Способ получения дипептидов или их приемлемых для пищевых продуктов солей

 

Изобретение касается пептидов, в частности получения дипептидов общей ф-лы НО-С(ОЬСН2-СН(МН2)-С(0)-МН-С (АХСНз) - С(0}-ОД+)фенхил, где А Н или СНз с условием , что, если С является асимметричным или хиральным центром, то этот углерод будет иметь D-конфигурацию, или их приемлемых для пищевых продуктов солей, что может быть использовано для обеспечения подслащивающего эффекта. Цель изобретения - повышение сладости и снижение токсичности нового соединения указанного класса. Синтез ведут реакцией производного карбоновой кислоты ф-лы Z-NH-CH(C/0/OB)-CH2-C(0)-OH. где Z Н, аминная защита, с амином ф-лы СНз- C(AXNH)2-C(0}-0 Д+)фенхил, в аминообразующих условиях с последующим удалением, в случае необходимости, защитных групп и выделением целевого продукта в свободном виде или в виде их солей. Новые вещества имеют высокую стабильность в буферных растворах при рН 3 или 5, или 7, практически не токсичны и превосходят по сладости аспартам 5-23 раза и сахарозу в 900-5900 раз. 2 табл. fe

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s С 07 К 5/06 6А 23 1 1/236

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

0 (21) 4203326/04 (22) 10.08.87 (31) 898.063 (32) 19.08.86 (33) US (46) 30.09.91. Бюл. М 36 (71) Дженерал Фудс Корпорейшн (US) (72) Паул Роберт Занно, Гленн Майкл Роу и Рональд Эдвард Барнетт (US) (53) 547,864.407(088.8) (56) Шредер Э., Любке К, Пептиды, M.: Мир, 1967, ч. 1, с. 116. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИПЕПТИДОВ

ИЛИ ИХ.ПРИЕМЛЕМЫХ ДЛЯ ПИЩЕВЫХ

ПРОДУКТОВ СОЛЕЙ (57) Изобретение касается пептидов, s частности получения дипептидов общей ф-лы

НО С(0) — СН2 — СН(й Н2) С(0)-NH С(А)(СНз)— С(0}-О/3(+)фенхил, где А = H или СНз с условием, что, если С является асимметричным или хиральным центром, то этот углерод буИзобретение относится к способу получения дипептидов или их приемлемых для пищевых продуктов солей — новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в пищевой промышлейности.

Цель изобретения — получение новых производных дипептидов — малотоксичных и обладающих более высоким подслащивающим эффектом.

Пример 1. (,В(+)Фенхиловый)сложный эфир,а-L-аспартил-2-метилаланина.

Аминоизомасляную кислоту, защищенную группой N— - C8z,.ðàñòâîðÿþò в 1,2-дихлорэтане (50 мл) в атмосфере аргона при

0 С. В 1,2-дихлорэтан (10 мл) добавляют раствор N,N-диметиламинопириди. Ы 1681732 АЗ дет иметь О-конфигурацию, или их приемлемых для пищевых продуктов солей, что может быть использовано для обеспечения подслащивающего эффекта. Цель изобретения — повышение сладости и снижение токсичности нового соединения указанного класса. Синтез ведут. реакцией производного кврбоновой кислоты ф-лы

2-NH-CH(C/О/ОВ)-СН2-С(0)-ОН. где Z = Н, аминная защита, с амином ф-лы СНзС(A)(NHQ — С(0) — Оф+)фенхил, в аминообразующих условиях с последующим удалением, в случае необходимости, защитных групп и выделением целевого прбдукта в свободном виде или в виде их солей. Новые вещества имеют высокую стабильность в буферных растворах при рН 3 или 5, или 7, практически не токсичны и превосходят по сладости аспартам 5-23 раза и сахарозу в

900-5900 раэ. 2 табл, на (0,5 эквивалента) и Р (+)фенхилового спирта (1 эквивалент). Затем добавляют дициклогексилкарбодиимид (1,1 эквивалента) в твердом виде. После пяти дней перемешивания при комнатной температуре из раствора удаляют мочевину фильтрованием, а полученный фильтрат разбавляют петролейным эфиром (50 мл). Этот раствор затем снова осветляют фильтрованием, а полученный фильтрат выпаривают до образования пасты в высоком вакууме в роторном испарителе, Колоночной хроматографией на силикагеле с использованием петролейного эфира и этилацетата при соотношении

15:1 получают чистый продукт с выходом в

75 — 79 / в виде белого кристаллического вещества.

