Способ получения иммобилизованной липазы

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к способу получения иммобилизованной липазы, и может найти применение в пищевой, легкой и химической отраслях промышленности. Цель изобретения - повышение активности целевого продукта. Способ заключается в обработке полиамидного носителя - капрона бифункциональным агентом, несущим изоцианатные группы, а именно 2,4-толуолдиизоцианатом

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)э С 12 N 11/08, 9/18

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4648987/13 (22) 09.02.89 (46) 07.12.91. Бюл. N. 45 (71) Институт микробиологии АН УЗССР (72) К.Д, Давранов, А.С. Саттаров и M.ß. Табак (53) 577.15(088.8) (56) Рахимов М.М, и др. Доклады АН СССР, 1976, т. 229, М 6, с. 1486.

Авторское свидетельство СССР (Ф 883173, кл. С 12 N 11/08, 1981. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЛИПАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения иммобилиэованной липазы, и может найти применение в пищевой, легкой и химической отраслях промышленности. Цель изоИзобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению иммобилизованных ферментных препаратов, в частности к способам получения иммобилизованной липазы, и может найти применение в пищевой, легкой и химической промышленностях.

Известен способ получения иммобилизованной липазы, включающий обработку полиамидного носителя бифункциональными реагентами, в качестве которых используют глутаровый альдегид или госсипол.

Обработку носителя глутаровым альдф-. гидом проводят при рН 8,5 в течение 1 ч, а Ы 1696475 А1 бретения — повышение активности целевого продукта. Способ заключается в обработке полиамидного носителя — капрона бифункциональным агентом, несущим изоцианатные группы, а именно 2,4-толуолдииэоцианатом (1-2 мг на 1 r носителя) в нейтральной или слабощелочной среде с последующим присоединением остатков.пальмитиновой кислоты в количестве 20 — 30 мл на 1 г носителя и связыванием липазы с полученным носителем.

При этом получается препарат иммобилизованной липазы с удельной активностью 4248 ед, что в 2 раза превышает активность препарата, полученного известным способом. Иммобилизованная липаза может быть использована для гидролиза природных липидов с целью получения ди-, моноглицеридов и свободных жирных кислот. 1 табл. связывание с ферментом при 4 С в течение

12 ч j1).

Недостатками способа является низкая . с удельная активность целевого продукта (0,8 (Jl

- ед. на 1 r носителя) и невысокая стабильность (врвмя пояуинвктиввции 2,5 ч при: ) ь

50 С).

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ иммобилизации липазы на полиамидном носителе с использованием в качестве бифункционального сшивающего реагента госсипола. Согласно известному способу обработку носителя

1696475 госсиполом проводят при 45-80 С и рН 8,0-.

9 5 в течение 1 — 5 ч, а связывание фермента с носителем осуществляют при 0-16 С (2).

Однако известный способ характеризуется недостаточно высокой активностью и термостабильностью получаемого продукта.

Достигаемая удельная активность 14 ед./r носителя (субстрат-хлопковое масло), соотношение активности иммобилизованного и растворимого ферментов составляет 0,175, 10 а время полуинактиваци и при 50 С составляет 3,5 ч.

Целью изобретения является повышение активности целевого продукта.

Согласно способу получения иммобилизованной липазы, предусматривающему обработку полиамидного носителя бифункциональным реагентом, несущим изоцианатные группы в нейтральной или слабощелочной среде, и последующее связывание липазы с модифицированным носителем, в качестве бифункционального реагента используют 2,4-толуолдиизоцианат в количестве 1 — 2 мг на 1 г носителя, а после обработки бифункциональным peclгентом проводят модификацию носителя пальмитиновой кислотой, устанавливая соотношение 20 — 30 мл пальмитиновой кислоты на 1 r носителя.

Использование предлагаемого способа позволяет увеличить удельную активность целевого продукта в 3,0-3,4 раза (от 14 до

42-48 ед,/мг носителя).

Пример 1. 1 г порошкообразного полиамида обрабатывают 4 н. HO (100 мл) при 40 С в течение 2 ч, затем промывают трижды бидистиллирова н ной водой (по 500 мл), Осадок полиамида отделяют декантацией или центрифугированием (5 мин, 2000 об/мин). Затем суспендируют в 10 мл диоксана и прибавляют 1 мг 2,4-толуолдиизоцианата, 3 капли триэтиламина. и смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при

20 — 25 С, затем полиамид отфильтровывают, промывают на фильтре диоксаном и смешивают с 20 мл суспензии пальмитиновой кислоты в диоксане, прибавляют несколько капель триэтиламина и смесь медленно перемешивают в течение 5 ч при

80 С. Носитель промывают суспензией пальмитиновой кислоты, ацетоном (Зх100 мл) и.0,005 М фосфатным буфером (рН 7,8) до полного исчезновения ацетона.

Для присоединения фермента к модифицированному таким образом полиамидному носителю к его суспензии в 0,005 М

55 фосфэтном буфере (рМ 7,8) добавляют 20 мл раствора липаэы с концентрацией белка

4 мг/мл и инкубируют в течение 6 ч при

40С. Полученный целевой продукт промывают 0,1 М фосфатным буфером и активность фермента измеряют по его способности расщеплять хлопковое или оливковое масло. Удельная активность препарата 42.0 ед./г носителя, Пример 2, Все операции проводят по примеру 1, но используют 25 мл пэльмитиновой кислоты. Удельная активность 48,0 ед./r носителя.

Пример ы 3-7. Способ осуществляют по примеру 1, варьируя количеством добавленной пальмитиновой кислоты (1-3,7 мл) или 2,4-толуол-диизоцианата (4-6 мл).

Данные исследования приведены в таблице.

Из данных таблицы следует, что полржительный эффект дбстигается при добавлении 20-30 мл пальмитиновой кислоты, Понижение концентрации пальтиминовой кислоты приводит к снижению активности целевого проудкта, а повышение ее концентрации нецелесообразно из-эа увеличения расхода реагента без влияния на активность. Оптимальные концентрации бифункционального реагента 1-2 мг на 1 г носителя.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет значительно увеличить удельную активность целевого. продукта с 14 до 42-48 ед./г носителя (т,е. в

3,0 — 3,4 раза), а также несколько увеличить стабильность иммобилизованной липазы (время полуинактивации при 50 С возрастает с 3,5 до 6,0 ч).

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованной липазы, предусматривающий обработку полиамидного носителя бифункциональным реагентом, несущим изоцианатные группы, в нейтральной или слабощелочной среде и последующее связывание липаэы с модифицировзнным носителем, о т л и ч а ю щ и йс a тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве бифункционального реагента используют 2,4-толуолдииэоцианат в количестве 1-2 мг на 1 r носителя, а после обработки бифункциональным реагентом проводят модификацию носителя пальмитиновой кислоты, устанавливая соотношение 20-30 мл пальмитиновой кислоты на 1 r носителя.

1696475

Способ иммобилизации

Сшивакиций реа" гент

Количество реагента, мг/г

Предла гаемый

42,0

2;4«Толуол-диизоцианат

То же

6,0

«11»

«1l

«11»

«I I»

«н»

Известный Госсипол

Составитель В. Муронец

Техред М.Моргентал Корректор М. Демчик

Редактор И. Дербак

Заказ 4276 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

3

5

1

0,5

3

Количество пальмитиновой кисло-. ты, мл

- -r

Удельная активность, Е /г носитегя

48,0

46,0

18,0

47,0

47,0

23,0

14,0

Елея полуина ктива ции при 50", ч

6,0

6,0

4,7

6,0

6,0

5,5

3,5