Способ получения конъюгатов на основе производного сефарозы

 

Изобретение относится к получению конъюгатов биологически активных соединений и аминоэтилсефарозы, которые могут быть использованы в медицине для фоторадиапионной терапии опухолей и для диагностики онкологических заболеваний. Изобретение позволяет получить водорастворимые конъюгаты, обладающие радиоэащитным действием и способностью локализоваться в опухолевых клетках за счет того, что производные порфиринов, выбранные из группы , содержащей ди-(глицил)-амидмезопорфирин IX, ди-(фенилаланил)- амидмезопорфирин IX, ди-(аланил)- амид-мезопорфирин IX, гематопорфирин и 1,3-диметоксиэтилгематопорфирин, ковалентно присоединяют к аминоэтилсефарозе и полученный иммобилизованный лиганд нагревают в течение 1-3 ч при 75-80вС в 0,1-0,5 н. соляной кислоте , 50-80/Ј-ной уксусной кислоте или в 0,1-0,3 н. растворе едкого натра, содержащем 0,1-0,15 мас.% боргидрида натрия. 3 табл. « IB

СОЮЗ COBETCHHX

РЕСПУБЛИН (5))5 С 08 В 37/12 // А 61 К 31/73

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Пример 1. Ди-(глицил)- амидмезопорфирин IX-агароза.

Раствор 68 мг (0,1 ммоль) ди. (глицил)-амид-мезопорйирина IX (1) в 10 мп 50Х-ного водного диметилформамида (ДМФА) смешивают с 5 мл раст-. вора 100 мг 1-этил-3-(3-дизтиламинопропил)карбодиимида (ЗДК) s воде, рН смеси доводят до 5 с помощью 6 н. соляной кислоты, добавляют 10 мл объема аминозтилсеАарозы и суспензию перемешивавт 16 ч при 0 С в темноте.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬП ИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4495919/05 (22) 16 ° 08.88 (46) 15.10,91. Бвл. 1 38 (72) В.Х.Митина, Б.А.Клящицкий, Г.В.Пономарев, Н.F..Êëåùåâíèêoâà и В.Б.Лощенон (53) 678.83 (088.8) (56) 1.ipson R, е.а. The use à derivative of hematoporphyrin и1 fumoz detection — J. Na tl. Cancer inst 1961, Р 26, р.1-8.

Evensen, J.F. е.а. Photodynamic

therapy of C H mouse mammary carcinoma

with hematoporphyrin di — ethers ев

Sentitizer s. — Вг. J. Cancer, v.55(5), 1981, р. 483-6.

Тужилкова Т.Н. и др. Радиоэащитные свойства порйиринов. — Радиобиология, т.17, 1977, вып.2, с. 259-261.. . Авторское свидетельство СССР

В 1054353, кл. С 08 В 37/12, 1982. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪИГАТОВ НА

ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНОГО СЕФАРОЗК (57) Изобретение относится к получеИзобретение относится к получению конъвгатов биологически активных соедйнейий и аминозтилсефарозы, — которые могут быть использованы в медицине для Аоторадиационной терапии опухолей и для диагностики онкологических заболеваний.

Цель изобретения — получение водорастворимых конъвгатов, обладакицих радиозащитным действием и способно стью локализоваться в опухолевых, клетках.

2 нию конъвгатов биологически активных соединений и аминоэтилсеАарозы, которые могут быть использованы в медицине для фоторадиационной терапии опухолей и для диагностики онкологических заболеваний. Изобретение позволяет получить водорастворимые конъюгаты, обладающие радиозащитным действием и способностью локализоваться в опухолевых клетках за счет того, что производные порфиринов, выбранные иэ группы, содержащей ди-(глицил)-амидмезопорАирин IX, ди-(Аенилаланил)амидмезопорЬирин IX, ди-(аланил)амид-мезопорАирин IX, гематопорАирин и 1,3-диметоксиэтилгематопорйирин, ковалентно присоединяют к аминозтилсефарозе и полученный иммобилизованный лиганд нагревают в течение 1-3 ч при 75-80 С в О, 1-0,5 н. соляной кислоте, 50-80%-ной уксусной кислоте или в 0,1-0,3 н. растворе едкого натра, содержащем О, 1-О, 15 мас.% боргидрнда натрия. 3 табл.

1684289

Гель отделяют на пористом стеклянном фильтре, промывают смесьв ДМФА — вода (1:2, 1:1) (по 50 мл), водой (50 мл) и нагревают в течение ? ч при 75 С в 50 мл 50%-ной уксусной кислоты.