1681732

ЯМР (СИС!з); д 0,90 (с. 3H); 1,05 (с, 3Н):

1,10 {c, зн); 1,20 1,80 (м, тН); 1,60 (c, 6H);

4,20 (с, 1Н); 5,10 (с, 2Н); 5,55 (с, 1Н); 7,40 (с, 5Н). (a) p == -11,65 (МеОН).

Т. пл. 83-85 С.

Защитную группуудаляют гидрогенизацией в присутствии палладия на угле (10%) в метаноле с количественным выходом свободного аминоэфира, Амин тут же растворяют в N,N-диметилформамире и связывают с предшественником аспаргиновой кислоты с использованием хлорида меди (II) с получением 90%-ного выхода сложного,Вбензилового эфира — а 2-метилаланин (Р(+)фенхилового)эфира N-CBZ а-1=аспаргиновой кислоты.

ЯМР (С0С!з); д 0,90 (С, ЗН); 1,05 (с, 3Н);

1, IO (с, ЗН); 1,20 — 1,80 (м, 7Н); 1,6 (д, 6H);

2,70 — 3,15 (м, 2 Н); 4,1 — 4,2 (м, 1 Н); 4,20 (c, 1I H);

4.60 (с, 1Н); 5,10 (с, 4Н); 5,60 (д, 1H); 5,80 (д, 1Н); 5,90 (д, 1Н); 7,40 (с, 10Н).

Защитную группу продукта удаляют гидрогенизацией с последующей очисткой колоночной хроматографией, Rp Cia, с использованием элюанта метанол — вода при соотношении 85;15, (a)25 =. -3,30 (Ме ОН), Т. пл. 121 — 123ОC.

Определение сладости этих соединений дало следующие результаты (табл. 1), Пример 2. a-L.-Аспартил-0-аланин (Р(+)фенхиловый)сложный эфир.

А. Экзо-P- (+) — фенхол, В кипящую суспензию, состоящую из

72,65 r изопропилата алюминия в 300 мл только что перегнанного изопропилового спирта, добавляют по каплям 27,1 r R+)фенхона в 50 мл изопропанола. Реакцию прекращают через шесть дней, когда с помощью газовой хроматографии (Карбовакс

20 М) определяют, что содержание кетона уменьшилось более «ем íà 50%. С помощью капиллярной хроматографии (Супелковакс 10) также определяют, что отношение экзо/эндоизомеров для фенхола равно 3/1. После охлаждения эту смесь фильтруют и тщательно промывают дихлорметаном. Полученный осадок растворяют в 5%-ной HCI (100 мл) и экстрагируют дихлорметаном. Затем обьединенные растворы дихлорметана промывают 50% ной H Cl (50 мл), насыщенным раствором ИаНСОз (50 мл) и водой (50 мл) и высушивают над

MgS04, Фильтрованием и удалением растворителя получают 23,44 г масла, которое на 40% состоит из непрореагировавшего фенхона и на 60% из изомерова- и В-фенхола.

В течение 24 ч кипятят смесь из 12 г (0,78 моль) Р- и а-фенхола, 11,9 мл (1,1 эквивалента) триэтиламина и 15,9 г пара-нитробензоилхлорида (1,1 r) в 500 мл сухого дихлорметана. Затем разделяют смесь Р /a сложных эфиров с помощью вытеснительной хроматографии на силикагеле с использованием гексан/этилацетат при их соотношении 40/1. Выделяют 6,0 г экэо10 фенхил-пара-нитробензата, (a) p=-17,1О(в бензоле). После гидролиза в щелочной среде нитробензатного эфира (кипячение в избытке Na0H в метаноле) получают 3 г фенхола (9/1;Р /а ). P - (+)-фенхол; (aj p =

15 =+23,4 (чистый).

