Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus.мusсulus l. - продуцент моноклональных антител к тиреотропному гормону человека

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и м.б. использовано для количественного определения тиреотропного гормона человека (ТТГ) методами иммуноанализов . Цель изобретения - получение штамма гибридомных клеток мыши, продуцирующего монАТ, специфичные к ТТГ и не дающие перекрестных реакций с другими гормонами гипофиза: ФСГ, ЛГ, СТГ и ХГЧ. Отбор монАТ на специфичность проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа. Штамм культивируют в среде RPMI 1640 с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы, 2тМ L-глутамина и 5-10 М 2-меркаптоэтанола. Штамм прививается в брюшную полость сингенных мышей в виде асцитных опухолей. МонАТ принадлежат к субклассу IgGI. Очищенные монАТ используют в качестве 1-го слоя на твердой фазе и ИФА на ТТГ. В качестве 2-х антител (сверху) используют антисыворотку кролика против ТТГ. Такая тест-система позволяет определять ТТГ в диапазоне 0,4-50 мМЕ/мл. Штамм депонирован под № ВСКК (П)366Д. (А С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР фЯЯЩВЛ ) <<> >Р "Я

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4784570/13 (22) 30.11.89 (46) 23.10.91. Бюл, № 39 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт "Биотехнология" (72) P.Ã.Âàñèëîâ, И.Ю.Втюрина и К.Ю.Вайль (53) 578.085.23 (088.8) (56) Benkirane М., Воп О. Characterisatlon of

mA8-s against human thyrotropin and use ln

an Immunoradiometric assay and

immunohi s toe hemi s try. = М.: J o urn a I of

1пипцпо!оц!са! Metkods, 98 (1987), р. 173—

181. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХХ КЛ ЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS.

MUSCULUS L, — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ТЙРЕОТРОПНОМУ

ГОРМОНУ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и м.б. использовано для количественного определения тиреотропного гормона человека (ТТГ)методами имИзобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для количественного определения тиреотропного гормона (ТТГ) человека методами иммуноанализов.

Цель изобретения — получение штамма, продуцирующего монАТ, не уступающие по специфичности прототипу.

Штамм Т-7, ¹ ВСКК(П) 366(Д) получают следующим образом.

Гибридому получают путем слияния спленоцитов мышей, иммунизированных человеческим ТТГ с миеломными клетками

„„. Ж„„1685997 А1 (я)5 С 12 N 5/20, С 12 P 21/08 муноаналиэов, Цель изобретения — получение штамма гибридомных клеток мыши, продуцирующего монАТ, специфичные к

ТТГ и не дающие перекрестных реакций с другими гормонами гипофиза; ФСГ, ЛГ, СТГ и ХГЧ. Отбор монАТ на специфичность проводили методом твердофаэного иммуноферментного анализа. Штамм культивируют в среде RPMI 1640 с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы, 2mM L-глутамина и 5.10 М 2-меркаптоэтанола. Штамм прививается в брюшную полость сингенных мышей в виде асцитных опухолей. МонАТ принадлежат к субклассу lgGI. Очищенные монАТ используют в качестве 1-ro слоя на твердой фазе и ИФА на ТТГ. В качестве 2-х антител (сверху) используют антисыворотку кролика против ТТГ. Такая тест-система позволяет определять ТТГ в диапазоне 0,4-50 мМЕ/мл. Штамм депонирован под ¹ ВСКК (П) 366Д. линии Х63 Ag8653 мыши, Для иммунизации используют самок линии BA1B/с. Иммунизация осуществляется путем трехкратного введения в брюшную полость с интервалом в 13 дней нитроцеллюлозного фильтра с нанесенным ТТГ в количестве 0,5 мкг. Контроль эа ходом иммунизации осуществляют путем отбора крови и проверки наличия антител с ТТГ с помощью И ФА. Гибридизацию клеток проводят с помощью ПЭГ(м,в. 4000):

Соотношение спленоцитов и миеломных .клеток 5:1. После слияния клетки переносят в селективную среду ГАТ (гипоксантин-ами1685997 ноптеринтимидин) и культивируют до появления клонов в полной среде RPMI 1640, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки и 5% оленьей сыворотки, 2 мМ

L-глутамина, 5x10 M 2-меркаптоэтанола, -5

10 М гипоксантина,4х 10 M аминоптери-7 на и 1,6x10 M тимидина.

Специфичность гибридомных антител определяют методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

Для проведения ИФА 96-луночные пластины для микротитрования из попивинилхлорида (ПВХ) покрывают растворами гормонов ТТГ, фолликулостимулирующим (ФСГ), лютенизирую цим (Jl Г), соматотропHblM (СТГ) и хориогонадотропным (ХГ) B карбонатно-бикарбонатном буфере 0,05 М, рН

9,6, по 50 мкл на лунку и инкубируют в течение ночи при 4 С или при 37 С 1 ч. Затем лунки пластин блокируют 0,5/,-ным раствором желатина в ЗФР при 37 С в течение 40 мин с последук)щим промыванием раствором ЗФР 0,05% твин-20. Супернатанты гибридомных культур вносят в лунки пластин, покрытых гормонами. В качестве положительного контроля используют мышиную антисыворотку (разведение