Полученный красный раствор упаривают несколько раз с водой для удаления

АсОН, остаток растворяют в 5 мл воды и лиофилизувт. Выход нодорастворимого 10 конъвгата 100 мг ° Здесь и н других примерах для определения содержания порфирина в конъвгате последний 1 (45 мг) нагревают н 5 мл 1 н. НС1

О в течение 2 ч. при 80 С и определяют поглощение полученного раствора при

547 и 590 нм, считая поглощение исходного порфирина (1): .. =500

А зо =113 °

Пример 1а. Осуществляют аналогично примеру 1,, лишь вместо 507.— ной АсОН используют 65% Ar0HI.

Пример 2. Ди-(фенилаланил)амид-мезопорфирин !Х-агароза.

Суспензию 86 мг (0,1 ммоль) ди(Фенилаланил)-амид--мезопорфирина

IX (II) в смеси i IÇ:6) ДМФА — вода„ содержащую 100 мг водорастворимого

ЭДК, перемешивают 16 ч при 20 С с 10 мл аминоэтилсефарозы, поддерживая рН 5,5 с помощью 6 н. НС1. Гель промывают 100 мл смеси (?:1) ДМФА "вода, 100 мл воды, солюбилизируют

3 ч .при 80 С в 50 мл 0 1 н. IC1, лиоФилизуют и получают 140 мг водораст воримого конъюгата. Содержание порфи» рина в полученном конъюгате (0,2 мг/мг сухой массы) определяют спектфофотометрически, принимая поглощение порфирина (II): А =э10; А о =144.

Пример 2а. Осуществляют ана— логично примеру 2, нс вместо О, 1 н.

НС1 используют 0,3 í. НС1

Пример 3. Ди-(аланил)-амидмезопорфирин IX-агароза.

Раствор 70,8 мг (О, t ммоль) ди(аланил)-амид-мезопорфирина IX (Ш) в 15 мл ДМФА смешивают с 5 мл ьодного раствора 100 мг ЭДК и 7 ип . аминоэтилсефарозы. Суспензию перемешивают 2,5 ч при 20 С (pH 4,7-5,0) ° гель отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл смеси (1:1) ДМФАвода, 100 мл смеси: (2:1) ДИФА— вода и окончательно водой .(200 мл) до отсутствия порфирина н промывных водах (контроль по поглощению при

400 нм). Яркоокрашенный гель солюби:лизируют 1 ч при 75 С в 60 мл 0,5 н °

НС1, лиойилизувт и получают 120 мг нодорастворимого конъюгата, содержащего 0,10 мг (III) на 1 мг сухой массы конъвгата спектрофотометрический

1д/О метод для порфириня (!!1): А&17=

=500 А =138

Пример За (см. табл.1) .

Пример 4. Гематопорфиринагароэа.

Раствор 67,1 мг (0,1 ммоль) гематопорфирина (IV) в 10 мл ДМФА добавляют порциями за 3 раза к суспензии

10 мл аминоэтилсефарозы н 12 мл воды и одновременно добавляют 100 мл твердого ЭДК, поддерживая рН 4,7-5 (с помощью 0 1 н ИаОН) смесь перемешивают 2 ч при 20 С и через 16 ч при о

0 С гель фильтруют, промывают до отсутствия порфирина в.промывных водах смесями ДМФА — вода (1:1 — 1:2) по 50 мл и окончательно водой (100 мл). Твердый остаток солюбилизируют 2 ч при 75 С н 100 мл 0 1 н.

Na0H, содержащем О, 1%-ную NaBY+. Полученный раствор диализувт против

2 л дистиллированной воды в течение

16 ч и лиофилизувт. Выход водорастворимого конъюгата 80 мг. Содержание гематопорфирина (IV) 0,1 мг/кг сухой массы, считая поглощение порфирина

Пример 4а. Осуществляют аналогично примеру 4 (измерения см. в табл. 1) .

Пример 4б. Гематопорфиринагароза.

Методом, описанным н примерах 4 и 4а, из 67,1 мг (0,1 ммоль) гематопорфирина (IV) и 10 мл аминоэтилсефарозы получили окрашенный гель, для солюбилизации которого (после удаления несвязаншегося (IV) промыванием геля) использовали 100 мл 0,5 н.

Na0H в присутствии 0,2%-ной NaBH<.

Полученный красный раствор диализовали 16 ч против 2 л дистиллированной воды и лиофилизонали. Выход водорастворимого конъюгата 70 мл, а содержание гематопорфирина 0,06 мг/мг сухой массы (метс ц анализа по примеру 4).