ЯМР: д 0,95-1,8 (16Н, м, СН2, СНз); 3.0 ч на млн. (1Н, с, СН-О).

В. N-Cbz-0-Аланин, P -(+)-фенхиловый сложный эфир.

20 В тщательно перемешанный раствор

1,3 гP-(+)-фенхола в 20 мл сухого дихлорметана добавляют 1, 9 г (0,0084 моль) NCbz-0-аланина и полученный раствор охлаждают до 0 С, Затем добавляют сюда

0,113 г пара-диметиламинопиридина и

1,91 r дициклогексилкарбодиимида. После

24 ч реакцию прекращают и раствор фильтруют. Растворитель испаряют, а масляный остаток растворяют в диэтиловом эфире, затем тщательно промывают 5%-ной

HCI (25 мл), насыщенным йаНСОз (25 мл), водой (25 мл) и высушивают над MgSO4.

После фильтрации и испарения растворителя полученный продукт очищают хрома35 тографией на силикагеле с конечным выходом 1,86 r N — Cbz — D-аланинф -(+)-фенхилового эфира. (а) э =+3,86

ЯМР:д 0,8 — 1,8 ч. на млн. (19Н, м, СН2, 40 СНз); 4,2 ч. на млн, (1Н, с, СН вЂ” О); 4,4 ч. на млн. (1Н, м, СН- :): 5,1 ч. на млн. (2Н, с, CHz — Ph); 5,4 ч. на млн, (1H, д, NH); 7,4ч. на млн. (5Н, с, Ph).

С. 0-Аланин, Р -фенхиловый сложный

45 эфир.

N- С bz- D-ал а н и í, j3-(+)-фенхиловый сложный эфир растворяют в 50 мл метанола и гидрируют 2 ч над 0,1 г 5% Pd/Ñ в трясучке

Паара. Затем раствор фильтруют через це50 лит, промывают метанолом, концентрируют и кристаллизованный остаток растворяют в дихлорметане.

О. N-Cbz-р -Бензил-(=аспартил-0-аланин, j3-(+) фенхиловый сложный эфир.

В дихлорметановый раствор, содержащий сложный эфир D-аланина (0,00355 моль), добавляют эквимолярное количествоф-бензил N-Cbz-L-аспаргиновой кислоты (1,27 г) и

0,526 г Си (И) О2. После растворения СЯСЬ

1681732

Определение сладости этого соединения дало следующие результаты (табл. 2).

Полученные дипептиды получают или в виде свободной кислоты, или в виде в пищевом отношении приемлемых. солей, 40 например в виде соответствующих аминосолей, т.е. в виде следующих соединений гидрохлорида, сульфата, гидросульфата, нитрата, гидробромида, гидройодида, фосфата или гидрофосфата; или в виде солей щелочного металла, например натрия, калия, лития, или же в виде таких солей щелочноземельных металлов, как кальций или магний, а также солей алюминия, цинка и других подобных солей.

Превращение производных свободного пептида в их физиологически приемлемые соли осуществляется обычными хорошо известными способами, например непосредственным контактированием соединений формулы! с минеральной кислотой, гидроокисью щелочного металла, окисью щелочного металла или карбонатом, либо гидроокисью щелочноземепьного металла, 50

55 добавляют ДЦК (0,81 r). После 24 ч реакцию заканчивают, отфильтровывают мочевину и испаряют растворитель, Желтое масло растворяют в диэтиловом эфире (25 мл) и.промывают 57-ной HCI (25 мл), затем 5 насыщенным раствором ИаНСОз (25 мл) и

Н20 (25 мл), Слой простого эфира высушивают над MgSO4 и испаряют с получением

0,95 г конечного продукта.

ЯМР: д 0,85 — 1,80 (19Н, м, СН2, СНз); 10

4,2 ч. на мпн. (1 Н, с, CH-0); 4,5-4,7 ч. на млн. (2Н, м, N-СН :); 5,1 ч, на млн. (4Н, с, OCH Ph); 5,95 ч. на млн. (1Н, д. NH); 7,05 ч. на мпн. (1Н, д, NH); 7,4 ч. на мпн. (10Н, с, Ph).

Е. а- .-Аспартил-.0-аланин, P -(+)-фенхи- 15 ловый сложный эфир.

