) и добавлякп к ранее полученной суспенэии.

Суспенэию выливают на подложку, которой может служить пседметное стекло, дно чашки Пе ри, любая с еклянная или полимерная пластинка (иэ расчета 0,2 мл среды на 1 см площади)

Время формирования геля составляет

2-15 мин. Пластины с готовой средой можно разрезать на полости раэличнblx размеров, которые затем помеща;ь в чашку Петри и испольэовать по мере надобности.

Затем гельпробсйииком диаметром

2 мм делают лунки на расстоянии не менее

1 — 2 см друг от друга.

Определение ",èsсцима в биологической жидкости, Испытуемые npc, : в количестве 0,003 мл вносят в отдельные лунки с помощью пастеровской пипетки с оттянутым концом или шприцем с иголкой для иньекций, предметные стекла помещают на дно чашки Петри и инкубируют в термостате в течение

24 ч, после чего измеряют диаметр эон лизиса вокруг лунки и с помощью калибровочной кривой определяют содержание лиэоцима (в мкгlмл) в испытуемом образце жидкости.

С целью посгроения калибровочной кривои для каждой новой серии среды иэме1675328 ряют эоны лизиса тест-культуры микрококка вокруг лунок, содержащих стандартные разведения (0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0;

4,0; 8,0 мкг/мл) кристаллического лизоцима.

Способ определения лизоцима иллюстрируется следующими примерами

Пример 1, В 70мл1/15 М фосфатного буфера с рН 6,2 растворяют 5 0 г акриламида, 0,2 г М6А и 0,3 мл ТМЭД. Навеску

0,145 г сухой культуры М. Iysodelktlcus растирают в ступке с несколькими каплями буфера и смывают 6 мл буфера в приготовленный раствор, Туда же добавля l ют раствор 0.12 г ПСК в14 мл буфера. Смесь растворов перемешивают и разливают по 4 мл на предметные стекла. Через 2 мин (время формирования среды) делают по 4 лунки на каждом предметном стекле.

Для построения калибровочной кривой готовят стандартные растворы. Предварительно растворяют 10 мг лиэоцима в 50 мл дистиллированной воды (200 мкг/мл). 3атем получают раствор с концентрацией

8 мкг/мл (к 2 мл взвеси добавляют 48 мл дистиллированной воды).

Для приготовлении растворов с концентрацией 1,0; 2,0; 4,0 мкгlмл берут соответственно 0,25 мл рабочей суспенэии. . содержащей 8 мкг/мл фермента, и 1,75 мл дистиллированной воды; 0,5 мл взвеси

+ 1,5 мл воды; 1,0 мл рабочего раствора+ 1,0 мл воды. Более низкие концентрации фермента (0,1, 0,25 и 0,5 мкг/мл) готовят путем разведения стандартного раствора с

1 мкг/мл лизоцима (0,1 мл + 0,9 мл дистиллированной воды; 0,25 мл первого+ 0.75 мл воды; по 0,5 мл раствора и воды), Стандартные растворы лиэоцима закапывают в лунки (по 4 лунки на каждую дозу), стекла.инкубируют в течение 24 ч в термостате при 37 С, после чего измеряют зоны лизиса, высчитывают их среднюю арифметическую величину, строят калибровочную кривую на миллиметровой полулогарифмической бумаге, откладывая средние значения диаметров эон лизиса каждого стандартного раствора по оси ординат, а абсолютные значения концентрации взятых растворов (в мкгlмл) по оси абсцисс.

Исследуемую пробу ликвора, взятого от больного острым серозным менингитом, по

0,003 мл вносят в 2 лунки, предметное стекло кладут на дно чашки Петри и инкубируют при 37 С. Через 24 ч измеряют диаметры зон лиэиса. Зона лиэиса тест-культуры М.

Lysodeiktlcus вокруг каждой из двух лунок с исследуемой пробой ликвора равняется

4,5 мм. По калибровочной кривой это со5

55 ответствует

О,1 мкг/мл.

Пример 2. Готовят гельсреду, содержащую 6,57ь ПААГ со временем сшивки

15 мин, Для этого берут следующие количества ингредиентов, необходимых для приготовлении среды: АА 6,25 г; М6А 0,25 г, ТМЭД

0,1 мл, ПСК 0,08 г, сухой массы микрококка

0,145 r, буфера 88,8 мл (93 2 г). Все операции проводят описанным в первом примере способом.

Исследуют порцию мочи больного менингококковым менингитом. Величина зоны лизиса М. Iysodeikticus вокруг лунки с исследуемым образцом составляет 8 мм, что соответствует концентрации лизоцима 0,25 мкг/мл.