Пример 5. 1,3-Диметоксиэтилгематопорфирин-агароза (V).

К суспензии 10 мл аминоэтилсефаро« зы в 15 мл воды добавляют за 3 раза раствор 70 мг (0,1 ммоль) 1,3-диметоксиэтил-гематопорфирина (Ч) в 10 мл

ДИФА и твердый ЭДК (150 мг), поддерживая рН 4,7-.5 0 с помощью 0 1 н.

4289

40

Ъ

5 168

NaOH. Суспензию перемешивают 2 ч при

- 20 С и 16 ч при 0 С, фильтруют, гель на фильтре проминают смесью

ДМФА — вода (1,5:1) до отсутствия поглощения при 400 нм н фильтрате (100 мл) и водой, солюбилизируют 2 ч при 75 0 в 50 мл О, 1 н. НС1. Выход водорастворимого конъюгата 100 мг, содержание порфирина (V) 0,2 мг/1 мг сухой массы конъюгата поинимая поглорение порфирина (V): А =243,5, А"„,=90.

П р и и е р 5а. Осуществляют аналогично примеру 5 (изменения си. в табл. 1) .

Пример 6. Ди-(фенилаланил)амид-иезопорфирин IX-агароза.

Раствор 7 мл упакованного объема аминоэтилсефарозы н 20 мл ДМФА обрао батынают 2 ч при 20 С раствором 40 мг (0,05 имоль) ди-(фенилаланил)-амидамезопорфирина IX в 30 мл ДМФА, в присутствии пиридина добавляют порцияии 1 r твердого дициклогексилкарбодиимида и через 10 ч при 20 С смесь концентрируют до 20 мл, фильтруют и фильтрат хроматографируют на колонке с сефадексом С-25, уравновешенной

ДМФА, окрашенную фракцию, выходящую с исключающимся объемом, упаривают досуха, остаток солюбилизируют 2 ч при 75ОС в 40 мл 80/-ной уксусной кислоты, диализуют против воды и лиофилизуют. Выход конъюгата 60 мг. Содержание порфирина 0,2 мг/мг сухой массы (см. пример 2).

Пример 7. "Холостой" опыт (s. отсутствие конденсирующего агентаЭДК) .

Суспензию 10 мл аииноэтилсефарозы в 15 мл воды перемешивают 2 ч при 20 С 16 ч при 0 С с раствором

70 иг 1,3-диметоксигематопорфирина (V) в 10 ип ДМФА (рН 4,7-5,0). Далее, как описано в примере 5, гель промывают на стеклянном фильтре смесью

ДМФА — вода (1,5: 1) до отсутствия поглощения при 400 нм.в фильтрате (100 мл), затеи водой (200 мл).

Фильтрат упаринают, сушат и выделяют

69,5 мг исходного порфирина (V). Остаицийся на фильтре гель бесцветный.

Наличие ковалентных- связей биологически активного вещества с полисахаридиым носителем доказано следующими фактами:

1) при проведении холостого опыта (пример 7) отсутствует порфирии на полисахариде при осущестнлеш н реакции присоединения без конденсирующегй агента — ЭЦК; 2) при гельхроматографии на сефадексе С 25 окрашенный конъюгят выходит с колонки с HcKJIIA чающимся объемом (пример 6); 3) при центрифугиронании образцов всех коньюгатон н пробирках через меибранный фильтр, пропускающий вещества с молекулярной массой менее 10 кДа, проходит менее 10Я нанесенного образца конъюгата.

Пример 8. Ди-(глицил)-амидмезопорфирин IX-агароза.

Полученный в примере 1 ярко-красный гель (условия конденсации и количества исходного порфирина (I) и аминоэтилсефарозы те же, что и в примере 1) нагревают t ч при 75 С в 50 ил

65Х-ной уксусной кислоты, упаринают несколько раз с водой для удаления уксусной кислоты, остаток растворяют в 5 мл воды и лиофилизуют. Выход водорастворииого конъюгата 100 мг, содержание порфирина 9,5 мг (определено по примеру 1).

Пример 9. Ди-фенилаланил)амид-мезопорфирин IX-агароэа.

Методом, описанным в примере 2, из 86 мг порфирина (II) и 10 мл аминоэтилсефарозы получают окрашенный в красный цвет гель, который солюбилнзируют 2 ч при 80"С в 50 .ип 0,3 н, 35

НС1 лиофилизуют и получают 130 мг водорастворимого конъюгата, содержащего 14 мг (II) исходного порфирина (спектрофотометрический метод анализа как в примере 2).