1:10000), а в качестве отрицательного — супернатант миеломы РЗ-Х63, А98653, После инкубации в течение 1 ч при 37 С пластины трижды промывают ЗФР/твин-20 и добавляют высокоспецифические антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, и инкубируют пластины еще 40 мин при 37 С, После трехкратного промывания пластин

ЗФ Р/твин-20 в лунки добавляют 0,04 -ный раствор о-фенилендиамина в 0,2 М фосфатно-цитратном буфере рН 5,0 с добавлением, 0,012 -ной перекиси водорода. После по,явления окраски в лунках реакцию останав ливаЮт раствором 2н, серной кислоты, Спектрофотометрическое определение реакции проводят при 492 нм, Из результатов следует, что монАТ Т-7 специфичны только к ти еотропному гормону, Культуры гибридом, в супернатантах которых обнаружены антитела против ТТГ, не реагирующие с

ФСГ, ХГЧб, СТГ и ЛГ человека, клонируют методом предельных разведений из расчета

0,3 клетки на лунку в среде RPMI 1640 с 10 эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина,5x10 5 M 2-меркаптоэтанола в присутствии гипоксантина (10 " М) и тимидина, (1,6х10 М).

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Купьтуральные свойства. Клетки культивируют в монослое в концентрации 5х10

10 кл/мл, время субкультивирования около

48 ч.

Криоконсервирование, Криоконсервирование гибридомы Т-7 проводят в ЭТС, содержащей 15% 0МСО. Первые 3 сут ампулы с клетками хранят при -70 С, затем переносят в жидкий азот. Жизнеспособность гибридом оценивают путем подсчета клеток при окрашивании их 0,50 -ным раствором трипанового синего. Жизнеспособность около 80%.

Характеристика моноклональных антител, Изотип тяжелой и легкой цепи определяют методом прямого иммуноферментного анализа с использованием в качестве проявляющих агентов коньюгатов изотипспецифических антител. МонАТ серии Т- 1 имеют легкие цепи типа К, изотип тяжелой цепи — гамма 1. Штамм способен расти в организме сингенных мышей в виде асцитной опухоли, Для производства асцитов мышей линии BALB/с с самок 12-14-недельного возраста примируют пристаном по 0,5 мл внутрибрюшинно за 10 дней до прививки им клеток гибридом, Клетки гибридом, отмытые средой RPMI 1640, вводят внутрибрюшинно по 2х10 клеток на мышь, Время

-6 образования асцитов 14 — 20 дн, концентрация монАТ 2 — 10 мг/мл.

Выделение моноклональных антител проводят из асцитной жидкости с помощью фракционирования сульфатом аммония и последующей хроматографии на DEAE-целлюлозе, Гомогенность выделенных моноклональных антител проверяют с помощью электрофореэа в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Для доказател ьства моно клональной природы антител применяют метод аналитического изоэлектрофокусирования в тонком слое полиакриламидного геля. Установлено, что все антитела серии Т-7 являются продуктами отдельных клонов клеток и выделяются на электрофореграммах в виде набора близко расположенных полос с изоэлектрическими точками в диапазонах рН 6,7 — 8,0.

Полученный штамм гибридных культивируемых клеток Т-7 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номе-, ром ВСКК(П) 366Д.

Пример. Определение ТТГ человека с помощью монАТ Т-7, Моноклональные антитела T-7 сорбируют на микротитроpBflbHblx плейтах в дистиллированной воде

1685997

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток М ВСКК 366Д животных Mus.musculus 1 .— продуцент моноклональных антител к тиреотропному гормону человека.

Составитель Г.Игнатьева

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Т.Малец

Редактор .И. Шмакова

Заказ 3576 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

% (рН 4,7) с концентрацией 40 мкгlмл, Затем в лунки вносят по 100 мл 3 Ф Р, содержащего

0,57ь желатина, и инкубируют 1 ч при 37 С.

Затем в лунки вносят по 50 мл стандартов, содержащих известное количество ТТГ(100, 50 и 25 мМЕ/мл). После инкубации в течение

1 ч в лунки вносят по 50 мл кроличьих поликлональных антител, специфичных к ТТГ человека, в 0,2 -ном растворе

ЗФР/желатина в концентрации 10 мкг/мл и инкубируют 1 ч при 37 С. Затем в лунки добавляют конъюгат высокоспецифических антител козла к иммуноглобулинам кролика с пероксидазой хрена в 0,2 -ном растворе желатина в ЗФР. Пластины инкубируют

40 мин и добавляют субстрат для ферментативной реакции (о-фенилендиамин в фосфатцитратном буфере, содержащем 0,012 перекиси водорода), После развития окраски (20 мин при 20 С) реакцию останавливают путем добавления в лунки 2N раствора серной кислоты. Оценку реакции проводят с помощью спектрофотометра с вертикаль5 ным лучом при 492 нм, По полученным значениям оптической плотности построены калибровочные кривые. Аффинность монАТ оказалась достаточной для создания иммуноферментной тест-системы для опре10 деления концентрации ТТГ в диапазоне

0,4 — 50 мМЕ/мл в биологических жидкостях человека.