Пример 3, Раствор технического гкриламида имеет рН 7,8 и содержит 8,0=,ь акриламида.

I àñòcoð 1. К 1 л укаэанного раствора прибавляют 14,8 r дигидрофосфата калия

КН РО и 4,35 г гидрофосфата натрии

МагНРОп 2Н10, хорошо перемешивают и фильтруют. Получают раствор, имеющий рН 62.

Раствор II. В 95 vл раствооа 1 растворяют 0,38 N,È -метилен-бис-метакрчламида и ,1

0,25 мл T IËÝÄ.

Раствор III В 10 мл фосфатного буфера растворяют О, i65 г калия персульфата.

Растворы II u III смешивают со вэеес ю

0,18 r тест-культуры в 11 мл буферного раствора и выливают на предметные стекла, либо в чашки Петри, либо в горизонтальную форму иэ оргстекла, Через 5 мин образ1ется гельбактериальная смесь, которая содержит 6,5;ь полиакриламида и 0,15 тесткультуры, Исследуют пробу жидкости, взятой с помощью катетера из пред тательной железы.

Добавление биологического субстрата в гельсреду сопрочождается образованием зоны лиэиса диаметром 8 мм, что соответстеуег концентрации лизоцимэ 0,25 мкг/мл, Сравнительные данные применения известного и данного способов были получены при обследовании 35 больных острыми серозными менингитами вирусчой и бактериальной этиологии. Лизоцимную активность спинномозговсй жидкости определили у всех больных, в том числе у 27 иэ них параллельно изучили содержание феомента и в моче (табл, 4). концентрации лизоцима

Формула изобретения

Способ определения лизоцима в биологической жидкости с помощью метода диффузии в гелевую среду с использованием тест-культуры Mlcrococcus lysodelktlcus u

1675328 оценкой концентрации лиэоцима по размеру зон лиэиса тест-культуры, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве гелевой среды используют полиакриламидный сшитый гель с концентрацией 5,2 — 6,5 и продолжительностью формирования геля

2-15 мин.

Таблица1

Из них имели свойства

Концентрация полиакриламида, оличе сто образljH 9HoHHhlP (по зонам лизиса B мм) Физи ..ские цов

Прочные

Не про чHb! P

Формиров ание луно к

10-12 13-14

15 и не зазатруднено трудне но

5 ,5

5

5

Таблица2

Частот,) обнаружения,X, лизоцима при его концентрации (н мкг/мл) Количе ство образцов

Содержание поJIH cLK P HJl амида В гельсреде

О 05 О 1 О 25 0 5

1,0

20 100 100 100

26 О 98 О 1ОО 100

30,0 96,0 100 100

О 25 О 45 О 100

100

5,2

5,8

6„5 о,6

5,С

5,1

5,2

5,3

5,4

5>5

5„6

5,7

5,8

5,9

6,0

6,1

6,2

6,3

6,4

6,5

6,6

6,7

5

5

5

5

5

5

5

5

4

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О

Г)

5

5

5

5

5

5

5

5

4

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О

Э

S

5

5

5

5

4

О

О

О

О

О

С

О

О ,) (0

О (1

О

О

О

О

О

О

О

0

О !

G

О

О

О

1

5

5

5

4

О

1675328

Т а блиц а 3

Частота обнару кении, Х, лизоцима при его концентрации (в мкг/мл) L(Конце н тВремя сшив к

Количе ство образцов, рация полиак риламида, X сред, мин

I 1,О

0,25

5,2

6,5 таблнца4

Енологнчсская анлкость

Способ

Копн че с тво проб

Из ннк с лолоантельHhlHl\ ревультамн тон чнсле сонернеанк лнвоцюю (в нк г/ип) определення лнзоцниа) " L" ": 1 " Х - .Г абс

17,4!6,4

7,4 15,0

ЕО,О16,а

62,9 9,2

ИввесТ ный

Предлагаеьюй

Лнквор йоча

Люсвор ноча

27

6 г

28

17 о о

1 о

5 2 г о з

2 О

Составитель А.Семенов

Редактор Г.Наджарян Техред М.Моргентал Корректор Э.Лончакова

Заказ 2976 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рвушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

2-5

6-10

11-15

16-20

2-5

6-10

11-15

1 6-20

2-5

6-10

11-15

i 6-20

2"

)5

2 >

24,0

96,0

20,0

96,0

12,0

;00

36,0

32,0

1(О

20,0

88 0

92,0

84,0

1О0

100