0,95 r защищенного дипептида растворяют в 50 мл метанола, в который добавляют 0,1 r 10 Pd/С. Полученный раствор гидрогенизируют в течение 24 ч в трясучке 20

Паара. Полученный таким образом раствор фильтруют и испаряют досуха с получением 0,194 г твердого вещества: taPp-0,867 С.

Полученный продукт очищают на ВЭМХ 25 с обращением фаз (85% метанол/вода) с получением 75 мл 1=аспартил-0-аланина, Р(+) фенхилового сложного эфира.

ЯМР: 0,8 — 1,8 (19Н, м,оСН2, СНз); 2,3—

2,4 ч. на млн. (2Н, м, СНг-С); 4,2 ч, на млн. 30 (1H, с, ОСН); 4,5 ч. на млн, (2Н, м, N-CH);

8,8 ч. на млн. (1Н, с, Н-С). его окисью, карбонатом, либо его прочими более сложчыми соединениями.

Перечисленные выше и физиологически приемлемые соли можно также испольэовать в качестве подслащивающих агентов, которые обычно имеют повышенную растворимость и стабильность по сравнению со своими свободными формами.

Пример 3. Изучена стабильность

a-L-аспартил-2-метилаланин ф(+)фенхипового)сложного эфира (пример 1), а,L-аспартил-0-аланин-ф+)фенхилового1спожного эфира (пример 2) и аспартам (L-аспартил- -фенилапанинметилового эфира) в буферных растворах при рН 3, 5 и 7 при 50, 75 и 100 С, были получены следующие результаты:

Период вращения, при

100 С рНЗ рН5 рН7

Пример 1 8,4 33 67

Пример 2 3,9 14 10

Аспартам 5,3 5 3 «1

Период полупревращения, дни, при

75 С рН 3 рН 5

Пример 1 3,0 15,0

Пример 2 1,3 5,1

Аспа ртам 0,9 1,1

Период полупревращения, дни, при

50 С рНЗ рН5

Пример 1 64 150

Пример 2 22 131

Подслащивающие вещества по примерам 1 и 2 имеют исключительно высокую стабильность в буферных растворах при рН

3, 5 и 7. Соединения примеров 1 и 2 обладают лучшей стабильностью в буферных растворах по сравнению с аспартамом, за исключением случая с рН 3 при температуре

100 С, когда аспартам имел промежуточную стабильность между соединениями примеров 1 и 2. Соединение примера 1 более стабильно, чем соединение примера 2. Период попупревращения соединения примера 1 бып в два- и три раза продолжительнее в буферных растворах при 75 и 100 С и рН

3 и 5, чем период полупревращения соединения примера 2, Период полупревращения соединения примера 1 в буферном растворе при 50ОС и рН 5 был в 1,1-2,9 раза продолжительнее, чем у соединения примера 2.

Проведенные испытания показали, что производные дипептидов, полученные в условиях предлагаемого способа. — соединения практически нетоксичные и слаще сахарозы в 900-5900 раз и превосходят по сладости аспартам в 5-23 раза.

1681732

10 ентрация,мас, Таблица 2 ле я,мас, 2

7

5

Э

Формула изобретения

Способ получения дипептидов общей формулы I

Яф- CII-СОяНI

СН, I

СООН

)(Х

- "-(л) сн

СООP (+) (решил, где А — водород, метил с условием, что, если помеченный звездочками углерод является асимметричным или хиральным центром, тогда этот углерод будет иметь D-конфигурацию, или их приемлемых для пищевых продуктов солей, отличающийся тем, что производное карбоновой кислоты формулы

0,00750

0,00375

0,00185

0 00692

0,0025

0,0025

0,0025

0,005

0,005

0,005

0,01

0,01

Ы вЂ” СН вЂ” С ООп. ! сн,соов

5 где Z- Н или аминозащищающая группа;

 — Н или карбоксилзащищающая группа, вводят во взаимодействие с амином формулыы

Н Е- C(A) CH

COO p (+) щеихил в аминообразующих условиях с последую15 щим удалением в случае необходимости защитных групп и выделением целевого продукта в свободном виде или в виде их солей, Таблица 1