Пример 10 (ср.). Ди-(аланил)амид-мезопорфирин IX-агароза.

Из 70,8 мг ди-(аланил)-аиид-Mesoпорфирина (III) и 7 мл аииноэтилсефа45 розы методом, описанным в примере 3, получают красный гель; для солюбилизации которого используют 50 ил 0,5 н.

НС1 (нагревание 3 ч при 85 С). Солюбилизированный продукт лиофилизуют, ра5О створяют в 10 ил воды, выпавший красный осадок отщепившегося от полисахаридного носителя порфирина отделяют на фильтре, фильтрат диализуют против

1,5 л дистиллированной воды (16 ч)

55 и снова лиофилизуют Выход Водораство римого продукта 80 иг, содержание исходного порфирина (III) 7,5 иг.

Пример 11. Геиатопорфиринагароза. 1684289

Раствор 67,1 мг (О, 1 ммоль) гемаs îïîðôèðHHà (IV) в 10 мл диметилформамида (ДМ@А) постепенно добавляют к суспензии 10 мл аминоэтилсефарозы в

12 мл воды, одновременно добавляют

100 мг твердого ЭДК (рН 4,„7-5,0) с помощью 0,1 н. NaOH смесь перемешивают 2 ч при 20 С и 16 ч при O С, гель фильтруют, промывают до отсутст- 1 вия порфирина в промывных водах смесямн ДМФА — вода (1:1) и (1:2) "(по

50 мл) и окончательно водой (100 мл),, Твердый остаток нагревают 2 ч при -, 75 С в 100 мл О, 1 н. NaOH, содержаще«-, го 0,15%-ной NaBHg„ Полученный красный раствор диализуют против 2 л дистиллированной воды (16 ч) и лиофилизуют, Выход водорастворимого конъюгата

75 мг, содержание иматопорфирина (IV)

7,6 мг (спектрофотометрическое опре-. деление).

Пример 12(ср.) 1,3-Диметоксиэтилгематопорфирин-агароза.

Методом, описанным в примере 5, Hs 70 мг 1,3-диметоксиэтилгематопорфирина (Ч) и 10 мл аминоэтилсефарозы получают гель, который при нагревании в 50 мл 0,1 н. НС6 за 0,5 ч при 77 С растворился не полностЬю, красный фильтрат лиофилизуют и получают 60 мг конъюгата, содержащего. 0,15 мг исход" ного порфирина (Ч) на 1 мг сухой массы конъюгата.

Данные примеров приведенй в табл.1. 35

В табл.2 представлены результаты изучения токсических свойств получае« мых конъюгатов. Из табл.2 видно, что полученные соединения относятся ,40 к группе низкотоксичных веществ.

Радиозащитное действие полученных соединений были изучены п ч Сго.

Эксперименты in vit.ro проводили на асинхронной культуре клеток сердца обезьяны циномольгус (СОЦ), выживае-мость клеток оценивали по методике

Пака и Маркуса. Порфирины и ДНК в

_#_.åòoêñè÷íûõ для интактных клеток дозах вносили в инкубационную среду через 3-5 мин после облучения на рентгеновской установке РУМ-7 в дозе

4 г при мощности дозы 0,4 г/мин и фильтре 0,47 мм Al.

Из табл.3 видно, что лечебное действие ди-(фенилаланил)-ажщмезопорфирина IX-агароза, гематопорфиринаагароза и 1,3-диметоксиэтилгематопорфирин-агароза сопоставимо с терапевтическим действием некоторых биополимеров, таких как ДНК и РНК, но отличается от них стабильностью результа- тов, а также близки по значению с ранее изученным биологически активным порфирином-днкалиевой солью 2,4 ди(ф -метоксиэтил)дейтеропорфирина-ХХ, Формула и з о б р е т е н и я

Способ получения конъюгатов на основе производного сефарозы, включающий ковалентное присоединение лигандов к производному сефарозы с последуницей химической модификацией иммобилизованного лиганда, о т л и ч а— ю шийся тем, что, с целью получения водорастворимых конъюгатов, обладающих радиозащитным действием и способностью локализоваться в опухолевых клетках, в качестве лигандов используют производные порфирина, выбранные из группы, включающей ди(глицил)-амид-мезопорфирин IX, ди(фенилаланил)амид-мезопорфирин IX, ди-(аланил)-амид-мезопорфирин IX, гематопорфирин и 1,3-диметоксиэтилгематопорфирин, в качестве производного сефарозы — аминоэтилсефарозу, а химическую модификацию осуществляют нагреванием иммобилизованного лиганда в течение 1-3 ч при 75-80 С в О, 10,5 н. соляной кислоте или в 50-80%ной уксусной кислоте, или в О, 1-0,3 н. растворе едкого натра, содержащем

О, 1-0, 15 мас.% боргидрида натрия.

1684289

Таблица!

Выход водо- растворимого

Время, конъшгата ч мг

Содержание лиганда, мгlмг сухой массы конъюусловия солюбилизации

Соединение

Рвстворнтель Температура, С гата

Ди-(глицил)-амид-мезопорфирин IX-вгарозв

То же

Дн-(фенилаланил)-вмидмеэопорфирин IX-агврозв

Ди-(фенилаланил)-амидмезопорфирин IX-агарозв

Ди-(влепил)-амид-мезопорфирнн IX- àãàðîçà

То же

Гемвтопорфирин-erepose

0,1

0,1!

100

50Х-ная АсОН

65Х-ная АсОН

1а

8() 140

0,1

0,1 н. НСI

2а

0,f

130

0,3 и. HCI 8() 0,1

0,075

Ое!!

Зв(ср. )

0,1

4а To ae

4б

0,06

80

1,3-Диметоксиэтил-гемвтопорфирин-вгароэа

То же

Ди-(фенилвлвнил)-амидмезопорфирин IX-агарозв

Ди-(глицил)-амид-мезопор" фирин 1Х-erвpoэа

Ди-(фенилвлвиил)-вмидмеэопорфирин IX-агароза

Ди-(влвнил)-амид-меэопорфирин 1Х-вгврозв

Гематопорфирин-агароза

0,2

0,15

2 100

05 60

0,1 и. HCI

0,1 н. НСI

5а

0,2

80Х-вая АсОН 75

65Х-ная АсОН 75

0,095

100

130

0,3 н. HCI

0,1

10 (ср.)

0,5 н. НСI

0,3 н, КвОН +

+0, 15Х,-ная

МвВН!

0,075

0,1

4+

12 1,3-Диметоксизтил-гемато(ср.) порфирии-вгвроэа

0,5 50

0,1 н. НСI

0,15

Ф

Разрушение носителя до низкомолекулярных компонентов и отщепление лиганда

++Существенное снижение выхода целевого продукта

". Запредельное значение параметра загрузки реагентов s примерах серии "а" и "б" аналогичны загрузкам в основных примерах, Таблица2

Цитотоксичность порфиринов на культуре клеток

СОЦ

Токсичность, ммоль

СД„

Соединение

СЛ84, Ди- (фенилаланил)-амидмезопорфирин IXагароэа

Гематопорфиринагароза

4, 6 ° 10-s

79 1 ° 10-э

2 6.10-г

2,5 ° 10

0,5 í. НС!

0,5 на НСI

О,! í. NaOH+

+0,1Х-нвя

ИвВН4

О,! н. НаОН+

+0 f5X-ная

Навн1

0,5 н. NOH +

+0,2Х"ная

НаВН, 12

1684289

Продолжение табл. 2, Соединение

Токсичность, ммоль

СД«

1,".3-Диме ток сиэ тилгематопорфирин-агароза

Дикалиевая соль

2,4-ди-(К.-метоксиэтил)дейтеропорфирина- (Х

1, 3, 5, 8-тетраметил2,4-диэтил-6,7-ди(диметилпропиламмоний)-порфириндиметансульфонат

3,2 l0

1,8 10-

3 8 10

1;9 101

3,6 10"г

1,6 10-г

СОЦ ". сердце обезьян циномольгус.

Таблица 3

Радиозащитное действие конъюгатов на культуре клеток СОЦ

Эффективная доза соединения, ммоль/мл

Противолучевая эффективность, Ж

Соединение

ПРД при ЛД

Ди-(фенилаланил)-амидмезопорфирин IX-агароза

Гематопорфиринагароза

1,3-Диметоксиэтилгематопорфиринагароза

ДНК

Дикалиевая соль 2,4ди-(OL--метоксиэтил)— дейтеропорфирина-IX

52,3+ 3,9

Ф

62,7+ 7,4

1 ° 10

1,3 ° 10

1,8 ° 10. 49, 7+ S 2

0,1 мг/мл 53,4+3,4

1 10

67,3 «3 9

Различия с контролем при P = 0,05 достоверны.

Составитель О.Рокачевская

Редактор М.Келемеш Техред N,Äèäûê Корректор M.éàðîøè

Заказ 3483 Тираж Подписное

ГгНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035„ Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент", r.Óæãoðîä, ул. Гагарина,101